视网膜微血管功能失调、炎症反应过度激活以及神经元的退行性病变是糖尿病视网膜病变（DR）的主要发病机制。环状RNA（circRNA）是一类主要由前体RNA经剪切加工后具有特殊环状结构的内源性非编码RNA，其广泛存在于视网膜中并参与各种眼底疾病的发生发展。已有研究表明，circRNA在DR视网膜组织中存在异常表达，并且其可作为miRNA的“海绵”，通过参与视网膜微血管功能失调、炎症反应及神经元退行性病变过程影响DR的发生发展。未来，对circRNA在DR中的探索将深入阐明DR的病理生理过程，使其有望成为DR诊断的生物标志物及治疗的分子靶点，从而实现DR早期诊断及精准治疗的目标。
引用本文： 陆辰, 邵珺. 环状RNA在糖尿病视网膜病变中的作用研究进展. 中华眼底病杂志, 2022, 38(1): 77-80. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210416-00197 复制
近年来有研究发现，糖尿病患者血清中多种环状RNA（circRNA）含量显著升高[1]。circRNA广泛存在于哺乳动物细胞中，是一类主要由前体RNA经剪切加工后具有特殊的环状结构且不具有5’端帽结构及3’端多聚A尾的内源性非编码RNA，具有多样性[2]。有研究发现，糖尿病视网膜病变（DR）患者的玻璃体液中，circRNA表达与非糖尿病患者相比也呈现出显著性差异[3]。这说明circRNA可能作为诊断DR的一种新的生物学标志，为深入探究DR的发病机制提供了新的思路。现就circRNA在DR中的研究进展作一综述。
1 circRNA作为DR诊断的分子标记物
circRNA表现出参与多种疾病发生发展的特点，其中包括肿瘤、血管性疾病及神经系统疾病等[4-8]。近年有研究表明，circRNA在正常眼组织及眼的病理性进程中均呈现出差异性表达，参与了眼表疾病、白内障、青光眼和眼底疾病等病理发展过程[9-11]。视网膜组织中circRNA的表达模式十分复杂。Sun等[12]发现，circRNA在人视网膜中广泛存在，并发挥不同的调控作用，如circPDE4B能够调控细胞的增生。Gu等[1]收集DR患者血浆以测定其中circRNA表达谱，发现30种circRNA表达量显著性上调，如has_circRNA_063981、has_circRNA_404457等。Zhang等[13]对DR患者视网膜、增生膜、血液及玻璃体组织的总RNA表达谱进行测定并分析，发现529种circRNA发生特异性表达量改变，包括356种上调的circRNA及173种下调的circRNA，其中circ_0005015在玻璃体组织、血浆及病理性视网膜前纤维血管膜中表达呈显著性上调，且参与了视网膜血管内皮的功能调控。He等[3]通过测定DR患者玻璃体液中circRNA的表达谱也发现多种circRNA表达量发生了改变，包括122种上调的circRNA和9种下调的circRNA。Liu等[14]在DR患者视网膜前膜中也发现了一种参与DR血管内皮细胞功能失调机制的circRNA，即cZNF609，其表达量显著性高于非糖尿病患者。Liu等[15]发现，DR患者视网膜前膜中has_circ_0002570的含量显著升高。与之类似，Shan等[16]发现DR患者血浆及房水中circHIPK3表达量显著升高。Wu等[17]发现，DR患者全血标本中circ_0001953表达量显著升高，并且存在较高的灵敏度和特异性。这些研究结果均说明，circRNA表达量的特异性变化在DR病理生理中可能起到一定的作用，其与DR发病机制之间的关系值得探究，这有助于进一步阐明DR发病及进展的分子机制，且其具有作为诊断DR的特异性生物标志物的潜能，为DR的治疗提供新的研究方向。这些circRNA有望于成为特异性的生物学标志及治疗靶标用于DR患者的诊断及治疗。
