引用本文： 李媛, 秦廷玉, 郭龙, 李淑珍, 侯习武. 骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-183靶向调控视网膜脱氢酶11对视网膜色素上皮细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2022, 38(8): 688-695. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201119-00574 复制
视网膜色素变性（RP）是以光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞退行性变为主的视网膜变性疾病，可导致患者出现中枢性视觉丧失甚至失明[1-2]。RP的致盲原因是RPE细胞死亡或在消耗光感受器外节碎片的吞噬过程中失效[3]，而视网膜脱氢酶11（RDH11）也是RP的诱发基因之一[4-5]。研究表明，移植骨髓间充质干细胞（BMSC）是治疗视网膜退行性疾病的一种有效策略[6]。BMSC等多种细胞均可分泌外泌体，可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等调节受体细胞的生物学活性[7]。研究发现，miR-183簇可在BMSC中增加，并可触发BMSC对视网膜神经元特别是光感受器细胞的重编程，从而控制RP的发展[8-9]。为进一步探讨BMSC来源外泌体（BMSC-exo）对RPE细胞增生、凋亡的可能作用及机制，本研究观察分析了BMSC-exo上miR-183、RDH11的表达，初步探讨两者靶向关系以及对RPE细胞的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
不同鼠龄C57BL/6（C57）小鼠5只、视网膜变性10（rd10）小鼠25只，雌雄不限，清洁级。其中，C57小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；rd10小鼠由美国Jackson实验室提供。小鼠饲养于22 ℃，12 h明/12 h暗循环条件下，湿度45%～55%。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得商丘市第一人民医院动物伦理委员会许可（伦理编号：20200314）。
C57小鼠5只过量麻醉处死。股骨、胫骨的骨髓细胞置于含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的Dulbecco改良Eagle（DMEM）完全培养基中，37 ℃、95%空气、5%CO2培养箱中培养，每3天换液传代。取第3代BMSC重新培养，应用磷酸盐缓冲液（PBS）调节细胞浓度至1×106个/ml（200 μl）。
C57小鼠5只、rd10小鼠5只过量麻醉处死，摘除眼球。参照文献[10]的方法培养RPE细胞。剥除视网膜，将后眼杯（巩膜脉络膜RPE细胞）移至培养皿，速冻。PBS冲洗20次，将包含棕色块状释放物质（RPE细胞）的PBS移到2 ml离心管中，加入1.8 ml RNAlater，静置10 min，过滤。取第5、6代细胞培养于含20 ng/ml重组表皮生长因子的DMEM培养基中。
1.2 BMSC转染和分组、外泌体提取和鉴定
BMSC接种于6孔板中，待细胞培养至60%融合时进行转染。一管中加入250 µl不含血清的DMEM培养基稀释各转染序列，室温混匀静置5 min；另一管中加入稀释的5 µl脂质体TM2000于250 µl无血清培养基中。将上述两管混合，室温静置45 min；洗涤细胞2次，加入1.5 ml无抗生素、无血清DMEM培养基。将上述混合物加入6孔板中，37 ℃培养4～6 h后换成完全培养基继续培养。将BMSC分为空白组、模拟空白对照组（mimic-NC组）、miR-183模拟组（miR-183-mimic组）。空白组加入未转染的BMSC；mimic-NC组加入转染miR-183模拟物阴性对照物；miR-183-mimic组加入转染miR-183模拟物。miR-183模拟物及阴性对照物购于上海吉玛有限公司。
外泌体提取：各组转染的BMSC融合至80%～90%时，收集细胞培养液，2000×g离心10 min除去细胞碎片，再经0.45 µg无菌滤膜过滤到15 ml超滤离心管中，4 ℃条件下，2000×g离心10 min，得到外泌体浓缩液。将浓缩液移至15 ml超滤离心管中，4 ℃条件下，100 000×g离心15 min，按照ExoQuick提取试剂盒说明提取外泌体。PBS洗涤沉淀后重新悬浮，－80 ℃冷冻备用。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染后各组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量。
外泌体鉴定：铜网上滴加20 μl外泌体，静置3 min，滴加30 μl磷钨酸溶液（pH 6.8）复染5 min加深背景，滤纸去除多余染色剂。透射电子显微镜观察外泌体形态。纳米粒度分析检测粒子直径。PBS将外泌体稀释至1 ml体积，注入1 ml注射器中并装载在纳米粒度分析仪载物台上，检测粒子直径。实验重复3次，取平均值。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志蛋白肿瘤易感基因101（TSG101）、CD63、CD81的表达。二喹啉甲酸（BCA）试剂盒鉴定浓缩外泌体悬液，测定蛋白含量。变性后，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行蛋白质分离。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照。
