Usher综合征（USH）是一种以先天性感音神经性聋和视觉功能进行性丧失为特征的遗传性疾病，具有高度的遗传异质性及临床异质性，目前尚无有效的预防和治愈方法。目前已知USH有14个致病基因，USH2A突变是其最常见的原因。随着对USH2A基因研究的深入，USH2A致病机制、动物模型建立、临床诊断以及基于基因治疗、细胞移植和RNA剪接的治疗等方面研究皆取得了巨大进展。如，USH2A的突变导致参与外周纤毛区运输功能的USH复合体蛋白产生缺陷；基于此致病机制的小鼠及斑马鱼动物模型被建立，但存在其各自局限性；通过成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9系统对患者来源诱导多功能干细胞进行纠正后，将其诱导为视器官以进行临床的功能纠正性移植和基于反义寡核苷酸的RNA剪接治疗在此病的治疗中属于前景性研究。
引用本文： 孟祥, 郭彤, 杨丽萍. Usher综合征与USH2A基因的研究进展. 中华眼底病杂志, 2020, 36(3): 236-241. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20190123-00028 复制
Usher综合征（USH）又称遗传性耳聋-视网膜色素变性（RP）综合征，是一种以先天性感音神经性聋和视觉功能进行性丧失为特征的遗传性疾病，伴或不伴有前庭功能障碍。其遗传方式为常染色体隐性遗传[1]。USH分为3种类型。Ⅰ型（USH1）为先天性双侧重度感音神经性耳聋（SNHL），前庭反应消失，青少年时期出现RP；Ⅱ型（USH2）为中重度SNHL，前庭反应正常，RP发生较晚；Ⅲ型（USH3）为进行性SNHL，前庭反应不确定，RP发生时间不确定。其中USH1最为严重，USH2最为常见[2]。研究表明，50%以上的USH患者和7%～23%的非综合征性RP患者携带USH2A基因突变[3-6]。现就USH2A基因在USH中的最新研究进展作一综述。
1 分子水平
USH2A基因位于人类染色体1q41，全长790 kb，由72个外显子组成，编码USH2A蛋白。USH2A蛋白包括异构体A和B。异构体A发现较早，相对分子质量171.5×103，由21个编码外显子翻译、4641个核苷酸编码以及异构体B的N端1546个氨基酸片段组成，包括1个层粘连蛋白样结构域（LamGL）、1个层粘连蛋白N-末端结构域（LamNT）、10个层粘连蛋白表皮生长因子样结构域（EGF-Lam）和2组Ⅲ型纤维连接蛋白结构域（FN3）重复序列，最常见于RPE细胞、光感受器细胞以及耳蜗、卵巢、输卵管、睾丸和肠等组织的基底膜结构域中，被认为是一种分泌性细胞外蛋白[7]。异构体B相对分子质量580.0×103，由15 609个核苷酸编码、5202个氨基酸组成，是一个包含很大胞外区域的跨膜蛋白。除了异构体A所包含的结构，异构体B还包括2个LamGL区域、28个FN3区域、1个跨膜序列以及1个胞内区，此胞内区c端有一个PDZ结合区域。异构体B主要分布于视网膜，在心脏及肾脏中也有表达，是视网膜中发挥主要作用的USH2A蛋白异构体[8]。有研究对USH2A基因外显子进行突变筛查，结果显示该基因上的突变占USH2患者的55%～90%[5, 9]。
在光感受器细胞内节顶部有一个包绕连接纤毛的领状结构，被称为外周纤毛区，其膜部参与囊泡运输[10]。所有已知的USH1、USH2蛋白被发现存在于此区域[11]。USH2A蛋白也不例外，被固定在内节胞膜上，胞外结构域突出在外周纤毛区的基质中[12]。在外周纤毛区与连接纤毛膜之间有主要由USH2蛋白复合体组成的纤维状连接，为外周纤毛区和连接纤毛提供结构支持，并可能参与光感受器细胞的发育，连接纤毛内节到外节囊泡物质的运输以及外节膜盘的构成和更新[13-14]。