2 circRNA在DR血管功能失调中发挥的作用
DR的病理生理改变主要表现为视网膜血管结构及功能的异常，包括视网膜血管通透性增高、血流灌注减少及新生血管形成，并最终导致视网膜的形态学改变及功能丧失[18]。在DR的病理生理过程中，视网膜血管功能异常占据了重要地位，但其背后的分子机制尚未完全阐明，现有的包括血管内皮生长因子（VEGF）相关通路、氧化应激相关通路和炎症反应等[19]。circRNA具有多种功能，其中包括充当miRNA“海绵”，对相应的miRNA起负调控作用。circRNA富含miRNA的结合位点，可以通过碱基互补配对与miRNA的靶序列相结合，进而阻断miRNA的下游通路，对miRNA的功能起到靶向抑制作用，这一作用被称为miRNA的海绵作用[20]。研究发现，circRNA的海绵作用在生物体中具有普遍性，大量内源性circRNA可以有效地充当miRNA“海绵”，通过丰度的变化对基因表达发挥调控作用[20]。circRNA的海绵作用在DR视网膜血管功能异常背后的分子网络机制中的影响，近年来逐步得到重视和阐述。
视网膜微血管内皮细胞形态及功能状态的改变在DR视网膜血管异常中发挥重要作用。Zhu等[21]发现，在视网膜中特异性大量表达的miR-20b-5p，其在DR患者视网膜中呈高表达，通过调控激活素膜结合抑制因子基因影响视网膜微血管内皮细胞的功能，在高葡萄糖状态下促进了视网膜微血管内皮细胞的迁移及血管形成，而circDMNT3B即为发挥充当miR-20b-5p海绵作用的circRNA。这提示，circDMNT3在糖尿病状态下呈现低表达，因此相应地对miR-20b-5p的海绵作用被削弱，进而促进了视网膜微血管内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，最终导致DR患者视网膜纤维血管膜的形成。有研究在糖尿病模型大鼠玻璃体内注射腺相关病毒-DJ-circDNMT3B以上调circDNMT3B在眼球内的含量，发现大鼠视网膜异常血管生成及视力损伤均被有效缓解[21]。Shan等[16]发现，circHIPK3在DR视网膜内皮细胞中大量表达，并通过抑制miR-30a的功能，发挥海绵作用，从而导致内皮增生及血管功能异常。circHIPK3的表达量在DR患者视网膜病理性纤维血管膜中显著上调；而circHIPK3沉默后，异常的毛细血管生成减少，高葡萄糖诱导的视网膜血管渗漏也随之缓解，同时一系列炎症因子如白细胞介素（IL）-2、VEGF-C、卷曲蛋白4、WNT家族蛋白2等的表达量也均被下调。DR患者circHIPK3的表达量上调促使了视网膜血管内皮细胞的表型改变，进而发生视网膜血管内皮细胞的增生、迁移和重塑，造成血管的渗透性增高及功能异常。Zhang等[13]对DR患者视网膜组织中的总circRNA进行分析，发现视网膜纤维血管膜、外周血浆及玻璃体组织中has_circ_0005015表达量均显著上调；进一步研究发现，has_circ_0005015作为miRNA“海绵”，抑制miR-519d-3p活性，进而通过上调基质金属蛋白酶（MMP）-2、信号传导蛋白与转录激活物、X-连锁凋亡抑制蛋白等基因的表达，促进内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，造成视网膜血管的功能异常[13]。Liu等[14]发现，在体内外低氧及高葡萄糖环境的诱导下，cZNF609这一在内皮细胞内大量表达的circRNA表达量显著上调，而cZNF609沉默后，视网膜血管丧失及病理性新生血管形成被有效抑制；进一步研究发现，cZNF609通过抑制miR-615-5p的活性，作为其对应的海绵circRNA，进而抑制肌细胞增强因子2A的表达，发挥在高葡萄糖及低氧条件下对视网膜的病理性作用。