引用本文: 李媛, 秦廷玉, 郭龙, 李淑珍, 侯习武. miR-142-5p靶向调控叉头转录蛋白O亚族3介导辅助性T细胞17细胞炎性反应促进自身免疫性葡萄膜炎的发展. 中华眼底病杂志, 2021, 37(7): 533-541. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20201203-00602 复制
葡萄膜炎是一种以免疫介导的葡萄膜组织和视网膜损伤为特征的眼内炎症性疾病[1-2]。目前尚未完全阐明该疾病潜在机制。miRNA是小的非编码RNA分子,可充当基因表达转录后调节子,并影响真核生物的众多生物学过程[3]。既往研究已阐明miRNA与葡萄膜炎之间的关系,并发现在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠模型中存在miR-142-5p表达[4-5]。CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞,辅助性T细胞17(Th17)是CD4+T细胞亚群,在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要意义。叉头转录蛋白O亚族3(FOXO3)在适应性免疫应答中起着重要作用,在FOXO3-/-的T细胞中,Th17细胞分化相关的基因被上调且白细胞介素(IL)-17表达增加[6-7],表明FOXO3可能参与了IL-17的产生。因此,本研究通过建立EAU模型大鼠,提取CD4+T细胞,检测细胞中miR-142-5p与FOXO3的表达情况,验证两者之间的靶向关系以及对Th17细胞的相关作用,初步探讨其对葡萄膜炎的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)1177-1191多肽片段(IRBP1177-1191)由上海生工生物公司合成;结核分枝杆菌H37RA[普如汀生物技术(北京)有限公司];异硫氰酸荧光素(FITC)抗小鼠CD4抗体、微珠和autoMACS分离柱(德国Miltenyi Biotec公司);miR-142-5p抑制剂与模拟物及其阴性对照(NC)(广州市锐博生物科技有限公司);FOXO3干扰载体及其NC(海英拜生物科技有限公司);miRNA分离试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);cDNA预混液(美国Life Technologies公司);实时聚合酶链反应(PCR)系统(美国Applied Biosystems公司);SYBR ExScript 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。
1.2 分组和建模
健康雄性Lewis大鼠35只,6~8周龄,体重200~250 g,无特定病原体级,上海加科生物科技有限公司提供(许可证号:沪ICP备15027593号-1)。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定,并获得郑州大学第一附属医院动物伦理委员会许可(伦理编号:201905)。
采用随机数字表法将10只大鼠分为模型组、对照组,每组5只。模型组大鼠以过继免疫方式诱导EAU。IRBP1177-1191 30 μl、结核分枝杆菌H37RA 200 μg、完全弗氏佐剂100 μl、磷酸盐缓冲液100 μl混合成乳剂,于大鼠尾根部和背部皮下注射至少6个点,注射剂量200 μl。对照组大鼠不作任何处理。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙灯显微镜检查,参照文献[8]的标准进行EAU评分。0分:屈光间质透明,可见眼底红色反光;0.5分:虹膜血管扩张;1分:虹膜血管充血和瞳孔收缩异常;2分:前房混浊和红色反光减少;3分:前房中度混浊,但仍可见眼底暗红色反光;4分:前房严重混浊,瞳孔闭锁,眼底不能窥见或眼球突出。免疫后20 d,麻醉处死大鼠,摘除眼球。4%戊二醛固定24 h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚度连续切片,苏木精-伊红(HE)染色。参照文献[8]的标准进行组织病理学分级。0分:无炎症,视网膜结构正常;0.5分:视网膜轻度炎症,有或无光感受器受损;1分:视网膜轻度炎症和(或)光感受器外节受损;2分:视网膜中度炎症和(或)受损部位扩展至外核层;3分:视网膜中重度炎症和(或)受损部位累及到内界膜;4分:视网膜重度炎症和(或)视网膜全层破坏受损。
1.3 CD4+T细胞提取和转染
免疫后21 d,取对照组、模型组大鼠眼球和引流淋巴结制备细胞悬液,分离纯化T细胞。使用结合FITC抗小鼠CD4抗体和涂有抗FITC抗体的微珠组合进行选择,autoMACS分离柱进行分离,藻红蛋白缀合的抗CD4抗体确定分离的细胞纯度。纯化的细胞分为对照组、模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组、si-NC组、si-FOXO3组。对照组、模型组未进行任何转染;miR-142-5p-mimic组、si-FOXO3组分别转染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3;mimic-NC组、si-NC组分别转染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3相应NC。各组CD4+T细胞在Th17极化条件下体外共培养72 h,收集细胞用于进一步分析。
1.4 qRT-PCR检测大鼠CD4+T细胞及眼组织中miR-142-5p、FOXO3及细胞培养上清液中IL-17、IL-22、维甲酸相关孤儿受体γ(RORγ)mRNA相对表达量
miRNA分离试剂盒提取总RNA;高容量RNA至cDNA预混液合成cDNA;SYBR ExScript qRT-PCR试剂盒于实时PCR系统上进行qRT-PCR。U6作为miR-142-5p内参照,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为FOXO3、IL-17、IL-22、RORγ的内参照。引物由上海生工生物公司合成(表1)。标准SYBR-Green qRT-PCR试剂盒检测表达,相对表达式计算使用相对量化方程2−ΔΔCt。细胞实验重复3次,动物实验重复5次,均取平均值。