USH2蛋白复合体主要由USH2A蛋白胞外区域即USH2A 蛋白异构体B（USH2A编码）、ADGRV1蛋白胞外区域即ADGRV1b（USH2C编码）与whirlin蛋白（USH2D编码）3种USH2蛋白通过whirlin蛋白的 PDZ结构域与USH2A蛋白和ADGRV1蛋白的c端PDZ结合基序相互作用组成[15]。任何一种USH2蛋白的缺失功能效果等同于3种蛋白的缺失，导致USH2[13]。Dona等[16]提出，USH2A蛋白具有稳定另外两种蛋白的功能，其缺陷会使USH2复合体whirlin蛋白和ADGRV1蛋白在光感受器膜上的定位降低。随着PDZD7蛋白被发现作为修饰基因存在于USH2患者中，最近研究发现 PDZD7蛋白同样参与此蛋白复合物的构成，并倾向于与ADGRV1蛋白结合[17]；USH1蛋白SANS也可提供此功能复合物与微管运输之间的分子连接[10, 18]。除了外周纤毛区，一些研究者推论USH蛋白还存在于光感受器细胞突触上[19]。但目前没有光感受器细胞突触功能缺陷小鼠动物模型的成功建立，也缺乏确凿的证据证明USH2A蛋白存在于突触区域[12]。
最近有研究发现，存在一种由USH1蛋白SANS与USH2蛋白USH2A、whirlin组成的复合物即三元USH1/USH2复合物（ternary USH1/USH2 complex），可能参与外节高尔基体来源，经内节向纤毛的动力蛋白复合物运输[20]。USH蛋白之间可形成超分子USH蛋白复合物，但其作用机制仍不太清楚。可能还有更多的“功能性”蛋白质也被整合到这一USH复合物中，在共同的细胞机制中发挥作用。如，USH2A蛋白可通过中心小体上的中心体蛋白异构体B与导致Leber先天性黑矇的纤毛蛋白lebercilin连接，也可与胶原蛋白Ⅳ和纤连蛋白相互作用，这些都有可能参与此复合物的构成[21]。
2 基因型与临床表型
目前已知USH有14个致病基因，其中USH2A、ADGRV1（USH2C）、WHRN（USH2D）和PDZD7共4个基因参与了USH2的发病。PDZD7被认为是whirlin蛋白（USH2D编码）和harmonin蛋白（USH1C编码）的同源体，PDZD7突变可作为修饰基因加剧USH2A基因突变患者的视网膜变性，也可与ADGRV1一起导致双基因遗传USH的发生[22-23]。
目前发现有超过600个突变分布在USH2A基因上，包括无义突变、移码突变、剪接相关、错义突变及内含子区变异等（http://www.lovd.nl/USH2A）。其最常见的2个突变位点为C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），均位于13号外显子。其中，c.2299delG突变是最常见的，占15%～45%[24]，尤其常见于欧洲和美国；c.2276G＞T则是导致非综合征性RP中最常见的突变位点。但有研究发现，尽管是同一个基因上同一位点的突变，在某些患者中会导致USH，而在其他患者中则表现为非综合征性RP[5, 25]。有研究者认为，双等位基因截短缺陷最常导致USH的发生，而至少1个USH2A亚效等位基因的存在通常会导致非综合征RP的发生[26]。临床视力进展方面，USH2A患者的主观性视觉功能测验往往更差，非综合征性RP患者视网膜则残存视锥细胞的功能[27]。与之相反，也有研究发现，USH2A患者和非综合征性RP患者在视网膜疾病进展中并无明显差异[28]。这两种截然相反的结果可能是由于不同研究在对疾病的进展统计、跟踪时间以及兴趣基因型的差异造成的，此方面调查研究需要在统一标准下进行更大规模追踪比较。