在随后对临床样本的circRNA检测中这一结果也被进一步证实。Liu等[14]发现，与对照组相比，DR患者视网膜纤维血管膜及外周血中cZNF609的含量显著升高，而miR-615-5p含量则明显下调。Zou等[22]发现，circCOL1A2及VEGF水平在高葡萄糖作用下的人视网膜血管内皮细胞中呈现高表达。circCOL1A2作为miR-29b的“海绵”，通过吸附circRNA而促进VEGF的表达。circCOL1A2沉默能够通过增强miR-29b表达进而抑制人视网膜血管内皮细胞的增生、迁移、通透性增加及血管生成相关基因的表达。Zou等[22]发现，敲除CircCOL1A2的DR模型小鼠视网膜中VEGF表达量明显降低，且其表达量降低是通过miR-29b的表达上调实现的，其DR病理性新生血管的形成过程也被缓解和抑制。类似地，Liu等[15]也发现，circ_0002570在DR患者中的表达明显升高，其对应的“海绵”受体miR-1243表达量则明显降低。在高葡萄糖内环境中，circ_0002570通过抑制miR-1243的作用上调血管动蛋白的表达，导致视网膜微血管的功能失调。在敲除circ_0002570后，高葡萄糖内环境影响下的视网膜内皮细胞释放炎症介质及VEGF明显减少，内皮细胞增生、迁移及新生血管形成等过程也受到了抑制[15]。这些研究结果均表明，在人视网膜中存在着多种circRNA，在DR进展过程中，某些特定的circRNA表达量发生变化，通过海绵作用抑制对应的miRNA表达，促进视网膜微血管内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，参与DR视网膜血管的异常变化发展。
视网膜毛细血管细胞主要包括内皮细胞及周细胞。除了视网膜微血管内皮细胞的异常外，周细胞的变化也参与了DR的视网膜血管功能异常。在DR进展期，视网膜新生血管的形成不仅有内皮细胞增生、迁移及成熟过程的参与，周细胞的增生与招募也参与其中。周细胞是在毛细血管内皮细胞与基膜之间的一种扁平而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞的基底面，主要起着对管腔的机械支持作用，并可能参与血管生长或再生时的调控[23]。视网膜周细胞的覆盖率明显高于其他的毛细血管，值得注意的是，周细胞变性被认为是糖尿病所引起的视网膜血管功能异常的早期标志[24]。Jiang等[25]发现，在DR患者的玻璃体液呈现高表达的cZNF532，在DR模型小鼠的视网膜毛细血管的周细胞中也呈现高表达。在高葡萄糖刺激下，周细胞内的cZNF532表达上调，并通过作为miR-29a-3p的“海绵”circRNA，诱导神经胶质抗原2、赖氨酰氧化酶样蛋白2及细胞周期依赖性激酶2的表达，促进周细胞的增生及分化，募集周细胞向内皮细胞转化。cZNF532沉默则使高葡萄糖及氧化应激所诱导的周细胞凋亡增多，其向内皮细胞的转化减少。敲除cZNF532加重了视网膜血管周细胞的变性和血管功能失调，而过表达cZNF532则有效缓解了DR的进展，改善了视网膜血管的通透性增高及周细胞的覆盖降低。Liu等[26]也得到了与之相似的研究结果，其发现cPWWP2A过表达可以保护周细胞免受高葡萄糖环境诱导的损伤。在体外实验中，携带cPWWP2A的外泌体直接调控了周细胞的生物学功能。作为miR-579的“海绵”circRNA，cPWWP2A抑制了miR-579的活性并上调血管生成素1、闭锁蛋白及烟酰胺腺苷二核苷酸依赖性去乙酰化酶沉默信息调节因子2相关酶1的表达，促进周细胞向内皮细胞的转化[26]。这说明，周细胞内表达上调的cPWWP2A可通过外泌体从周细胞传递至内皮细胞，对内皮细胞起保护性调控作用。与对照组相比，周细胞内cPWWP2A沉默使得内皮的通透性显著增高[26]。cPWWP2A从周细胞至内皮细胞的传递影响了内皮细胞增生、迁移及新生血管形成的过程。以上研究结果表明，circRNA可作为周细胞与内皮细胞之间的媒介，调控两者在高葡萄糖应急状态下的相互作用，在DR病理状态下造成视网膜微血管的功能失调。周细胞与内皮细胞之间数量及功能的不协调，以及周细胞的增生及招募不足使新生血管的成熟过程受影响，导致病理性新生血管的通透性增高及机械作用差。circRNA在周细胞变性及视网膜微血管功能失调中的作用，为进一步阐明DR的发病机制及创新DR的治疗手段提供了新的思路。