1.5 生物信息学网站及双荧光素酶预测miR-142-5p与FOXO3的靶向关系
293T细胞与FOXO3 3-UTR WT/Mut载体和内部对照pRenilla-TK以及hsa-miR-142-5p的模拟物/抑制剂或相应的NC共转染。2 d后收获细胞,双荧光素报告试剂盒评估荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.6 流式细胞仪检测CD4+T细胞中IL-17比例
50 ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯、1 mg/ml离子霉素、1 mg/ml布雷菲德菌素A刺激CD4+T细胞4 h,固定、通透过夜。IL-17抗体行细胞内染色。FlowJo软件分析采集的数据。实验重复3次,取平均值。
1.7 EAU评分和组织病理学分级
采用随机数字表法将25只大鼠分为模型组、转染mimic-NC组、转染miR-142-5p- mimic组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组,每组各5只。分别眼周注射模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组、si-NC组、si-FOXO3组细胞悬液50 μg,再次采用过继免疫方式诱导EAU。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙灯显微镜检查,参照文献[8]的标准进行EAU评分;免疫后20 d,麻醉处死所有大鼠,摘除眼球,取任意一侧眼组织进行HE染色,参照文献[8]的标准进行组织病理学分级。
1.8 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料均以均数±标准差(±s)表示。三组间比较行单因素方差分析;两组间比较行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-142-5p在EAU大鼠细胞中的表达
免疫后4、8、12、16、20 d,模型组大鼠均出现不同程度EAU表现,随时间延长,其症状加重(图1)。qRT-PCR检测结果显示,模型组、对照组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量分别为2.63±0.29、1.00±0.25,Th17细胞极化状态下miR-142-5p mRNA相对表达量分别为2.51±0.27、1.00±0.30。模型组大鼠CD4+T细胞中、Th17细胞极化状态下miR-142-5p mRNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(t=7.374、7.108,P=0.002、0.002)。

2.2 miR-142-5p促进EAU大鼠衍生的Th17细胞发育
qRT-PCR检查结果显示,模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量分别为1.00±0.25、0.96±0.27、2.72±0.38。与mimic-NC组比较,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量显著上升,差异有统计学意义(t=6.540,P=0.003)(图2)。与模型组、mimic-NC组比较,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞培养上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相对表达量显著增加,差异有统计学意义(F=26.110、6.292、5.269,P=0.001、0.034、0.048)(表2,图3)。




流式细胞仪检测结果显示,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中IL-17+比例较模型组、mimic-NC组明显升高(图4)。

qRT-PCR检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织中miR-142-5p mRNA相对表达量较模型组、转染mimic-NC组显著上升;与转染mimic-NC组比较,差异有统计学意义(t=6.690,P=0.000)(图5)。模型组、转染mimic-NC组、转染miR-142-5p-mimic组大鼠免疫后随时间延长,EAU评分均呈上升趋势。光学显微镜观察发现,转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织较模型组、转染mimic-NC组损伤加重(图6A~6C)。转染miR-142-5p-mimic组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染mimic-NC组、模型组显著升高,差异均有统计学意义(t=5.633、6.286,P<0.05)(图6D,6E)。