USH2的特点为先天性中度SNHL，听力呈下降趋势，但进展缓慢。前庭功能正常，因为有部分听力，患者有语言锻炼学习的机会，语言发育正常，运动功能正常。该型患者大多在青春期前后（20～30岁）出现视力下降，视野缩小等RP的临床症状，可残存部分视力及视野。当怀疑USH时，应进行听力、前庭功能、视力、视野、ERG等检查。正如前文所述，USH2A主要与纤毛功能有关。除USH之外，纤毛功能异常亦可导致Bardet-biedl综合征、Joubert综合征、Senior-Loken综合征和某些形式的非综合征性RP[29]。有几种综合征可能表现出与USH相似的临床征象，应注意鉴别诊断。若伴有胰岛素抵抗、2型糖尿病、高甘油三酯血症、肝功能不全/肾功能衰竭等内分泌异常，则提示Alström综合征。若伴有肥胖、智力迟钝或认知障碍以及多指和生殖系统异常等症状，可能是Bardet-Biedl综合征的临床表现。若观察到X连锁遗传的家族史，或发现肌张力障碍或共济失调，则应怀疑莫尔-特纳布贾格综合征[2]。致病基因诊断有助于上述疾病的临床诊断。
3 实验动物模型
大多数USH基因敲除小鼠模型已被建立，但出现可观察到的视网膜变性的小鼠模型只有USH2A基因敲除小鼠[12]。Liu等[12]构建的USH2A基因敲除小鼠是唯一令人信服的USH疾病小鼠模型，其模型小鼠在20个月时，超过一半的光感受器细胞丢失，ERG a、b波振幅减弱。但也有学者认为，其构建的目的性USH2A敲除小鼠模型并不成功，因为此疾病模型发病年龄晚，仅表现为轻度视网膜变性。并且，该模型在被其他实验室使用时，出生后623 d才出现比较明显的视网膜形态变化[30]。这无法排除小鼠自身衰老因素影响，不具有说服力。另一种自发的突变小鼠模型昆明小鼠表现为自发性USH2A型，这个模型显示了一种快速的、早期的视网膜变性[31]。但因为其包含了已知在遗传性视网膜变性中存在的USH2A和PDE6B这2个基因突变，因此该模型也不具有典型代表性。更多更合适的USH动物模型需要被探索，或许人源化小鼠是可以考虑的一个方向。
USH小鼠疾病模型和患者疾病表型差异的原因尚不清楚，但推测其可能与人类和小鼠USH2A基因的突变位置、遗传背景、蛋白质补偿机制、寿命差异、非遗传因素影响以及诊断措施的敏感性等有关[32]。另外，在人类光感受器细胞中发现的USH1和USH2蛋白的花萼状突起和纤周膜在小鼠等啮齿类动物中发育不良也可能是原因之一[33]。不过，该结构在甲骨鱼等其他动物中发展得很好[34]。实验室斑马鱼、日本鳕鱼等甲骨鱼类因其完整的基因组序列草稿（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka）、后代多、光感受器细胞死亡发病早、蛋白质序列相似性高等特点成为研究USH的良好模型[35-36]。Dona等[16]利用成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）基因敲除技术，将斑马鱼生殖细胞中USH2A基因表达的蛋白质截短（USH2Armc1：c.2337_2342delinsAC，p.Cys780GlnfsTer32和USH2Ab1245：c.15520_15523delinsTG，p.Ala5174Ter），得到了第一个表现早期发生视网膜功能障碍的USH动物模型。值得注意的是，斑马鱼睫状体边缘区的类干细胞的存在，使其有能力再生包括光感受器细胞在内的主要视网膜细胞[37]。而人类则不具有此特点，因此斑马鱼的疾病模型在应用于USH时，这是值得注意的很大差异。
4 治疗
USH视网膜变性的治疗策略包括针对特定基因异常的基因治疗、细胞移植疗法、减缓光感受器细胞变性或凋亡的治疗如生长因子或钙阻滞剂的应用、维生素补充和内源性视锥细胞存活因子等[38]。基因治疗、细胞移植疗法和基于反义寡核苷酸（AON）的RNA剪接治疗被认为是非常有前景的治疗措施。
