引用本文： 唐贺, 彭海鹰, 史平玲, 周钟强, 魏圆梦, 李苗, 梁迎娟, 聂晓东, 黄爱国. RPGRIP1基因新突变致Leber先天性黑矇一家系. 中华眼底病杂志, 2020, 36(3): 196-199. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20191008-00315 复制
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Leber先天性黑矇（LCA）是一种少见的导致婴幼儿先天性盲的严重遗传性视网膜疾病，主要为常染色体隐性遗传，偶为显性遗传[1]。多数患者出生时或出生不久即已失明，不能注视和追光；部分患者伴有眼球震颤、畏光及指压征。不同患者眼底表现有所不同，部分患者眼底无明显病变，但部分患者表现为视盘萎缩、视网膜血管变细、RPE和脉络膜毛细血管层萎缩、视网膜脉络膜萎缩、视网膜色素沉着、黄斑部色素沉着及黄斑缺损样萎缩[1]。全视野ERG（ff-ERG）表现为a、b波平坦甚至消失[1]。目前确定的与LCA相关基因有26个，这些基因大多与光感受器外节发育、轴浆运输、光感受器外节膜盘运输等相关，而且同一基因中的不同突变还会造成不同的表型[2]。但是这些基因仅能够解释70%～80% LCA患者的发病原因[3]。本研究采用眼科基因诊断芯片并结合Sanger测序技术在一个中国汉族LCA家族中发现RPGRIP1基因新突变，现将其检测结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为严格遵守赫尔辛基宣言，经河南省立眼科医院伦理委员会批准[批文号：HNEECKY-2019（15号）]并取得受试者及未成年受试者监护人书面知情同意的回顾性研究。
2018年10月在河南省立眼科医院就诊的LCA一家系1例患者（先证者）和3名家系成员（图1）纳入研究。详细询问先证者病史并行物体注视性质、追随试验、裂隙灯显微镜、散瞳验光、眼底照相、ff-ERG和1.5T MRI头颅平扫检查；家族成员行BCVA、裂隙灯显微镜联合前置镜、验光、眼底照相及ff-ERG检查。
图1
LCA患者家系图。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先证者
采集先证者及其他3位受试者的外周静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存。采用磁珠法血液基因组提取试剂盒（康为试剂生物技术有限公司）按照标准操作流程提取全基因组DNA。使用NavoVue微型光度计（美国GE公司）检测基因组DNA提取质量，符合要求的基因组DNA分装后保存于–20 ℃待用。
采用北京中因科技有限公司自主开发设计的捕获芯片以及美国安捷伦公司生产的SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb, 96, RO捕获试剂盒，构建捕获片段文库。通过Illumina HiSeq高通量测序平台测序，二代panel的平均测序深度为500×，数据量为1 G。对明确的致病突变，采用Sanger测序进行验证。Sanger测序中，应用Primer 5.0引物设计软件设计引物，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。以基因组DNA为模板，PCR扩增目标片段。PCR扩增产物由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。所有基因序列参考美国国立生物技术信息中心（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因组数据库网站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
测序仪下机原始数据使用bcl2fastq将.bcl文件转换成.fastq文件，并使用BWA、Samtools和Picard软件将reads比对到人类参考基因组GRCh37/hg19，生成的.bam文件采用GATK系列软件进行局部重新比对，重复序列去除并进行变异检出。使用Annovar对.vcf变异文件进行变异注释。致病变异位点筛选原则：（1）筛选ExAC数据库、千人基因组计划数据库、gnomAD数据库和北京中因科技有限公司Inhouse数据库中未见正常人携带或携带频率小于5%的变异。（2）使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster等多种蛋白功能预测软件进行基因变异导致蛋白功能预测。（3）参考OMIM、HGMD、ClinVar等多种数据库对变异位点进行致病性评估，对明确的致病突变，采用Sanger测序进行验证。参考美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）标准和指南[4]，对所有变异位点进行致病等级评估。