1.3 RPE细胞外泌体摄取和共培养
RPE细胞外泌体摄取：RPE细胞按照3×104个/孔的细胞密度接种于24孔板中，贴壁后按照蛋白浓度80 μg/ml将PKH26[研载生物科技（上海）有限公司]预染的BMSC-exo加入孔板中，培养0（初始时间）、48 h后将细胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室温染色1 h，PBS洗3次，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下观察拍照。
转染BMSC-exo与来自rd10小鼠的RPE细胞共培养。以细胞密度5×103个/孔接种于96孔板中，添加基质胶，37 ℃培养24 h，分为对照组、外泌体组、mimic-NC-外泌体组（mimic-NC-exo组）、miR-183-mimic-外泌体组（miR-183-mimic-exo组）。对照组未加入外泌体；外泌体组与未转染的BMSC-exo共培养；mimic-NC-exo组与转染miR-183模拟物阴性对照物BMSC-exo共培养；miR-183-mimic-exo组与转染miR-183模拟物BMSC-exo共培养。
1.4 细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测BMSC-exo上miR-183对RPE细胞增生的影响
来自rd10小鼠的对数生长期RPE细胞以3×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，培养24、48、72 h后，弃上清液后每孔加入10 μl CCK-8试剂孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，绘制生长曲线。实验重复3次，取平均值。
1.5 qRT-PCR检测不同来源小鼠RPE细胞和各组小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量
取BMSC-exo与RPE细胞共培养后的RPE细胞，提取总RNA进行反转录。按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后进行扩增。采用Premier5.0软件设计引物（表1）。以U6为miR-183的内参照，以GAPDH为RDH11的内参照；使用标准SYBR-GreenRT-PCR试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]进行检测，按照2−ΔΔCt计算各组miR-183、RDH11 mRNA的相对表达量。
表1
miR-183、RDH11引物序列
1.6 Western blot检测对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11蛋白相对表达量
采用放射免疫沉淀法裂解缓冲液提取视网膜细胞总蛋白。4 ℃条件下，以离心半径8 cm、12 000 r/min离心15 min，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。PAGE分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入抗体RDH11，4 ℃过夜，辣根过氧化物酶-共轭二抗孵育后行增强化学发光定影、显影，Image Lab凝胶成像系统成像。以GAPDH作为内参照，进行灰度分析。实验重复3次，取平均值。
1.7 原位末端标记（TUNEL）法检测RPE细胞凋亡情况
rd10小鼠20只按照注射外泌体类型分为对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组，各组均为5只小鼠。小鼠腹腔麻醉后右眼视网膜下腔注射1 µl外泌体。注射后7 d，过量麻醉处死小鼠，摘除眼球，视网膜组织采用4%甲醛溶液固定，孵育后Triton X-100进行渗透（0.1% PBS），TUNEL染色，DAPI复染，防淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察RPE细胞形态学变化；扫描共焦显微镜观察RPE细胞凋亡情况。
1.8 生物信息学网站及双荧光素酶报告分析miR-183与RDH11的靶向关系
应用Jefferson等在线网站对miR-183与RDH11靶向关系结合位点进行预测分析，双荧光素酶报告基因实验对其进行验证。293T细胞于24孔板中培养过夜，将测序正确的荧光素酶报告质粒WT-RDH11、MUT-RDH11和miR-183模拟物及其阴性对照共转染至细胞中。培养36 h后，萤火虫/红紫色荧光双荧光素酶报告基因测定系统根据说明书计算荧光素酶相对活性。实验重复3次，取平均值。
1.9 统计学分析
采用SPSS21.0软件行统计学分析。定量资料以均数±标准差（
）表示。呈正态分布的数据两两比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验；各组间不同时间点数据比较采用重复测量方差分析，Bonferroni进行事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同来源小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量比较