生物信息学网站预测FOXO3为miR-142-5p的直接靶点,并在FOXO3 mRNA的3'UTR区域显示miR-142-5p的推测结合位点(图7A)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic显著降低野生型FOXO3 3'UTR构建物的荧光素酶活性(t=9.526,P=0.001),但对FOXO3-3'UTR构建体的突变型无影响(图7B)。

2.3 miR-142-5p通过FOXO3促进EAU大鼠Th17细胞发育及炎性反应的发展
qRT-PCR检测结果显示,模型组、对照组大鼠CD4+T细胞中、Th17细胞极化状态下FOXO3 mRNA相对表达量分别为0.53±0.05、1.00±0.06和0.58±0.06、1.00±0.05;模型组大鼠CD4+T细胞、Th17细胞极化状态下FOXO3 mRNA相对表达量均低于对照组,差异有统计学意义(t=10.423、9.314,P=0.001、0.001)。转染mimic-NC组、转染miR-142-5p-mimic组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量分别为1.05±0.07、0.48±0.05、1.04±0.06、0.42±0.05;与模型组比较,转染miR-142-5p-mimic组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(t=14.888、16.605,P<0.05);与转染mimic-NC组、转染si-NC组比较,转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量显著下降,差异有统计学意义(t=14.816、17.751,P<0.05)(图8)。与模型组、si-NC组比较,si-FOXO3组大鼠CD4+T细胞培养上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相对表达量显著增加,差异有统计学意义(F=55.660、10.490、11.430,P<0.05)(表3,图9)




流式细胞仪检测结果显示,si-FOXO3组大鼠CD4+T细胞中IL-17+比例较模型组、si-NC组明显升高(图10)。

2.4 miR-142-5p通过降低FOXO3的表达加剧EAU大鼠病情的发展
qRT-PCR检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织CD4+T细胞中FOXO3 mRNA相对表达量分别为0.45±0.06、0.40±0.07,较转染mimic-NC组、转染si-NC组显著下降,差异有统计学意义(t=14.552、14.456,P<0.05)(图11)。模型组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组大鼠免疫后随时间延长,EAU评分均呈上升趋势。光学显微镜观察发现,转染si-FOXO3组大鼠眼组织损伤明显加重(图12A~12C)。与转染si-NC组比较,转染si-FOXO3组大鼠EAU评分与组织病理学分级均显著升高,差异有统计学意义(t=6.852、6.635,P<0.05)(图12D,12E)。