2 结果
先证者，女，年龄6个月，出生阿普加评分（Apgar）10分。自幼双眼不追物但畏光，双眼不能固视，游走性注视，呈粗而缓慢的钟摆性眼球震颤，无指压征。双眼眼前节、玻璃体及视网膜未见明显异常（图2）。ff-ERG检查，双眼视锥、视杆系统功能严重下降（图3）。MRI检查，白质髓鞘发育落后于同龄儿。患者父母及兄长均无LCA的典型临床特征，符合常染色体隐性遗传模式。
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A示右眼；2B示左眼。双眼视网膜均未见异常
图3
先证者双眼ff-ERG检测像。3A示暗适应0.01 ERG；3B示暗适应3.0 ERG；3C示暗适应10.0 ERG；3D示暗适应3.0震荡电位；3E示明适应3.0 ERG；3F示明适应3.0闪烁光ERG。双眼均未检测到明显波形
先证者最终筛查出RPGRIP1基因存在2个突变，分别为c.1635dupA和c.3565C＞T。RPGRIP1基因共有24个外显子，c.1635dupA突变位于第13号外显子，是插入突变，在基因第1635位重复出现了一个碱基A，该突变遗传自父亲。c.3565C＞T突变位于第22号外显子，是置换突变，基因第3565位的碱基C突变为碱基T，该突变遗传自母亲。针对该家系其他成员的RPGRIP1基因检测发现，先证者父亲为c.1635dupA杂合突变，先证者母亲和兄长为c.3565C＞T杂合突变（图4）。
图4
LCA家系成员RPGRIP1基因测序峰图。Ⅱ2：先证者；Ⅰ1：先证者父亲；Ⅰ2：先证者母亲；Ⅱ1：先证者兄长。M1为反向测序结果，显示先证者及其父亲都携带c.1635dupA突变；M2为正向测序结果，显示先证者及其母亲、兄长均携带c.3565C＞T突变
经过与数据库的对比发现，c.1635dupA此前未见报道，为新发现突变；c.3565C＞T; p.Arg1189*是一个已知的致病突变，其在ExAC中的频率为0.000 008 28，在gnomAD中的频率为0.000 020 3，但是在这两个数据库和千人基因组计划数据库的东亚人群中频率均为0。
先证者RPGRIP1基因携带的2个突变均造成了蛋白翻译的提前终止，无法产生结构功能正常的蛋白产物。根据ACMG指南评估，c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2为可能致病的；c.3565C＞T; p.Arg1189*为致病的无义突变。
3 讨论
根据RetNet数据库（https://sph.uth.edu/RETNET/home.htm），目前确认与LCA相关的基因有26个，包括RPE65、LRAT、GUCY2D、CEP290、RPGRIP1等[5-8]。RPGRIP1基因位于14号常染色体，LCA发病人群中约有4%～6%与RPGRIP1基因突变相关[9]。RPGRIP1基因编码一种与GTPase调节因子序列同源的蛋白质，存在于视锥、视杆细胞内外节中，与视锥、视杆细胞营养不良的发病有着密切关系[10]。本研究对一个LCA家系进行了研究，发现了RPGRIP1基因中一个东亚人群中未见报道的致病突变c.3565C＞T和一个新的可能致病突变c.1635dupA。
能够引起遗传性眼底病的RPGRIP1基因致病突变已经发现5个，都是隐性遗传致病突变，其中4个致病突变均是由于碱基缺失或置换导致蛋白翻译提前终止，包含本研究中检测到的c.3565C＞T; p.Arg1189*[5]。另外1个致病突变是碱基置换突变，造成第746个氨基酸由中性的甘氨酸变成了碱性的精氨酸，可能造成了蛋白质功能域的重大变化[11]。RPGRIP1蛋白在视蛋白转运、光感受器的正常生理活动中起着重要作用[12-13]。它与RPGR、SPATA7和NPHP4等蛋白相互作用，与遗传性视网膜病变有着密切关系[14]。RPGRIP1基因的c.3565C＞T; p.Arg1189*突变为已知的致病突变，说明当该蛋白翻译终止于第1189个氨基酸时，蛋白质已经无法完成正常功能。而本家系c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2突变导致蛋白质翻译终止于第549个氨基酸，蛋白质产物较前者更短。既往有学者在视锥、视杆细胞营养不良的家族中也发现了RPGRIP1蛋白的第547个氨基酸发生了突变，但是其功能尚未明确[10]。综合生物信息学分析结果，我们认为c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2这一突变极有可能也是一个致病突变，并将进一步对其进行蛋白质功能学的研究。此外，该突变在千人基因组计划、ExAC和gnomAD等数据库中均没有记录，说明其在人群中的频率极低，甚至可能是东亚或汉族人群中所特有的一个致病突变。