基因治疗为遗传性视网膜变性最具前途的治疗方法，主要包括基因替代治疗和基因编辑治疗。（1）基因替代治疗，通常用病毒载体传递目的基因，到达靶细胞后经过转录，翻译产生蛋白产物。旨在补偿由于基因突变导致的内源性蛋白功能的缺失[39]。由于USH2A基因太大，因此不适于整个基因的替代治疗。（2）基因编辑治疗，即在DNA水平上纠正基因突变的编辑策略。国际范围内，2017年12月20日美国食品和药物管理局（FDA）批准了RPE65基因替代治疗药物（商品名Luxturna）用于治疗RPE65基因突变导致的Leber先天性黑矇2型。2018年12月1日，CRISPR/Cas9基因编辑治疗CEP290基因突变导致的Leber先天性黑矇10型的临床试验获得美国FDA批准，遗传性视网膜变性的基因治疗具有很好的发展前景。针对USH2A基因片段长度较大，载体容量仍是一个需要考虑的重要问题。腺相关病毒载体（AAV）是一种小型的、非致病性的单链DNA病毒，介导光感受器细胞、RPE细胞和RGC的有效、持续转染，广泛应用于遗传性视网膜变性的基因治疗。第一代AAV2载体表达相对较慢，容量较小（4.7 kb）[40]；替代血清型及自我互补载体、双AAV载体等的出现，为基因治疗提供了范围广泛、表达速度更快、趋向性更强、载体容量更大的选择[41]。但也有研究指出，有些载体传递目的基因的效果可能要差一些[42-43]。目前已有多项临床评估证实重组AAV载体治疗视网膜疾病具有很好的安全性和有效性[44-45]。这可能是未来载体选择的一个参考依据和发展方向。
有研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑方法针对携带c.2299delG纯合子突变的USH患者的成纤维细胞进行编辑，体外实现突变的成功修复[46]。最新已有研究团队针对USH2A基因最常见两个突变C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），利用CRISPR/spCas9系统设计sgRNA，通过HDR同源重组的方法，将患者来源细胞诱导的诱导多功能干细胞（iPSC）突变位点成功纠正，这将为后续临床治疗提供了很好的研究基础[47]。考虑到细胞移植治疗中，替换细胞携带致病突变与否、组织排斥等问题，可以移植前在患者来源的iPSCs上使用CRISPR/Cas9编辑系统进行基因定点修复，将修复过的iPSCs分化为RPE细胞或光感受器细胞后再移植到视网膜[48-50]。也有研究已成功构建移植了由iPSCs衍生的光感受器祖细胞的动物模型，移植后能与宿主双极细胞形成功能性突触，组织学和功能学上可部分恢复视觉功能[51]。但其价格成本、时间成本以及人类移植视觉功能有效性等方面，是临床试验之前需要被解决的问题。此外，利用CRISPR/Cas9技术修复突变后，RP动物模型的视觉功能可以恢复，这说明在体动物实验也是可靠的[52]。因此，CRISPR/Cas9技术在USH2A疾病治疗中是非常有前景的。
最近发现的深部内含子突变说明了USH中mRNA剪接突变这一致病机制的重要性[53-54]。USH2A基因的深部内含子突变（c.7595-2144A＞G）导致一个假外显子（PE40）插入到成熟的USH2A转录本中，会产生一个非功能性的截短USH2A蛋白。有研究者利用AON在携带c.7595-2144A＞G突变的患者来源的成纤维细胞中，通过用AON与PE40剪接位点结合，抑制mRNA前体上PE40的剪切，进而实现基因的精准修复。AON不会改变内源性转录水平，设计相对容易，生产成本低，因此基于AON的剪接校正可能是一种很有前途的方法。然而值得注意的是，基于AON的治疗需要注射裸露AON或使用重组病毒、设计的纳米粒子、细胞穿透肽、胞外体或脂质体等稳定载体进入玻璃体去干扰剪接[55]。小鼠玻璃体内损伤实验表明，有效作用时间大约1个月左右[56]。利用AAV包裹一个连接修饰的U7小核RNA AON序列可以实现相对持久的剪接校正效果[57-59]。但是，由于内界膜扩散屏障和中和抗体的存在极大影响AAV感染光感受器细胞的效率[60]。因此，可以考虑从AAV方面解决问题。一些基于AON的RNA剪接治疗目前正处于或超过1、2或3期临床试验，以评估其治疗潜力和生物安全性[61-63]。这显示了治疗此遗传疾病的广阔前景。
5 问题和展望