3 讨论
葡萄膜炎是由于感染或自身免疫性疾病以及自身炎症所引起,其病程长,是致盲的重要原因之一[9-10]。病原性Th17细胞是自身免疫性疾病的关键驱动因子,是CD4+T细胞亚群,可作为临床诊断或治疗自身免疫性疾病的潜在靶点[11]。miRNA能够通过转录后调节基因表达,通过与互补靶标mRNA结合,抑制mRNA翻译成蛋白质或诱导mRNA降解,参与疾病的进程[12]。研究发现,miRNA可调控自身反应性Th17细胞应答,改善EAU的损伤程度[13-15]。
Han等[16]、Talebi等[17]研究发现,miR-142-5p参与免疫反应与炎症反应调节。miR-142-5p能促进视网膜母细胞瘤细胞增生和上皮-间质转化[18]。为探讨miR-142-5p对葡萄膜炎的作用,本研究建立EAU模型,结果显示模型组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p表达高于对照组大鼠。这说明miR-142-5p在EAU大鼠细胞中上调,对从EAU大鼠新鲜分离的CD4+T细胞进行miR-142-5p模拟物转染,miR-142-5p表达显著上调。为评估miR-142-5p是否能够在体外直接影响Th17细胞发育,本研究将转染的CD4+T细胞在Th17细胞极化条件下共培养,发现miR-142-5p-mimic促进Th17细胞表面标记物IL-17的产生,同时IL-22、RORγ表达也显著增加。IL-17、IL-22是CD4+T细胞及Th17细胞的主要分泌因子,RORγ为主要的转录因子,它们的增加提示miR-142-5p能促进EAU大鼠衍生的Th17细胞发育。转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织中miR-142-5p表达显著上升;各组大鼠EAU评分均呈上升趋势,转染miR-142-5p-mimic组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染mimic-NC组与模型组显著升高。这说明上调miR-142-5p加剧EAU严重程度。
为研究miR-142-5p的下游调控机制,生物信息学网站预测FOXO3是miR-142-5p的直接靶点,并在FOXO3 mRNA的3'UTR区域显示了miR-142-5p的推测结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic显著降低野生型FOXO3 3'UTR构建物的荧光素酶活性,但对FOXO3-3'UTR构建体的突变型无影响。这些结果表明FOXO3是miR-142-5p的直接靶点。Wei等[19]研究表明,在EAU大鼠体内存在FOXO3表达,并通过调控其表达对EAU的病情产生影响。经本研究发现,在EAU大鼠细胞中,FOXO3表达降低。转染miR-142-5p-mimic及si-FOXO3后FOXO3表达显著下降,转染si-FOXO3组Th17细胞标记物IL-17、IL-22以及RORγ的表达较转染si-NC组增加。这说明miR-142-5p可通过FOXO3促进EAU大鼠Th17细胞发育及炎性反应的发展。转染miR-142-5p-mimic组和si-FOXO3组大鼠眼组织CD4+T细胞中FOXO3表达显著下降;各组大鼠EAU评分均呈上升趋势,转染si-FOXO3组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染si-NC组、模型组显著升高。这提示miR-142-5p通过降低FOXO3的表达加剧EAU大鼠病情的发展。
本研究结果表明,EAU大鼠细胞中,miR-142-5p表达上调,FOXO3表达下调;miR-142-5p与FOXO3具有靶向关系;miR-142-5p调控Th17细胞体外发育;转染miR-142-5p模拟物可促进EAU发展。机制上,miR-142-5p靶向调控FOXO3的表达促进了Th17细胞相关炎性因子的发展,引起炎性反应,从而促进自身免疫性葡萄膜炎的发展。
葡萄膜炎是一种以免疫介导的葡萄膜组织和视网膜损伤为特征的眼内炎症性疾病[1-2]。目前尚未完全阐明该疾病潜在机制。miRNA是小的非编码RNA分子,可充当基因表达转录后调节子,并影响真核生物的众多生物学过程[3]。既往研究已阐明miRNA与葡萄膜炎之间的关系,并发现在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)大鼠模型中存在miR-142-5p表达[4-5]。CD4细胞是人体免疫系统中的一种重要免疫细胞,辅助性T细胞17(Th17)是CD4+T细胞亚群,在自身免疫性疾病和机体防御反应中具有重要意义。叉头转录蛋白O亚族3(FOXO3)在适应性免疫应答中起着重要作用,在FOXO3-/-的T细胞中,Th17细胞分化相关的基因被上调且白细胞介素(IL)-17表达增加[6-7],表明FOXO3可能参与了IL-17的产生。因此,本研究通过建立EAU模型大鼠,提取CD4+T细胞,检测细胞中miR-142-5p与FOXO3的表达情况,验证两者之间的靶向关系以及对Th17细胞的相关作用,初步探讨其对葡萄膜炎的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)1177-1191多肽片段(IRBP1177-1191)由上海生工生物公司合成;结核分枝杆菌H37RA[普如汀生物技术(北京)有限公司];异硫氰酸荧光素(FITC)抗小鼠CD4抗体、微珠和autoMACS分离柱(德国Miltenyi Biotec公司);miR-142-5p抑制剂与模拟物及其阴性对照(NC)(广州市锐博生物科技有限公司);FOXO3干扰载体及其NC(海英拜生物科技有限公司);miRNA分离试剂盒(美国Thermo Fisher Scientific公司);cDNA预混液(美国Life Technologies公司);实时聚合酶链反应(PCR)系统(美国Applied Biosystems公司);SYBR ExScript 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]。
1.2 分组和建模
健康雄性Lewis大鼠35只,6~8周龄,体重200~250 g,无特定病原体级,上海加科生物科技有限公司提供(许可证号:沪ICP备15027593号-1)。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定,并获得郑州大学第一附属医院动物伦理委员会许可(伦理编号:201905)。
采用随机数字表法将10只大鼠分为模型组、对照组,每组5只。模型组大鼠以过继免疫方式诱导EAU。IRBP1177-1191 30 μl、结核分枝杆菌H37RA 200 μg、完全弗氏佐剂100 μl、磷酸盐缓冲液100 μl混合成乳剂,于大鼠尾根部和背部皮下注射至少6个点,注射剂量200 μl。对照组大鼠不作任何处理。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙灯显微镜检查,参照文献[8]的标准进行EAU评分。0分:屈光间质透明,可见眼底红色反光;0.5分:虹膜血管扩张;1分:虹膜血管充血和瞳孔收缩异常;2分:前房混浊和红色反光减少;3分:前房中度混浊,但仍可见眼底暗红色反光;4分:前房严重混浊,瞳孔闭锁,眼底不能窥见或眼球突出。免疫后20 d,麻醉处死大鼠,摘除眼球。4%戊二醛固定24 h,梯度酒精脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,4 μm厚度连续切片,苏木精-伊红(HE)染色。参照文献[8]的标准进行组织病理学分级。0分:无炎症,视网膜结构正常;0.5分:视网膜轻度炎症,有或无光感受器受损;1分:视网膜轻度炎症和(或)光感受器外节受损;2分:视网膜中度炎症和(或)受损部位扩展至外核层;3分:视网膜中重度炎症和(或)受损部位累及到内界膜;4分:视网膜重度炎症和(或)视网膜全层破坏受损。
1.3 CD4+T细胞提取和转染
免疫后21 d,取对照组、模型组大鼠眼球和引流淋巴结制备细胞悬液,分离纯化T细胞。使用结合FITC抗小鼠CD4抗体和涂有抗FITC抗体的微珠组合进行选择,autoMACS分离柱进行分离,藻红蛋白缀合的抗CD4抗体确定分离的细胞纯度。纯化的细胞分为对照组、模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组、si-NC组、si-FOXO3组。对照组、模型组未进行任何转染;miR-142-5p-mimic组、si-FOXO3组分别转染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3;mimic-NC组、si-NC组分别转染miR-142-5p-mimic、si-FOXO3相应NC。各组CD4+T细胞在Th17极化条件下体外共培养72 h,收集细胞用于进一步分析。
1.4 qRT-PCR检测大鼠CD4+T细胞及眼组织中miR-142-5p、FOXO3及细胞培养上清液中IL-17、IL-22、维甲酸相关孤儿受体γ(RORγ)mRNA相对表达量
miRNA分离试剂盒提取总RNA;高容量RNA至cDNA预混液合成cDNA;SYBR ExScript qRT-PCR试剂盒于实时PCR系统上进行qRT-PCR。U6作为miR-142-5p内参照,甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为FOXO3、IL-17、IL-22、RORγ的内参照。引物由上海生工生物公司合成(表1)。标准SYBR-Green qRT-PCR试剂盒检测表达,相对表达式计算使用相对量化方程2−ΔΔCt。细胞实验重复3次,动物实验重复5次,均取平均值。