3 circRNA在DR血视网膜外屏障破坏中发挥的作用
血视网膜屏障由内屏障和外屏障组成，其中视网膜毛细血管内皮及其连接构成了内屏障，视网膜色素上皮（RPE）细胞形成了血视网膜外屏障。RPE细胞使视网膜组织液与脉络膜组织液分离，在DR中，RPE细胞的结构和功能失调造成的血视网膜外屏障被破坏及炎症反应使得血管渗出物经破坏的外屏障外漏，在DR发展及患者视力丧失中发挥重要作用[27]。 Li等[28]发现，在高葡萄糖诱导的DR模型RPE细胞中，circRNA_0084043的表达量明显升高，并促进细胞增生，抑制细胞凋亡。circRNA_0084043沉默使得RPE细胞的氧化应激过程被抑制，相应地丙二醛水平被下调，超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化酶活性被激活，肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6及环氧化酶-2等炎症介质释放减少。circRNA_0084043通过调控miR-140-3p，促进细胞凋亡及炎症过程，特别是TNF-α的高表达，参与DR的进展[28]。Sun和Kang[29]也发现，has_circ_0041795的表达量在高葡萄糖诱导下的RPE细胞中显著升高，并促进了细胞凋亡。has_circ_0041795显著上调TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，促进炎症反应，并抑制其下游的miR-646表达，发挥circRNA的海绵作用，并上调VEGF-C的表达，从而在DR进展中发挥作用[29]。而Zhou等[30]发现，糖尿病大鼠RPE细胞中circ-ITCH表达量显著低于对照组。在糖尿病大鼠模型RPE细胞中过表达circ-ITCH，MMP-2、MMP-9及TNF-α的表达均被抑制[30]。作为miR-22的“海绵”circRNA，circ-ITCH在RPE细胞中的低表达促进了miR-22的活性，进而上调了MMP-2、MMP-9及TNF-α的表达，在糖尿病视网膜慢性微血管炎症反应及新生血管形成过程中发挥了重要作用[30]。以上研究结果提示，circRNA的表达量改变在DR发生发展中诱导了RPE细胞凋亡，并通过调控一系列炎症介质的释放进一步影响RPE细胞及视网膜血管内皮细胞的结构及功能，造成了血视网膜屏障的破坏，参与DR的发展。
4 小结与展望
视网膜微血管功能失调、炎症反应过度激活以及神经元的退行性病变是DR的主要发病机制[31]。这三个关键环节相互影响，共同参与了DR病程的进展，但背后具体的调控机制及其在发生过程中的先后顺序目前尚不明确。circRNA广泛存在视网膜中并参与各种眼底疾病的发生发展过程，但对其功能还知之甚少。目前对circRNA的研究主要集中在肿瘤领域，其中具有调控细胞增生作用的circ-ITCH及circHIPK3不仅在肿瘤的分子诊断、靶向治疗及预后判断上有光明的前景，同时也被发现参与了视网膜病变的病理过程[16, 30, 32-33]。circRNA在DR过程中的机制研究逐渐得到重视，其中circPDE4B、cZNF609不仅在视网膜呈特异性高表达，而且被证实参与了细胞增生调节和病理性新生血管形成过程，在DR的分子诊断及靶向治疗方面具有重要的价值[14, 34]。总的来说，针对DR过程中circRNA发挥作用的研究，目前尤以circRNA对高葡萄糖应激内环境下视网膜微血管病变失调的影响最为集中，其他作用机制方面仍有待进一步探索。