国内对USH的研究报道较少，可能与该病国内多为隐性遗传的小家系、医生没有充分认识此病、临床上许多患者被漏诊或误诊为RP或重度SNHL均有关系。目前对USH的表型及基因型对应关系、自然病程等研究不多见，而这对于将来的临床疗效评价等是必要的。在优生优育方面，在致病基因诊断的基础上，通过宣传教育和遗传咨询，配合有效的产前诊断和人工流产可有效避免USH患儿的出生，提高人口素质。另外需要注意的是，与视觉表型和听力缺陷有关的突变负担的基因阈值可能存在。因此，非综合征性RP和USH2A患者的功能性结果、患者的听觉表型和等位基因等级等因素都应该考虑在内[27]。
无论是基因治疗、细胞移植疗法或是基于反义寡核苷酸的RNA剪接治疗，皆存在其优点和局限性，若想应用到临床研究，完备的细胞水平及动物实验必不可少。确定各种治疗的有效性和安全性是治疗研究不得不考虑的重要问题。
Usher综合征（USH）又称遗传性耳聋-视网膜色素变性（RP）综合征，是一种以先天性感音神经性聋和视觉功能进行性丧失为特征的遗传性疾病，伴或不伴有前庭功能障碍。其遗传方式为常染色体隐性遗传[1]。USH分为3种类型。Ⅰ型（USH1）为先天性双侧重度感音神经性耳聋（SNHL），前庭反应消失，青少年时期出现RP；Ⅱ型（USH2）为中重度SNHL，前庭反应正常，RP发生较晚；Ⅲ型（USH3）为进行性SNHL，前庭反应不确定，RP发生时间不确定。其中USH1最为严重，USH2最为常见[2]。研究表明，50%以上的USH患者和7%～23%的非综合征性RP患者携带USH2A基因突变[3-6]。现就USH2A基因在USH中的最新研究进展作一综述。
1 分子水平
USH2A基因位于人类染色体1q41，全长790 kb，由72个外显子组成，编码USH2A蛋白。USH2A蛋白包括异构体A和B。异构体A发现较早，相对分子质量171.5×103，由21个编码外显子翻译、4641个核苷酸编码以及异构体B的N端1546个氨基酸片段组成，包括1个层粘连蛋白样结构域（LamGL）、1个层粘连蛋白N-末端结构域（LamNT）、10个层粘连蛋白表皮生长因子样结构域（EGF-Lam）和2组Ⅲ型纤维连接蛋白结构域（FN3）重复序列，最常见于RPE细胞、光感受器细胞以及耳蜗、卵巢、输卵管、睾丸和肠等组织的基底膜结构域中，被认为是一种分泌性细胞外蛋白[7]。异构体B相对分子质量580.0×103，由15 609个核苷酸编码、5202个氨基酸组成，是一个包含很大胞外区域的跨膜蛋白。除了异构体A所包含的结构，异构体B还包括2个LamGL区域、28个FN3区域、1个跨膜序列以及1个胞内区，此胞内区c端有一个PDZ结合区域。异构体B主要分布于视网膜，在心脏及肾脏中也有表达，是视网膜中发挥主要作用的USH2A蛋白异构体[8]。有研究对USH2A基因外显子进行突变筛查，结果显示该基因上的突变占USH2患者的55%～90%[5, 9]。
在光感受器细胞内节顶部有一个包绕连接纤毛的领状结构，被称为外周纤毛区，其膜部参与囊泡运输[10]。所有已知的USH1、USH2蛋白被发现存在于此区域[11]。USH2A蛋白也不例外，被固定在内节胞膜上，胞外结构域突出在外周纤毛区的基质中[12]。在外周纤毛区与连接纤毛膜之间有主要由USH2蛋白复合体组成的纤维状连接，为外周纤毛区和连接纤毛提供结构支持，并可能参与光感受器细胞的发育，连接纤毛内节到外节囊泡物质的运输以及外节膜盘的构成和更新[13-14]。USH2蛋白复合体主要由USH2A蛋白胞外区域即USH2A 蛋白异构体B（USH2A编码）、ADGRV1蛋白胞外区域即ADGRV1b（USH2C编码）与whirlin蛋白（USH2D编码）3种USH2蛋白通过whirlin蛋白的 PDZ结构域与USH2A蛋白和ADGRV1蛋白的c端PDZ结合基序相互作用组成[15]。任何一种USH2蛋白的缺失功能效果等同于3种蛋白的缺失，导致USH2[13]。Dona等[16]提出，USH2A蛋白具有稳定另外两种蛋白的功能，其缺陷会使USH2复合体whirlin蛋白和ADGRV1蛋白在光感受器膜上的定位降低。随着PDZD7蛋白被发现作为修饰基因存在于USH2患者中，最近研究发现 PDZD7蛋白同样参与此蛋白复合物的构成，并倾向于与ADGRV1蛋白结合[17]；USH1蛋白SANS也可提供此功能复合物与微管运输之间的分子连接[10, 18]。除了外周纤毛区，一些研究者推论USH蛋白还存在于光感受器细胞突触上[19]。但目前没有光感受器细胞突触功能缺陷小鼠动物模型的成功建立，也缺乏确凿的证据证明USH2A蛋白存在于突触区域[12]。