1.5 生物信息学网站及双荧光素酶预测miR-142-5p与FOXO3的靶向关系
293T细胞与FOXO3 3-UTR WT/Mut载体和内部对照pRenilla-TK以及hsa-miR-142-5p的模拟物/抑制剂或相应的NC共转染。2 d后收获细胞,双荧光素报告试剂盒评估荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。
1.6 流式细胞仪检测CD4+T细胞中IL-17比例
50 ng/ml佛波醇肉豆蔻酸酯、1 mg/ml离子霉素、1 mg/ml布雷菲德菌素A刺激CD4+T细胞4 h,固定、通透过夜。IL-17抗体行细胞内染色。FlowJo软件分析采集的数据。实验重复3次,取平均值。
1.7 EAU评分和组织病理学分级
采用随机数字表法将25只大鼠分为模型组、转染mimic-NC组、转染miR-142-5p- mimic组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组,每组各5只。分别眼周注射模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组、si-NC组、si-FOXO3组细胞悬液50 μg,再次采用过继免疫方式诱导EAU。免疫后4、8、12、16、20 d行裂隙灯显微镜检查,参照文献[8]的标准进行EAU评分;免疫后20 d,麻醉处死所有大鼠,摘除眼球,取任意一侧眼组织进行HE染色,参照文献[8]的标准进行组织病理学分级。
1.8 统计学方法
采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量资料均以均数±标准差(±s)表示。三组间比较行单因素方差分析;两组间比较行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 miR-142-5p在EAU大鼠细胞中的表达
免疫后4、8、12、16、20 d,模型组大鼠均出现不同程度EAU表现,随时间延长,其症状加重(图1)。qRT-PCR检测结果显示,模型组、对照组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量分别为2.63±0.29、1.00±0.25,Th17细胞极化状态下miR-142-5p mRNA相对表达量分别为2.51±0.27、1.00±0.30。模型组大鼠CD4+T细胞中、Th17细胞极化状态下miR-142-5p mRNA相对表达量均高于对照组,差异有统计学意义(t=7.374、7.108,P=0.002、0.002)。