本研究对一个LCA家系进行了研究，确定了该家系RPGRIP1的复合杂合突变。这不仅为将来可能进行的基因治疗提供了治疗靶点[15]，还为该家系未来优生优育提供了参考。该家系中发现的两个致病突变，不仅扩充了我国RPGRIP1基因的突变谱，或许还说明我国具有独特的致病基因遗传多样性，未来需要针对我国的遗传性疾病进行更深入的群体遗传学研究。
Leber先天性黑矇（LCA）是一种少见的导致婴幼儿先天性盲的严重遗传性视网膜疾病，主要为常染色体隐性遗传，偶为显性遗传[1]。多数患者出生时或出生不久即已失明，不能注视和追光；部分患者伴有眼球震颤、畏光及指压征。不同患者眼底表现有所不同，部分患者眼底无明显病变，但部分患者表现为视盘萎缩、视网膜血管变细、RPE和脉络膜毛细血管层萎缩、视网膜脉络膜萎缩、视网膜色素沉着、黄斑部色素沉着及黄斑缺损样萎缩[1]。全视野ERG（ff-ERG）表现为a、b波平坦甚至消失[1]。目前确定的与LCA相关基因有26个，这些基因大多与光感受器外节发育、轴浆运输、光感受器外节膜盘运输等相关，而且同一基因中的不同突变还会造成不同的表型[2]。但是这些基因仅能够解释70%～80% LCA患者的发病原因[3]。本研究采用眼科基因诊断芯片并结合Sanger测序技术在一个中国汉族LCA家族中发现RPGRIP1基因新突变，现将其检测结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为严格遵守赫尔辛基宣言，经河南省立眼科医院伦理委员会批准[批文号：HNEECKY-2019（15号）]并取得受试者及未成年受试者监护人书面知情同意的回顾性研究。
2018年10月在河南省立眼科医院就诊的LCA一家系1例患者（先证者）和3名家系成员（图1）纳入研究。详细询问先证者病史并行物体注视性质、追随试验、裂隙灯显微镜、散瞳验光、眼底照相、ff-ERG和1.5T MRI头颅平扫检查；家族成员行BCVA、裂隙灯显微镜联合前置镜、验光、眼底照相及ff-ERG检查。
图1
LCA患者家系图。□：正常男性；○：正常女性；●：女性患者；↗：先证者
采集先证者及其他3位受试者的外周静脉血5 ml，置于EDTA抗凝管中，4 ℃保存。采用磁珠法血液基因组提取试剂盒（康为试剂生物技术有限公司）按照标准操作流程提取全基因组DNA。使用NavoVue微型光度计（美国GE公司）检测基因组DNA提取质量，符合要求的基因组DNA分装后保存于–20 ℃待用。
采用北京中因科技有限公司自主开发设计的捕获芯片以及美国安捷伦公司生产的SureSelectXT Custom 0.5-2.9Mb, 96, RO捕获试剂盒，构建捕获片段文库。通过Illumina HiSeq高通量测序平台测序，二代panel的平均测序深度为500×，数据量为1 G。对明确的致病突变，采用Sanger测序进行验证。Sanger测序中，应用Primer 5.0引物设计软件设计引物，由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。以基因组DNA为模板，PCR扩增目标片段。PCR扩增产物由北京睿博兴科生物技术有限公司进行测序。所有基因序列参考美国国立生物技术信息中心（NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）和基因组数据库网站（http://asia.ensembl.org/index.html）。
测序仪下机原始数据使用bcl2fastq将.bcl文件转换成.fastq文件，并使用BWA、Samtools和Picard软件将reads比对到人类参考基因组GRCh37/hg19，生成的.bam文件采用GATK系列软件进行局部重新比对，重复序列去除并进行变异检出。使用Annovar对.vcf变异文件进行变异注释。致病变异位点筛选原则：（1）筛选ExAC数据库、千人基因组计划数据库、gnomAD数据库和北京中因科技有限公司Inhouse数据库中未见正常人携带或携带频率小于5%的变异。（2）使用SIFT、Polyphen2、Mutation Taster等多种蛋白功能预测软件进行基因变异导致蛋白功能预测。（3）参考OMIM、HGMD、ClinVar等多种数据库对变异位点进行致病性评估，对明确的致病突变，采用Sanger测序进行验证。参考美国医学遗传学和基因组学学院（ACMG）标准和指南[4]，对所有变异位点进行致病等级评估。
2 结果