最近有研究发现，存在一种由USH1蛋白SANS与USH2蛋白USH2A、whirlin组成的复合物即三元USH1/USH2复合物（ternary USH1/USH2 complex），可能参与外节高尔基体来源，经内节向纤毛的动力蛋白复合物运输[20]。USH蛋白之间可形成超分子USH蛋白复合物，但其作用机制仍不太清楚。可能还有更多的“功能性”蛋白质也被整合到这一USH复合物中，在共同的细胞机制中发挥作用。如，USH2A蛋白可通过中心小体上的中心体蛋白异构体B与导致Leber先天性黑矇的纤毛蛋白lebercilin连接，也可与胶原蛋白Ⅳ和纤连蛋白相互作用，这些都有可能参与此复合物的构成[21]。
2 基因型与临床表型
目前已知USH有14个致病基因，其中USH2A、ADGRV1（USH2C）、WHRN（USH2D）和PDZD7共4个基因参与了USH2的发病。PDZD7被认为是whirlin蛋白（USH2D编码）和harmonin蛋白（USH1C编码）的同源体，PDZD7突变可作为修饰基因加剧USH2A基因突变患者的视网膜变性，也可与ADGRV1一起导致双基因遗传USH的发生[22-23]。
目前发现有超过600个突变分布在USH2A基因上，包括无义突变、移码突变、剪接相关、错义突变及内含子区变异等（http://www.lovd.nl/USH2A）。其最常见的2个突变位点为C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），均位于13号外显子。其中，c.2299delG突变是最常见的，占15%～45%[24]，尤其常见于欧洲和美国；c.2276G＞T则是导致非综合征性RP中最常见的突变位点。但有研究发现，尽管是同一个基因上同一位点的突变，在某些患者中会导致USH，而在其他患者中则表现为非综合征性RP[5, 25]。有研究者认为，双等位基因截短缺陷最常导致USH的发生，而至少1个USH2A亚效等位基因的存在通常会导致非综合征RP的发生[26]。临床视力进展方面，USH2A患者的主观性视觉功能测验往往更差，非综合征性RP患者视网膜则残存视锥细胞的功能[27]。与之相反，也有研究发现，USH2A患者和非综合征性RP患者在视网膜疾病进展中并无明显差异[28]。这两种截然相反的结果可能是由于不同研究在对疾病的进展统计、跟踪时间以及兴趣基因型的差异造成的，此方面调查研究需要在统一标准下进行更大规模追踪比较。
USH2的特点为先天性中度SNHL，听力呈下降趋势，但进展缓慢。前庭功能正常，因为有部分听力，患者有语言锻炼学习的机会，语言发育正常，运动功能正常。该型患者大多在青春期前后（20～30岁）出现视力下降，视野缩小等RP的临床症状，可残存部分视力及视野。当怀疑USH时，应进行听力、前庭功能、视力、视野、ERG等检查。正如前文所述，USH2A主要与纤毛功能有关。除USH之外，纤毛功能异常亦可导致Bardet-biedl综合征、Joubert综合征、Senior-Loken综合征和某些形式的非综合征性RP[29]。有几种综合征可能表现出与USH相似的临床征象，应注意鉴别诊断。若伴有胰岛素抵抗、2型糖尿病、高甘油三酯血症、肝功能不全/肾功能衰竭等内分泌异常，则提示Alström综合征。若伴有肥胖、智力迟钝或认知障碍以及多指和生殖系统异常等症状，可能是Bardet-Biedl综合征的临床表现。若观察到X连锁遗传的家族史，或发现肌张力障碍或共济失调，则应怀疑莫尔-特纳布贾格综合征[2]。致病基因诊断有助于上述疾病的临床诊断。