与C57小鼠RPE细胞比较，rd10小鼠RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量下调，RDH11 mRNA相对表达量上调，差异均有统计学意义（t=5.230、8.548，P=0.006、0.001）（图1）。
图1
rd10小鼠、C57BL/6小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量比较（n=3），*P＜0.05。rd10：视网膜变性10；RPE：视网膜色素上皮
2.2 外泌体鉴定、外泌体中miR-183表达及RPE细胞外泌体的摄入
透射电子显微镜观察发现，BMSC-exo为圆形或椭圆形膜性小囊泡，其内存在低电子密度成分（图2A）。Western blot检测结果显示，与BMSC比较，外泌体表面TSG101、CD63、CD81蛋白表达更明显（图2B）。qRT-PCR检测结果显示，与空白组、mimic-NC组比较，miR-183-mimics组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量显著上升，差异有统计学意义（F=60.130，P＜0.001）（图2C）。荧光显微镜观察发现，培养0 h时，外泌体未进入RPE细胞且细胞数较少（图2D）；24 h时，外泌体进入RPE细胞并沿细胞核膜聚集（图2E）。
图2
外泌体鉴定、外泌体中miR-183表达及RPE细胞外泌体摄入结果。2A示透射电子显微镜像。外泌体呈圆形或椭圆形膜性小囊泡，囊泡内存在低电子密度成分 ×200。2B示电泳图。外泌体表达TSG101、CD63、CD81。2C示各组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量比较。1～3分别为空白组（n=3）、mimic-NC组、miR-183-mimics组（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。2D、2F分别示培养0、24 h荧光显微镜像。0 h，DAPI标记的RPE细胞呈蓝色荧光，外泌体未进入 ×200；24 h，PKH26标记的外泌体呈红色荧光，沿RPE细胞核膜聚集 ×200。RPE：视网膜色素上皮；TSG101：肿瘤易感基因101；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.3 BMSC来源外泌体miR-183对体外RPE细胞增生的影响
qRT-PCR检测结果显示，外泌体组、对照组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（t=1.749，P=0.155）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量较mimic-NC-exo组显著升高，差异有统计学意义（t=7.311，P=0.002）（图3A）。CCK-8增生分析法结果显示，共培养后72 h，对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组A值分别为1.00±0.10、1.60±0.10、1.80±0.12、2.40±0.20。与对照组比较，外泌体组RPE细胞增生能力提高，差异有统计学意义（F=9.726，P=0.031）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞增生能力较mimic-NC-exo组增强，差异有统计学意义（F=10.949，P=0.012）（图3B）。
图3
MSC来源的外泌体miR-183对体外RPE细胞增生的影响。3A示对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组转染MSC外泌体与RPE细胞共培养后miR-183 mRNA相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。3B示4组间不同时间A值比较（n=3）。*与对照组比较，#与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。MSC：骨髓间充质干细胞；RPE：视网膜色素上皮
2.4 BMSC来源的外泌体miR-183对rd10小鼠RPE细胞凋亡的影响
荧光显微镜观察发现，外泌体组RPE细胞凋亡数量较对照组减少，差异有统计学意义（t=4.571，P=0.002）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞凋亡数量较mimic-NC-exo组减少，差异有统计学意义（t=4.954，P=0.001）（图4）。
图4
BMSC来源的外泌体miR-183对rd10小鼠视网膜组织细胞凋亡的影响。4A示荧光显微镜像。活细胞采用DAPI染色显示蓝色荧光，凋亡细胞采用TUNEL染色显示绿色荧光 ×200。4B示4组间凋亡细胞比较（n=5）。1～4分别为对照组、外泌体组、minic-NC-exo组、miR-183-minic-exo组。*与对照组比较，#与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。BMSC：骨髓间充质干细胞；rd10：视网膜变性10；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；TUNEL：原位末端标记法
2.5 miR-183与RDH11具有靶向关系
双荧光素酶报告基因实验验证结果显示，生物信息学网站查询miR-183与RDH11具有结合位点；与mimic-NC组比较，miR-183-mimic组野生型WT-RDH11共转染组的荧光素酶相对活性下降，差异有统计学意义（t=5.476，P=0.005）；MUT-RDH11的荧光素酶相对活性差异无统计学意义（t=0.316，P＞0.05）（图5）。