2.2 miR-142-5p促进EAU大鼠衍生的Th17细胞发育
qRT-PCR检查结果显示,模型组、mimic-NC组、miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量分别为1.00±0.25、0.96±0.27、2.72±0.38。与mimic-NC组比较,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p mRNA相对表达量显著上升,差异有统计学意义(t=6.540,P=0.003)(图2)。与模型组、mimic-NC组比较,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞培养上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相对表达量显著增加,差异有统计学意义(F=26.110、6.292、5.269,P=0.001、0.034、0.048)(表2,图3)。




流式细胞仪检测结果显示,miR-142-5p-mimic组大鼠CD4+T细胞中IL-17+比例较模型组、mimic-NC组明显升高(图4)。

qRT-PCR检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织中miR-142-5p mRNA相对表达量较模型组、转染mimic-NC组显著上升;与转染mimic-NC组比较,差异有统计学意义(t=6.690,P=0.000)(图5)。模型组、转染mimic-NC组、转染miR-142-5p-mimic组大鼠免疫后随时间延长,EAU评分均呈上升趋势。光学显微镜观察发现,转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织较模型组、转染mimic-NC组损伤加重(图6A~6C)。转染miR-142-5p-mimic组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染mimic-NC组、模型组显著升高,差异均有统计学意义(t=5.633、6.286,P<0.05)(图6D,6E)。


生物信息学网站预测FOXO3为miR-142-5p的直接靶点,并在FOXO3 mRNA的3'UTR区域显示miR-142-5p的推测结合位点(图7A)。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic显著降低野生型FOXO3 3'UTR构建物的荧光素酶活性(t=9.526,P=0.001),但对FOXO3-3'UTR构建体的突变型无影响(图7B)。

2.3 miR-142-5p通过FOXO3促进EAU大鼠Th17细胞发育及炎性反应的发展
qRT-PCR检测结果显示,模型组、对照组大鼠CD4+T细胞中、Th17细胞极化状态下FOXO3 mRNA相对表达量分别为0.53±0.05、1.00±0.06和0.58±0.06、1.00±0.05;模型组大鼠CD4+T细胞、Th17细胞极化状态下FOXO3 mRNA相对表达量均低于对照组,差异有统计学意义(t=10.423、9.314,P=0.001、0.001)。转染mimic-NC组、转染miR-142-5p-mimic组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量分别为1.05±0.07、0.48±0.05、1.04±0.06、0.42±0.05;与模型组比较,转染miR-142-5p-mimic组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(t=14.888、16.605,P<0.05);与转染mimic-NC组、转染si-NC组比较,转染si-FOXO3组大鼠眼组织中FOXO3 mRNA相对表达量显著下降,差异有统计学意义(t=14.816、17.751,P<0.05)(图8)。与模型组、si-NC组比较,si-FOXO3组大鼠CD4+T细胞培养上清液中IL-17、IL-22、RORγ mRNA相对表达量显著增加,差异有统计学意义(F=55.660、10.490、11.430,P<0.05)(表3,图9)




流式细胞仪检测结果显示,si-FOXO3组大鼠CD4+T细胞中IL-17+比例较模型组、si-NC组明显升高(图10)。

2.4 miR-142-5p通过降低FOXO3的表达加剧EAU大鼠病情的发展
qRT-PCR检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic组、转染si-FOXO3组大鼠眼组织CD4+T细胞中FOXO3 mRNA相对表达量分别为0.45±0.06、0.40±0.07,较转染mimic-NC组、转染si-NC组显著下降,差异有统计学意义(t=14.552、14.456,P<0.05)(图11)。模型组、转染si-NC组、转染si-FOXO3组大鼠免疫后随时间延长,EAU评分均呈上升趋势。光学显微镜观察发现,转染si-FOXO3组大鼠眼组织损伤明显加重(图12A~12C)。与转染si-NC组比较,转染si-FOXO3组大鼠EAU评分与组织病理学分级均显著升高,差异有统计学意义(t=6.852、6.635,P<0.05)(图12D,12E)。