先证者，女，年龄6个月，出生阿普加评分（Apgar）10分。自幼双眼不追物但畏光，双眼不能固视，游走性注视，呈粗而缓慢的钟摆性眼球震颤，无指压征。双眼眼前节、玻璃体及视网膜未见明显异常（图2）。ff-ERG检查，双眼视锥、视杆系统功能严重下降（图3）。MRI检查，白质髓鞘发育落后于同龄儿。患者父母及兄长均无LCA的典型临床特征，符合常染色体隐性遗传模式。
图2
先证者双眼彩色眼底像。2A示右眼；2B示左眼。双眼视网膜均未见异常
图3
先证者双眼ff-ERG检测像。3A示暗适应0.01 ERG；3B示暗适应3.0 ERG；3C示暗适应10.0 ERG；3D示暗适应3.0震荡电位；3E示明适应3.0 ERG；3F示明适应3.0闪烁光ERG。双眼均未检测到明显波形
先证者最终筛查出RPGRIP1基因存在2个突变，分别为c.1635dupA和c.3565C＞T。RPGRIP1基因共有24个外显子，c.1635dupA突变位于第13号外显子，是插入突变，在基因第1635位重复出现了一个碱基A，该突变遗传自父亲。c.3565C＞T突变位于第22号外显子，是置换突变，基因第3565位的碱基C突变为碱基T，该突变遗传自母亲。针对该家系其他成员的RPGRIP1基因检测发现，先证者父亲为c.1635dupA杂合突变，先证者母亲和兄长为c.3565C＞T杂合突变（图4）。
图4
LCA家系成员RPGRIP1基因测序峰图。Ⅱ2：先证者；Ⅰ1：先证者父亲；Ⅰ2：先证者母亲；Ⅱ1：先证者兄长。M1为反向测序结果，显示先证者及其父亲都携带c.1635dupA突变；M2为正向测序结果，显示先证者及其母亲、兄长均携带c.3565C＞T突变
经过与数据库的对比发现，c.1635dupA此前未见报道，为新发现突变；c.3565C＞T; p.Arg1189*是一个已知的致病突变，其在ExAC中的频率为0.000 008 28，在gnomAD中的频率为0.000 020 3，但是在这两个数据库和千人基因组计划数据库的东亚人群中频率均为0。
先证者RPGRIP1基因携带的2个突变均造成了蛋白翻译的提前终止，无法产生结构功能正常的蛋白产物。根据ACMG指南评估，c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2为可能致病的；c.3565C＞T; p.Arg1189*为致病的无义突变。
3 讨论
根据RetNet数据库（https://sph.uth.edu/RETNET/home.htm），目前确认与LCA相关的基因有26个，包括RPE65、LRAT、GUCY2D、CEP290、RPGRIP1等[5-8]。RPGRIP1基因位于14号常染色体，LCA发病人群中约有4%～6%与RPGRIP1基因突变相关[9]。RPGRIP1基因编码一种与GTPase调节因子序列同源的蛋白质，存在于视锥、视杆细胞内外节中，与视锥、视杆细胞营养不良的发病有着密切关系[10]。本研究对一个LCA家系进行了研究，发现了RPGRIP1基因中一个东亚人群中未见报道的致病突变c.3565C＞T和一个新的可能致病突变c.1635dupA。
能够引起遗传性眼底病的RPGRIP1基因致病突变已经发现5个，都是隐性遗传致病突变，其中4个致病突变均是由于碱基缺失或置换导致蛋白翻译提前终止，包含本研究中检测到的c.3565C＞T; p.Arg1189*[5]。另外1个致病突变是碱基置换突变，造成第746个氨基酸由中性的甘氨酸变成了碱性的精氨酸，可能造成了蛋白质功能域的重大变化[11]。RPGRIP1蛋白在视蛋白转运、光感受器的正常生理活动中起着重要作用[12-13]。它与RPGR、SPATA7和NPHP4等蛋白相互作用，与遗传性视网膜病变有着密切关系[14]。RPGRIP1基因的c.3565C＞T; p.Arg1189*突变为已知的致病突变，说明当该蛋白翻译终止于第1189个氨基酸时，蛋白质已经无法完成正常功能。而本家系c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2突变导致蛋白质翻译终止于第549个氨基酸，蛋白质产物较前者更短。既往有学者在视锥、视杆细胞营养不良的家族中也发现了RPGRIP1蛋白的第547个氨基酸发生了突变，但是其功能尚未明确[10]。综合生物信息学分析结果，我们认为c.1635dupA; p.Ala547Serfs*2这一突变极有可能也是一个致病突变，并将进一步对其进行蛋白质功能学的研究。此外，该突变在千人基因组计划、ExAC和gnomAD等数据库中均没有记录，说明其在人群中的频率极低，甚至可能是东亚或汉族人群中所特有的一个致病突变。
本研究对一个LCA家系进行了研究，确定了该家系RPGRIP1的复合杂合突变。这不仅为将来可能进行的基因治疗提供了治疗靶点[15]，还为该家系未来优生优育提供了参考。该家系中发现的两个致病突变，不仅扩充了我国RPGRIP1基因的突变谱，或许还说明我国具有独特的致病基因遗传多样性，未来需要针对我国的遗传性疾病进行更深入的群体遗传学研究。