图5
miR-183与RDH11具有靶向关系。5A示生物信息学Jefferson网站预测miR-183与RDH11的结合位点。5B示mimic-NC组、miR-183-mimic组野生型WT-RDH11与MUT-RDH11的荧光素酶相对活性比较（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。RDH11：视网膜脱氢酶11
2.6 miR-183可靶向调控RDH11的表达
与mimic-NC组比较，miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（t=5.361、6.591，P=0.006、0.003）。共培养后，与对照组比较，外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义（t=0.169、1.134，P=0.874、0.320）；与mimic-NC-exo组比较，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（t=5.554、5.546，P=0.005、0.005）（图6）。
图6
miR-183可靶向调控RDH11的表达。6A、6B分别示空白组、mimic-NC组、miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。6C、6D分别示对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组转染MSC外泌体与RPE细胞共培养后RDH11 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。RDH11：视网膜脱氢酶11；MSC：骨髓间充质干细胞；RPE：视网膜色素上皮；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶
3 讨论
RP是一种慢性、进行性、遗传性以及营养不良性视网膜退行性变。既往研究已证实，RP病理改变中，杆状细胞外节盘膜早期即已丧失；细胞外盘膜崩解物殖留，堆积形成一层障碍物，影响营养物质从脉络膜到达视网膜的运转，从而引起视细胞进行性营养不良及逐渐的变性和消失[11-12]。RPE细胞可组成RPE层与脉络膜相连，具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用[13]。因此，RPE细胞的消失可能是RP进展的原因之一。间充质干细胞是一种多功能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用较多。BMSC可减少视网膜光感受器细胞凋亡，对视网膜损伤具有保护作用[14-15]。外泌体是几乎所有细胞类型都可产生的一种膜性囊泡，是细胞间通讯的关键信使，干细胞来源的外泌体包含多种功能蛋白和信号脂质，通过与细胞膜融合将脂质、核酸、蛋白质等多种生物活性物质传递给受体细胞，引起受体细胞功能或活性改变，发挥细胞间物质交换和信息交流的作用[16]。
miRNAs是一类小的、非编码RNA分子，代表着基因表达的重要调节因子。在细胞指定过程中扮演着“微调子”的角色，以确保在细胞分化的特定阶段精确的基因表达[17]。Kinoshita等[18]研究表明，miR-183在视网膜组织形态发生中起着至关重要的作用，可保护视网膜，减少视网膜细胞损伤。多项研究表明，BMSC或BMSC来源的外泌体可恢复或促进miR-183的表达，进而一定程度的减少视网膜变性的发生[19-21]。RDH11存在于小鼠视网膜组织中，可参与氧化应激的调节且是RP的诱发基因之一[4-5]。Xie等[22]研究发现，RDH11的有害突变会导致新的RP综合征。本研究从BMSC中提取外泌体，使用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪及Western blot进行鉴定，转染miR-183模拟物后miR-183-mimics组miR-183表达显著上升，rd10小鼠RPE细胞中miR-183表达下调，RDH11表达上调。BMSC来源的外泌体与RPE细胞共培养24 h时，外泌体成功进入RPE细胞；与对照组比较，外泌体组RPE细胞中miR-183表达无明显变化，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183表达较mimic-NC-exo组显著升高；外泌体组RPE细胞增生能力提高，miR-183-mimic-exo组RPE细胞增生能力较mimic-NC-exo组增强。这提示BMSC来源的外泌体转染miR-183成功，RPE细胞成功摄入外泌体且BMSC来源的外泌体miR-183能促进RPE细胞的增生。
本研究结果显示，与对照组比较，外泌体组视网膜组织细胞凋亡较少；miR-183-mimic-exo组视网膜组织细胞凋亡较mimic-NC-exo组减少。这提示BMSC来源的外泌体miR-183能减少视网膜组织细胞的凋亡。生物信息学网站查询miR-183与RDH11具有结合位点，双荧光素酶报告结果显示miR-183与RDH11具有靶向关系。与mimic-NC组比较，miR-183-mimic mRNA及蛋白相对表达量均降低；BMSC来源的外泌体与RPE细胞共培养后，外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA和蛋白相对表达量与对照组比较无明显变化，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量较mimic-NC-exo组显著降低。该结果提示miR-183能靶向调控RDH11的表达。