3 讨论
葡萄膜炎是由于感染或自身免疫性疾病以及自身炎症所引起,其病程长,是致盲的重要原因之一[9-10]。病原性Th17细胞是自身免疫性疾病的关键驱动因子,是CD4+T细胞亚群,可作为临床诊断或治疗自身免疫性疾病的潜在靶点[11]。miRNA能够通过转录后调节基因表达,通过与互补靶标mRNA结合,抑制mRNA翻译成蛋白质或诱导mRNA降解,参与疾病的进程[12]。研究发现,miRNA可调控自身反应性Th17细胞应答,改善EAU的损伤程度[13-15]。
Han等[16]、Talebi等[17]研究发现,miR-142-5p参与免疫反应与炎症反应调节。miR-142-5p能促进视网膜母细胞瘤细胞增生和上皮-间质转化[18]。为探讨miR-142-5p对葡萄膜炎的作用,本研究建立EAU模型,结果显示模型组大鼠CD4+T细胞中miR-142-5p表达高于对照组大鼠。这说明miR-142-5p在EAU大鼠细胞中上调,对从EAU大鼠新鲜分离的CD4+T细胞进行miR-142-5p模拟物转染,miR-142-5p表达显著上调。为评估miR-142-5p是否能够在体外直接影响Th17细胞发育,本研究将转染的CD4+T细胞在Th17细胞极化条件下共培养,发现miR-142-5p-mimic促进Th17细胞表面标记物IL-17的产生,同时IL-22、RORγ表达也显著增加。IL-17、IL-22是CD4+T细胞及Th17细胞的主要分泌因子,RORγ为主要的转录因子,它们的增加提示miR-142-5p能促进EAU大鼠衍生的Th17细胞发育。转染miR-142-5p-mimic组大鼠眼组织中miR-142-5p表达显著上升;各组大鼠EAU评分均呈上升趋势,转染miR-142-5p-mimic组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染mimic-NC组与模型组显著升高。这说明上调miR-142-5p加剧EAU严重程度。
为研究miR-142-5p的下游调控机制,生物信息学网站预测FOXO3是miR-142-5p的直接靶点,并在FOXO3 mRNA的3'UTR区域显示了miR-142-5p的推测结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果显示,转染miR-142-5p-mimic显著降低野生型FOXO3 3'UTR构建物的荧光素酶活性,但对FOXO3-3'UTR构建体的突变型无影响。这些结果表明FOXO3是miR-142-5p的直接靶点。Wei等[19]研究表明,在EAU大鼠体内存在FOXO3表达,并通过调控其表达对EAU的病情产生影响。经本研究发现,在EAU大鼠细胞中,FOXO3表达降低。转染miR-142-5p-mimic及si-FOXO3后FOXO3表达显著下降,转染si-FOXO3组Th17细胞标记物IL-17、IL-22以及RORγ的表达较转染si-NC组增加。这说明miR-142-5p可通过FOXO3促进EAU大鼠Th17细胞发育及炎性反应的发展。转染miR-142-5p-mimic组和si-FOXO3组大鼠眼组织CD4+T细胞中FOXO3表达显著下降;各组大鼠EAU评分均呈上升趋势,转染si-FOXO3组大鼠EAU评分与组织病理学分级均较转染si-NC组、模型组显著升高。这提示miR-142-5p通过降低FOXO3的表达加剧EAU大鼠病情的发展。
本研究结果表明,EAU大鼠细胞中,miR-142-5p表达上调,FOXO3表达下调;miR-142-5p与FOXO3具有靶向关系;miR-142-5p调控Th17细胞体外发育;转染miR-142-5p模拟物可促进EAU发展。机制上,miR-142-5p靶向调控FOXO3的表达促进了Th17细胞相关炎性因子的发展,引起炎性反应,从而促进自身免疫性葡萄膜炎的发展。