现有的对于circRNA参与DR病理生理过程的研究也存在着一些局限与不足：（1）多数实验仅建立在单一细胞系或实验动物层面，特定的circRNA实际在人视网膜中的表达及DR病理过程中的变化不能明确；（2）从DR患者获得的病理标本由于眼科学的特殊性，样本量少且缺乏多中心的样本，结果偏倚难以避免；（3）circRNA的提取、量化和分析方法以及平台的不同，缺乏标准化，各研究之间难以比较；（4）多种与DR相关的circRNA被发现，相互之间缺乏联系，随着目标circRNA的增多，以circRNA为DR诊断生物学标志及治疗靶标的对象选择面临挑战；（5）目前研究主要集中于circRNA在调控视网膜微血管功能失调及炎症反应过度激活中所起的作用，对于circRNA对DR神经退行性病变影响方面的研究依然缺乏。
未来，对circRNA在DR中的探索将深入阐明DR的病理生理过程，在视网膜微血管功能失调、炎症反应尤其是应激状态下神经退行性病变中circRNA所起的作用将进一步完善DR的发病机制。研究的进展及理论的更新有望使circRNA成为早期诊断DR的有效生物学标志，并为DR的精准治疗提供崭新的生物学靶点。
近年来有研究发现，糖尿病患者血清中多种环状RNA（circRNA）含量显著升高[1]。circRNA广泛存在于哺乳动物细胞中，是一类主要由前体RNA经剪切加工后具有特殊的环状结构且不具有5’端帽结构及3’端多聚A尾的内源性非编码RNA，具有多样性[2]。有研究发现，糖尿病视网膜病变（DR）患者的玻璃体液中，circRNA表达与非糖尿病患者相比也呈现出显著性差异[3]。这说明circRNA可能作为诊断DR的一种新的生物学标志，为深入探究DR的发病机制提供了新的思路。现就circRNA在DR中的研究进展作一综述。
1 circRNA作为DR诊断的分子标记物
circRNA表现出参与多种疾病发生发展的特点，其中包括肿瘤、血管性疾病及神经系统疾病等[4-8]。近年有研究表明，circRNA在正常眼组织及眼的病理性进程中均呈现出差异性表达，参与了眼表疾病、白内障、青光眼和眼底疾病等病理发展过程[9-11]。视网膜组织中circRNA的表达模式十分复杂。Sun等[12]发现，circRNA在人视网膜中广泛存在，并发挥不同的调控作用，如circPDE4B能够调控细胞的增生。Gu等[1]收集DR患者血浆以测定其中circRNA表达谱，发现30种circRNA表达量显著性上调，如has_circRNA_063981、has_circRNA_404457等。Zhang等[13]对DR患者视网膜、增生膜、血液及玻璃体组织的总RNA表达谱进行测定并分析，发现529种circRNA发生特异性表达量改变，包括356种上调的circRNA及173种下调的circRNA，其中circ_0005015在玻璃体组织、血浆及病理性视网膜前纤维血管膜中表达呈显著性上调，且参与了视网膜血管内皮的功能调控。He等[3]通过测定DR患者玻璃体液中circRNA的表达谱也发现多种circRNA表达量发生了改变，包括122种上调的circRNA和9种下调的circRNA。Liu等[14]在DR患者视网膜前膜中也发现了一种参与DR血管内皮细胞功能失调机制的circRNA，即cZNF609，其表达量显著性高于非糖尿病患者。Liu等[15]发现，DR患者视网膜前膜中has_circ_0002570的含量显著升高。与之类似，Shan等[16]发现DR患者血浆及房水中circHIPK3表达量显著升高。Wu等[17]发现，DR患者全血标本中circ_0001953表达量显著升高，并且存在较高的灵敏度和特异性。这些研究结果均说明，circRNA表达量的特异性变化在DR病理生理中可能起到一定的作用，其与DR发病机制之间的关系值得探究，这有助于进一步阐明DR发病及进展的分子机制，且其具有作为诊断DR的特异性生物标志物的潜能，为DR的治疗提供新的研究方向。这些circRNA有望于成为特异性的生物学标志及治疗靶标用于DR患者的诊断及治疗。