本研究结果表明，rd10小鼠视网膜RPE细胞中，miR-183表达下调，RDH11表达上调；miR-183与RDH11具有靶向关系；BMSC来源的外泌体miR-183促进RPE细胞体外增生；注射转染miR-183模拟物的BMSC外泌体减少了rd10小鼠视网膜组织中细胞的凋亡。这说明，从机制上讲，上调BMSC来源的外泌体miR-183可能通过靶向抑制RDH11的表达而抑制RP的发展。
视网膜色素变性（RP）是以光感受器细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞退行性变为主的视网膜变性疾病，可导致患者出现中枢性视觉丧失甚至失明[1-2]。RP的致盲原因是RPE细胞死亡或在消耗光感受器外节碎片的吞噬过程中失效[3]，而视网膜脱氢酶11（RDH11）也是RP的诱发基因之一[4-5]。研究表明，移植骨髓间充质干细胞（BMSC）是治疗视网膜退行性疾病的一种有效策略[6]。BMSC等多种细胞均可分泌外泌体，可通过其携带的蛋白质、核酸、脂类等调节受体细胞的生物学活性[7]。研究发现，miR-183簇可在BMSC中增加，并可触发BMSC对视网膜神经元特别是光感受器细胞的重编程，从而控制RP的发展[8-9]。为进一步探讨BMSC来源外泌体（BMSC-exo）对RPE细胞增生、凋亡的可能作用及机制，本研究观察分析了BMSC-exo上miR-183、RDH11的表达，初步探讨两者靶向关系以及对RPE细胞的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
不同鼠龄C57BL/6（C57）小鼠5只、视网膜变性10（rd10）小鼠25只，雌雄不限，清洁级。其中，C57小鼠由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；rd10小鼠由美国Jackson实验室提供。小鼠饲养于22 ℃，12 h明/12 h暗循环条件下，湿度45%～55%。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得商丘市第一人民医院动物伦理委员会许可（伦理编号：20200314）。
C57小鼠5只过量麻醉处死。股骨、胫骨的骨髓细胞置于含10%胎牛血清和青霉素、链霉素的Dulbecco改良Eagle（DMEM）完全培养基中，37 ℃、95%空气、5%CO2培养箱中培养，每3天换液传代。取第3代BMSC重新培养，应用磷酸盐缓冲液（PBS）调节细胞浓度至1×106个/ml（200 μl）。
C57小鼠5只、rd10小鼠5只过量麻醉处死，摘除眼球。参照文献[10]的方法培养RPE细胞。剥除视网膜，将后眼杯（巩膜脉络膜RPE细胞）移至培养皿，速冻。PBS冲洗20次，将包含棕色块状释放物质（RPE细胞）的PBS移到2 ml离心管中，加入1.8 ml RNAlater，静置10 min，过滤。取第5、6代细胞培养于含20 ng/ml重组表皮生长因子的DMEM培养基中。
1.2 BMSC转染和分组、外泌体提取和鉴定
BMSC接种于6孔板中，待细胞培养至60%融合时进行转染。一管中加入250 µl不含血清的DMEM培养基稀释各转染序列，室温混匀静置5 min；另一管中加入稀释的5 µl脂质体TM2000于250 µl无血清培养基中。将上述两管混合，室温静置45 min；洗涤细胞2次，加入1.5 ml无抗生素、无血清DMEM培养基。将上述混合物加入6孔板中，37 ℃培养4～6 h后换成完全培养基继续培养。将BMSC分为空白组、模拟空白对照组（mimic-NC组）、miR-183模拟组（miR-183-mimic组）。空白组加入未转染的BMSC；mimic-NC组加入转染miR-183模拟物阴性对照物；miR-183-mimic组加入转染miR-183模拟物。miR-183模拟物及阴性对照物购于上海吉玛有限公司。
外泌体提取：各组转染的BMSC融合至80%～90%时，收集细胞培养液，2000×g离心10 min除去细胞碎片，再经0.45 µg无菌滤膜过滤到15 ml超滤离心管中，4 ℃条件下，2000×g离心10 min，得到外泌体浓缩液。将浓缩液移至15 ml超滤离心管中，4 ℃条件下，100 000×g离心15 min，按照ExoQuick提取试剂盒说明提取外泌体。PBS洗涤沉淀后重新悬浮，－80 ℃冷冻备用。实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测转染后各组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量。
外泌体鉴定：铜网上滴加20 μl外泌体，静置3 min，滴加30 μl磷钨酸溶液（pH 6.8）复染5 min加深背景，滤纸去除多余染色剂。透射电子显微镜观察外泌体形态。纳米粒度分析检测粒子直径。PBS将外泌体稀释至1 ml体积，注入1 ml注射器中并装载在纳米粒度分析仪载物台上，检测粒子直径。实验重复3次，取平均值。蛋白免疫印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志蛋白肿瘤易感基因101（TSG101）、CD63、CD81的表达。二喹啉甲酸（BCA）试剂盒鉴定浓缩外泌体悬液，测定蛋白含量。变性后，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）进行蛋白质分离。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照。