3 实验动物模型
大多数USH基因敲除小鼠模型已被建立，但出现可观察到的视网膜变性的小鼠模型只有USH2A基因敲除小鼠[12]。Liu等[12]构建的USH2A基因敲除小鼠是唯一令人信服的USH疾病小鼠模型，其模型小鼠在20个月时，超过一半的光感受器细胞丢失，ERG a、b波振幅减弱。但也有学者认为，其构建的目的性USH2A敲除小鼠模型并不成功，因为此疾病模型发病年龄晚，仅表现为轻度视网膜变性。并且，该模型在被其他实验室使用时，出生后623 d才出现比较明显的视网膜形态变化[30]。这无法排除小鼠自身衰老因素影响，不具有说服力。另一种自发的突变小鼠模型昆明小鼠表现为自发性USH2A型，这个模型显示了一种快速的、早期的视网膜变性[31]。但因为其包含了已知在遗传性视网膜变性中存在的USH2A和PDE6B这2个基因突变，因此该模型也不具有典型代表性。更多更合适的USH动物模型需要被探索，或许人源化小鼠是可以考虑的一个方向。
USH小鼠疾病模型和患者疾病表型差异的原因尚不清楚，但推测其可能与人类和小鼠USH2A基因的突变位置、遗传背景、蛋白质补偿机制、寿命差异、非遗传因素影响以及诊断措施的敏感性等有关[32]。另外，在人类光感受器细胞中发现的USH1和USH2蛋白的花萼状突起和纤周膜在小鼠等啮齿类动物中发育不良也可能是原因之一[33]。不过，该结构在甲骨鱼等其他动物中发展得很好[34]。实验室斑马鱼、日本鳕鱼等甲骨鱼类因其完整的基因组序列草稿（http://dolphin.lab.nig.ac.jp/medaka）、后代多、光感受器细胞死亡发病早、蛋白质序列相似性高等特点成为研究USH的良好模型[35-36]。Dona等[16]利用成簇规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）基因敲除技术，将斑马鱼生殖细胞中USH2A基因表达的蛋白质截短（USH2Armc1：c.2337_2342delinsAC，p.Cys780GlnfsTer32和USH2Ab1245：c.15520_15523delinsTG，p.Ala5174Ter），得到了第一个表现早期发生视网膜功能障碍的USH动物模型。值得注意的是，斑马鱼睫状体边缘区的类干细胞的存在，使其有能力再生包括光感受器细胞在内的主要视网膜细胞[37]。而人类则不具有此特点，因此斑马鱼的疾病模型在应用于USH时，这是值得注意的很大差异。
4 治疗
USH视网膜变性的治疗策略包括针对特定基因异常的基因治疗、细胞移植疗法、减缓光感受器细胞变性或凋亡的治疗如生长因子或钙阻滞剂的应用、维生素补充和内源性视锥细胞存活因子等[38]。基因治疗、细胞移植疗法和基于反义寡核苷酸（AON）的RNA剪接治疗被认为是非常有前景的治疗措施。
基因治疗为遗传性视网膜变性最具前途的治疗方法，主要包括基因替代治疗和基因编辑治疗。（1）基因替代治疗，通常用病毒载体传递目的基因，到达靶细胞后经过转录，翻译产生蛋白产物。旨在补偿由于基因突变导致的内源性蛋白功能的缺失[39]。由于USH2A基因太大，因此不适于整个基因的替代治疗。（2）基因编辑治疗，即在DNA水平上纠正基因突变的编辑策略。国际范围内，2017年12月20日美国食品和药物管理局（FDA）批准了RPE65基因替代治疗药物（商品名Luxturna）用于治疗RPE65基因突变导致的Leber先天性黑矇2型。2018年12月1日，CRISPR/Cas9基因编辑治疗CEP290基因突变导致的Leber先天性黑矇10型的临床试验获得美国FDA批准，遗传性视网膜变性的基因治疗具有很好的发展前景。针对USH2A基因片段长度较大，载体容量仍是一个需要考虑的重要问题。腺相关病毒载体（AAV）是一种小型的、非致病性的单链DNA病毒，介导光感受器细胞、RPE细胞和RGC的有效、持续转染，广泛应用于遗传性视网膜变性的基因治疗。第一代AAV2载体表达相对较慢，容量较小（4.7 kb）[40]；替代血清型及自我互补载体、双AAV载体等的出现，为基因治疗提供了范围广泛、表达速度更快、趋向性更强、载体容量更大的选择[41]。但也有研究指出，有些载体传递目的基因的效果可能要差一些[42-43]。目前已有多项临床评估证实重组AAV载体治疗视网膜疾病具有很好的安全性和有效性[44-45]。这可能是未来载体选择的一个参考依据和发展方向。