2 circRNA在DR血管功能失调中发挥的作用
DR的病理生理改变主要表现为视网膜血管结构及功能的异常，包括视网膜血管通透性增高、血流灌注减少及新生血管形成，并最终导致视网膜的形态学改变及功能丧失[18]。在DR的病理生理过程中，视网膜血管功能异常占据了重要地位，但其背后的分子机制尚未完全阐明，现有的包括血管内皮生长因子（VEGF）相关通路、氧化应激相关通路和炎症反应等[19]。circRNA具有多种功能，其中包括充当miRNA“海绵”，对相应的miRNA起负调控作用。circRNA富含miRNA的结合位点，可以通过碱基互补配对与miRNA的靶序列相结合，进而阻断miRNA的下游通路，对miRNA的功能起到靶向抑制作用，这一作用被称为miRNA的海绵作用[20]。研究发现，circRNA的海绵作用在生物体中具有普遍性，大量内源性circRNA可以有效地充当miRNA“海绵”，通过丰度的变化对基因表达发挥调控作用[20]。circRNA的海绵作用在DR视网膜血管功能异常背后的分子网络机制中的影响，近年来逐步得到重视和阐述。
视网膜微血管内皮细胞形态及功能状态的改变在DR视网膜血管异常中发挥重要作用。Zhu等[21]发现，在视网膜中特异性大量表达的miR-20b-5p，其在DR患者视网膜中呈高表达，通过调控激活素膜结合抑制因子基因影响视网膜微血管内皮细胞的功能，在高葡萄糖状态下促进了视网膜微血管内皮细胞的迁移及血管形成，而circDMNT3B即为发挥充当miR-20b-5p海绵作用的circRNA。这提示，circDMNT3在糖尿病状态下呈现低表达，因此相应地对miR-20b-5p的海绵作用被削弱，进而促进了视网膜微血管内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，最终导致DR患者视网膜纤维血管膜的形成。有研究在糖尿病模型大鼠玻璃体内注射腺相关病毒-DJ-circDNMT3B以上调circDNMT3B在眼球内的含量，发现大鼠视网膜异常血管生成及视力损伤均被有效缓解[21]。Shan等[16]发现，circHIPK3在DR视网膜内皮细胞中大量表达，并通过抑制miR-30a的功能，发挥海绵作用，从而导致内皮增生及血管功能异常。circHIPK3的表达量在DR患者视网膜病理性纤维血管膜中显著上调；而circHIPK3沉默后，异常的毛细血管生成减少，高葡萄糖诱导的视网膜血管渗漏也随之缓解，同时一系列炎症因子如白细胞介素（IL）-2、VEGF-C、卷曲蛋白4、WNT家族蛋白2等的表达量也均被下调。DR患者circHIPK3的表达量上调促使了视网膜血管内皮细胞的表型改变，进而发生视网膜血管内皮细胞的增生、迁移和重塑，造成血管的渗透性增高及功能异常。Zhang等[13]对DR患者视网膜组织中的总circRNA进行分析，发现视网膜纤维血管膜、外周血浆及玻璃体组织中has_circ_0005015表达量均显著上调；进一步研究发现，has_circ_0005015作为miRNA“海绵”，抑制miR-519d-3p活性，进而通过上调基质金属蛋白酶（MMP）-2、信号传导蛋白与转录激活物、X-连锁凋亡抑制蛋白等基因的表达，促进内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，造成视网膜血管的功能异常[13]。