1.3 RPE细胞外泌体摄取和共培养
RPE细胞外泌体摄取：RPE细胞按照3×104个/孔的细胞密度接种于24孔板中，贴壁后按照蛋白浓度80 μg/ml将PKH26[研载生物科技（上海）有限公司]预染的BMSC-exo加入孔板中，培养0（初始时间）、48 h后将细胞爬片置于4%多聚甲醛中固定20 min，PBS洗3次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）室温染色1 h，PBS洗3次，抗荧光淬灭剂封片。荧光显微镜下观察拍照。
转染BMSC-exo与来自rd10小鼠的RPE细胞共培养。以细胞密度5×103个/孔接种于96孔板中，添加基质胶，37 ℃培养24 h，分为对照组、外泌体组、mimic-NC-外泌体组（mimic-NC-exo组）、miR-183-mimic-外泌体组（miR-183-mimic-exo组）。对照组未加入外泌体；外泌体组与未转染的BMSC-exo共培养；mimic-NC-exo组与转染miR-183模拟物阴性对照物BMSC-exo共培养；miR-183-mimic-exo组与转染miR-183模拟物BMSC-exo共培养。
1.4 细胞计数试剂盒8（CCK-8）检测BMSC-exo上miR-183对RPE细胞增生的影响
来自rd10小鼠的对数生长期RPE细胞以3×103个/孔的细胞密度接种于96孔板中，培养24、48、72 h后，弃上清液后每孔加入10 μl CCK-8试剂孵育2 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，绘制生长曲线。实验重复3次，取平均值。
1.5 qRT-PCR检测不同来源小鼠RPE细胞和各组小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量
取BMSC-exo与RPE细胞共培养后的RPE细胞，提取总RNA进行反转录。按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，逆转录成cDNA后进行扩增。采用Premier5.0软件设计引物（表1）。以U6为miR-183的内参照，以GAPDH为RDH11的内参照；使用标准SYBR-GreenRT-PCR试剂盒[宝日医生物技术（北京）有限公司]进行检测，按照2−ΔΔCt计算各组miR-183、RDH11 mRNA的相对表达量。
表1
miR-183、RDH11引物序列
1.6 Western blot检测对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11蛋白相对表达量
采用放射免疫沉淀法裂解缓冲液提取视网膜细胞总蛋白。4 ℃条件下，以离心半径8 cm、12 000 r/min离心15 min，收集上清，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。PAGE分离蛋白并转移至聚偏氟乙烯膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入抗体RDH11，4 ℃过夜，辣根过氧化物酶-共轭二抗孵育后行增强化学发光定影、显影，Image Lab凝胶成像系统成像。以GAPDH作为内参照，进行灰度分析。实验重复3次，取平均值。
1.7 原位末端标记（TUNEL）法检测RPE细胞凋亡情况
rd10小鼠20只按照注射外泌体类型分为对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组，各组均为5只小鼠。小鼠腹腔麻醉后右眼视网膜下腔注射1 µl外泌体。注射后7 d，过量麻醉处死小鼠，摘除眼球，视网膜组织采用4%甲醛溶液固定，孵育后Triton X-100进行渗透（0.1% PBS），TUNEL染色，DAPI复染，防淬灭封片剂封片。荧光显微镜观察RPE细胞形态学变化；扫描共焦显微镜观察RPE细胞凋亡情况。
1.8 生物信息学网站及双荧光素酶报告分析miR-183与RDH11的靶向关系
应用Jefferson等在线网站对miR-183与RDH11靶向关系结合位点进行预测分析，双荧光素酶报告基因实验对其进行验证。293T细胞于24孔板中培养过夜，将测序正确的荧光素酶报告质粒WT-RDH11、MUT-RDH11和miR-183模拟物及其阴性对照共转染至细胞中。培养36 h后，萤火虫/红紫色荧光双荧光素酶报告基因测定系统根据说明书计算荧光素酶相对活性。实验重复3次，取平均值。
1.9 统计学分析
采用SPSS21.0软件行统计学分析。定量资料以均数±标准差（）表示。呈正态分布的数据两两比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，Tukey's进行事后检验；各组间不同时间点数据比较采用重复测量方差分析，Bonferroni进行事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同来源小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量比较
与C57小鼠RPE细胞比较，rd10小鼠RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量下调，RDH11 mRNA相对表达量上调，差异均有统计学意义（t=5.230、8.548，P=0.006、0.001）（图1）。
图1
rd10小鼠、C57BL/6小鼠RPE细胞中miR-183、RDH11 mRNA相对表达量比较（n=3），*P＜0.05。rd10：视网膜变性10；RPE：视网膜色素上皮