有研究团队利用CRISPR/Cas9基因编辑方法针对携带c.2299delG纯合子突变的USH患者的成纤维细胞进行编辑，体外实现突变的成功修复[46]。最新已有研究团队针对USH2A基因最常见两个突变C.2299delG（p.Glu767Serfs*21）和c.2276G＞T（p.cys759phe），利用CRISPR/spCas9系统设计sgRNA，通过HDR同源重组的方法，将患者来源细胞诱导的诱导多功能干细胞（iPSC）突变位点成功纠正，这将为后续临床治疗提供了很好的研究基础[47]。考虑到细胞移植治疗中，替换细胞携带致病突变与否、组织排斥等问题，可以移植前在患者来源的iPSCs上使用CRISPR/Cas9编辑系统进行基因定点修复，将修复过的iPSCs分化为RPE细胞或光感受器细胞后再移植到视网膜[48-50]。也有研究已成功构建移植了由iPSCs衍生的光感受器祖细胞的动物模型，移植后能与宿主双极细胞形成功能性突触，组织学和功能学上可部分恢复视觉功能[51]。但其价格成本、时间成本以及人类移植视觉功能有效性等方面，是临床试验之前需要被解决的问题。此外，利用CRISPR/Cas9技术修复突变后，RP动物模型的视觉功能可以恢复，这说明在体动物实验也是可靠的[52]。因此，CRISPR/Cas9技术在USH2A疾病治疗中是非常有前景的。
最近发现的深部内含子突变说明了USH中mRNA剪接突变这一致病机制的重要性[53-54]。USH2A基因的深部内含子突变（c.7595-2144A＞G）导致一个假外显子（PE40）插入到成熟的USH2A转录本中，会产生一个非功能性的截短USH2A蛋白。有研究者利用AON在携带c.7595-2144A＞G突变的患者来源的成纤维细胞中，通过用AON与PE40剪接位点结合，抑制mRNA前体上PE40的剪切，进而实现基因的精准修复。AON不会改变内源性转录水平，设计相对容易，生产成本低，因此基于AON的剪接校正可能是一种很有前途的方法。然而值得注意的是，基于AON的治疗需要注射裸露AON或使用重组病毒、设计的纳米粒子、细胞穿透肽、胞外体或脂质体等稳定载体进入玻璃体去干扰剪接[55]。小鼠玻璃体内损伤实验表明，有效作用时间大约1个月左右[56]。利用AAV包裹一个连接修饰的U7小核RNA AON序列可以实现相对持久的剪接校正效果[57-59]。但是，由于内界膜扩散屏障和中和抗体的存在极大影响AAV感染光感受器细胞的效率[60]。因此，可以考虑从AAV方面解决问题。一些基于AON的RNA剪接治疗目前正处于或超过1、2或3期临床试验，以评估其治疗潜力和生物安全性[61-63]。这显示了治疗此遗传疾病的广阔前景。
5 问题和展望
国内对USH的研究报道较少，可能与该病国内多为隐性遗传的小家系、医生没有充分认识此病、临床上许多患者被漏诊或误诊为RP或重度SNHL均有关系。目前对USH的表型及基因型对应关系、自然病程等研究不多见，而这对于将来的临床疗效评价等是必要的。在优生优育方面，在致病基因诊断的基础上，通过宣传教育和遗传咨询，配合有效的产前诊断和人工流产可有效避免USH患儿的出生，提高人口素质。另外需要注意的是，与视觉表型和听力缺陷有关的突变负担的基因阈值可能存在。因此，非综合征性RP和USH2A患者的功能性结果、患者的听觉表型和等位基因等级等因素都应该考虑在内[27]。
无论是基因治疗、细胞移植疗法或是基于反义寡核苷酸的RNA剪接治疗，皆存在其优点和局限性，若想应用到临床研究，完备的细胞水平及动物实验必不可少。确定各种治疗的有效性和安全性是治疗研究不得不考虑的重要问题。