2.2 外泌体鉴定、外泌体中miR-183表达及RPE细胞外泌体的摄入
透射电子显微镜观察发现，BMSC-exo为圆形或椭圆形膜性小囊泡，其内存在低电子密度成分（图2A）。Western blot检测结果显示，与BMSC比较，外泌体表面TSG101、CD63、CD81蛋白表达更明显（图2B）。qRT-PCR检测结果显示，与空白组、mimic-NC组比较，miR-183-mimics组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量显著上升，差异有统计学意义（F=60.130，P＜0.001）（图2C）。荧光显微镜观察发现，培养0 h时，外泌体未进入RPE细胞且细胞数较少（图2D）；24 h时，外泌体进入RPE细胞并沿细胞核膜聚集（图2E）。
图2
外泌体鉴定、外泌体中miR-183表达及RPE细胞外泌体摄入结果。2A示透射电子显微镜像。外泌体呈圆形或椭圆形膜性小囊泡，囊泡内存在低电子密度成分 ×200。2B示电泳图。外泌体表达TSG101、CD63、CD81。2C示各组外泌体中miR-183 mRNA相对表达量比较。1～3分别为空白组（n=3）、mimic-NC组、miR-183-mimics组（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。2D、2F分别示培养0、24 h荧光显微镜像。0 h，DAPI标记的RPE细胞呈蓝色荧光，外泌体未进入 ×200；24 h，PKH26标记的外泌体呈红色荧光，沿RPE细胞核膜聚集 ×200。RPE：视网膜色素上皮；TSG101：肿瘤易感基因101；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.3 BMSC来源外泌体miR-183对体外RPE细胞增生的影响
qRT-PCR检测结果显示，外泌体组、对照组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量比较，差异无统计学意义（t=1.749，P=0.155）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183 mRNA相对表达量较mimic-NC-exo组显著升高，差异有统计学意义（t=7.311，P=0.002）（图3A）。CCK-8增生分析法结果显示，共培养后72 h，对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组A值分别为1.00±0.10、1.60±0.10、1.80±0.12、2.40±0.20。与对照组比较，外泌体组RPE细胞增生能力提高，差异有统计学意义（F=9.726，P=0.031）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞增生能力较mimic-NC-exo组增强，差异有统计学意义（F=10.949，P=0.012）（图3B）。
图3
MSC来源的外泌体miR-183对体外RPE细胞增生的影响。3A示对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组转染MSC外泌体与RPE细胞共培养后miR-183 mRNA相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。3B示4组间不同时间A值比较（n=3）。*与对照组比较，#与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。MSC：骨髓间充质干细胞；RPE：视网膜色素上皮
2.4 BMSC来源的外泌体miR-183对rd10小鼠RPE细胞凋亡的影响
荧光显微镜观察发现，外泌体组RPE细胞凋亡数量较对照组减少，差异有统计学意义（t=4.571，P=0.002）；miR-183-mimic-exo组RPE细胞凋亡数量较mimic-NC-exo组减少，差异有统计学意义（t=4.954，P=0.001）（图4）。
图4
BMSC来源的外泌体miR-183对rd10小鼠视网膜组织细胞凋亡的影响。4A示荧光显微镜像。活细胞采用DAPI染色显示蓝色荧光，凋亡细胞采用TUNEL染色显示绿色荧光 ×200。4B示4组间凋亡细胞比较（n=5）。1～4分别为对照组、外泌体组、minic-NC-exo组、miR-183-minic-exo组。*与对照组比较，#与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。BMSC：骨髓间充质干细胞；rd10：视网膜变性10；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；TUNEL：原位末端标记法
2.5 miR-183与RDH11具有靶向关系
双荧光素酶报告基因实验验证结果显示，生物信息学网站查询miR-183与RDH11具有结合位点；与mimic-NC组比较，miR-183-mimic组野生型WT-RDH11共转染组的荧光素酶相对活性下降，差异有统计学意义（t=5.476，P=0.005）；MUT-RDH11的荧光素酶相对活性差异无统计学意义（t=0.316，P＞0.05）（图5）。
图5
miR-183与RDH11具有靶向关系。5A示生物信息学Jefferson网站预测miR-183与RDH11的结合位点。5B示mimic-NC组、miR-183-mimic组野生型WT-RDH11与MUT-RDH11的荧光素酶相对活性比较（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。RDH11：视网膜脱氢酶11
2.6 miR-183可靶向调控RDH11的表达
与mimic-NC组比较，miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（t=5.361、6.591，P=0.006、0.003）。共培养后，与对照组比较，外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量差异无统计学意义（t=0.169、1.134，P=0.874、0.320）；与mimic-NC-exo组比较，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量均降低，差异有统计学意义（t=5.554、5.546，P=0.005、0.005）（图6）。
图6
miR-183可靶向调控RDH11的表达。6A、6B分别示空白组、mimic-NC组、miR-183-mimic组外泌体中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC组比较，P＜0.05。6C、6D分别示对照组、外泌体组、mimic-NC-exo组、miR-183-mimic-exo组转染MSC外泌体与RPE细胞共培养后RDH11 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3）。*与mimic-NC-exo组比较，P＜0.05。RDH11：视网膜脱氢酶11；MSC：骨髓间充质干细胞；RPE：视网膜色素上皮；GAPDH：磷酸甘油醛脱氢酶
3 讨论
RP是一种慢性、进行性、遗传性以及营养不良性视网膜退行性变。既往研究已证实，RP病理改变中，杆状细胞外节盘膜早期即已丧失；细胞外盘膜崩解物殖留，堆积形成一层障碍物，影响营养物质从脉络膜到达视网膜的运转，从而引起视细胞进行性营养不良及逐渐的变性和消失[11-12]。RPE细胞可组成RPE层与脉络膜相连，具有支持和营养光感受器细胞、遮光、散热以及再生和修复等作用[13]。因此，RPE细胞的消失可能是RP进展的原因之一。间充质干细胞是一种多功能干细胞，具有干细胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，在临床应用较多。BMSC可减少视网膜光感受器细胞凋亡，对视网膜损伤具有保护作用[14-15]。外泌体是几乎所有细胞类型都可产生的一种膜性囊泡，是细胞间通讯的关键信使，干细胞来源的外泌体包含多种功能蛋白和信号脂质，通过与细胞膜融合将脂质、核酸、蛋白质等多种生物活性物质传递给受体细胞，引起受体细胞功能或活性改变，发挥细胞间物质交换和信息交流的作用[16]。
miRNAs是一类小的、非编码RNA分子，代表着基因表达的重要调节因子。在细胞指定过程中扮演着“微调子”的角色，以确保在细胞分化的特定阶段精确的基因表达[17]。Kinoshita等[18]研究表明，miR-183在视网膜组织形态发生中起着至关重要的作用，可保护视网膜，减少视网膜细胞损伤。多项研究表明，BMSC或BMSC来源的外泌体可恢复或促进miR-183的表达，进而一定程度的减少视网膜变性的发生[19-21]。RDH11存在于小鼠视网膜组织中，可参与氧化应激的调节且是RP的诱发基因之一[4-5]。Xie等[22]研究发现，RDH11的有害突变会导致新的RP综合征。本研究从BMSC中提取外泌体，使用透射电子显微镜、纳米颗粒示踪及Western blot进行鉴定，转染miR-183模拟物后miR-183-mimics组miR-183表达显著上升，rd10小鼠RPE细胞中miR-183表达下调，RDH11表达上调。BMSC来源的外泌体与RPE细胞共培养24 h时，外泌体成功进入RPE细胞；与对照组比较，外泌体组RPE细胞中miR-183表达无明显变化，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中miR-183表达较mimic-NC-exo组显著升高；外泌体组RPE细胞增生能力提高，miR-183-mimic-exo组RPE细胞增生能力较mimic-NC-exo组增强。这提示BMSC来源的外泌体转染miR-183成功，RPE细胞成功摄入外泌体且BMSC来源的外泌体miR-183能促进RPE细胞的增生。
本研究结果显示，与对照组比较，外泌体组视网膜组织细胞凋亡较少；miR-183-mimic-exo组视网膜组织细胞凋亡较mimic-NC-exo组减少。这提示BMSC来源的外泌体miR-183能减少视网膜组织细胞的凋亡。生物信息学网站查询miR-183与RDH11具有结合位点，双荧光素酶报告结果显示miR-183与RDH11具有靶向关系。与mimic-NC组比较，miR-183-mimic mRNA及蛋白相对表达量均降低；BMSC来源的外泌体与RPE细胞共培养后，外泌体组RPE细胞中RDH11 mRNA和蛋白相对表达量与对照组比较无明显变化，miR-183-mimic-exo组RPE细胞中RDH11 mRNA及蛋白相对表达量较mimic-NC-exo组显著降低。该结果提示miR-183能靶向调控RDH11的表达。
本研究结果表明，rd10小鼠视网膜RPE细胞中，miR-183表达下调，RDH11表达上调；miR-183与RDH11具有靶向关系；BMSC来源的外泌体miR-183促进RPE细胞体外增生；注射转染miR-183模拟物的BMSC外泌体减少了rd10小鼠视网膜组织中细胞的凋亡。这说明，从机制上讲，上调BMSC来源的外泌体miR-183可能通过靶向抑制RDH11的表达而抑制RP的发展。