Liu等[14]发现，在体内外低氧及高葡萄糖环境的诱导下，cZNF609这一在内皮细胞内大量表达的circRNA表达量显著上调，而cZNF609沉默后，视网膜血管丧失及病理性新生血管形成被有效抑制；进一步研究发现，cZNF609通过抑制miR-615-5p的活性，作为其对应的海绵circRNA，进而抑制肌细胞增强因子2A的表达，发挥在高葡萄糖及低氧条件下对视网膜的病理性作用。在随后对临床样本的circRNA检测中这一结果也被进一步证实。Liu等[14]发现，与对照组相比，DR患者视网膜纤维血管膜及外周血中cZNF609的含量显著升高，而miR-615-5p含量则明显下调。Zou等[22]发现，circCOL1A2及VEGF水平在高葡萄糖作用下的人视网膜血管内皮细胞中呈现高表达。circCOL1A2作为miR-29b的“海绵”，通过吸附circRNA而促进VEGF的表达。circCOL1A2沉默能够通过增强miR-29b表达进而抑制人视网膜血管内皮细胞的增生、迁移、通透性增加及血管生成相关基因的表达。Zou等[22]发现，敲除CircCOL1A2的DR模型小鼠视网膜中VEGF表达量明显降低，且其表达量降低是通过miR-29b的表达上调实现的，其DR病理性新生血管的形成过程也被缓解和抑制。类似地，Liu等[15]也发现，circ_0002570在DR患者中的表达明显升高，其对应的“海绵”受体miR-1243表达量则明显降低。在高葡萄糖内环境中，circ_0002570通过抑制miR-1243的作用上调血管动蛋白的表达，导致视网膜微血管的功能失调。在敲除circ_0002570后，高葡萄糖内环境影响下的视网膜内皮细胞释放炎症介质及VEGF明显减少，内皮细胞增生、迁移及新生血管形成等过程也受到了抑制[15]。这些研究结果均表明，在人视网膜中存在着多种circRNA，在DR进展过程中，某些特定的circRNA表达量发生变化，通过海绵作用抑制对应的miRNA表达，促进视网膜微血管内皮细胞的增生、迁移及新生血管形成，参与DR视网膜血管的异常变化发展。
视网膜毛细血管细胞主要包括内皮细胞及周细胞。除了视网膜微血管内皮细胞的异常外，周细胞的变化也参与了DR的视网膜血管功能异常。在DR进展期，视网膜新生血管的形成不仅有内皮细胞增生、迁移及成熟过程的参与，周细胞的增生与招募也参与其中。周细胞是在毛细血管内皮细胞与基膜之间的一种扁平而有突起的细胞，细胞突起紧贴在内皮细胞的基底面，主要起着对管腔的机械支持作用，并可能参与血管生长或再生时的调控[23]。视网膜周细胞的覆盖率明显高于其他的毛细血管，值得注意的是，周细胞变性被认为是糖尿病所引起的视网膜血管功能异常的早期标志[24]。Jiang等[25]发现，在DR患者的玻璃体液呈现高表达的cZNF532，在DR模型小鼠的视网膜毛细血管的周细胞中也呈现高表达。在高葡萄糖刺激下，周细胞内的cZNF532表达上调，并通过作为miR-29a-3p的“海绵”circRNA，诱导神经胶质抗原2、赖氨酰氧化酶样蛋白2及细胞周期依赖性激酶2的表达，促进周细胞的增生及分化，募集周细胞向内皮细胞转化。cZNF532沉默则使高葡萄糖及氧化应激所诱导的周细胞凋亡增多，其向内皮细胞的转化减少。敲除cZNF532加重了视网膜血管周细胞的变性和血管功能失调，而过表达cZNF532则有效缓解了DR的进展，改善了视网膜血管的通透性增高及周细胞的覆盖降低。Liu等[26]也得到了与之相似的研究结果，其发现cPWWP2A过表达可以保护周细胞免受高葡萄糖环境诱导的损伤。在体外实验中，携带cPWWP2A的外泌体直接调控了周细胞的生物学功能。作为miR-579的“海绵”circRNA，cPWWP2A抑制了miR-579的活性并上调血管生成素1、闭锁蛋白及烟酰胺腺苷二核苷酸依赖性去乙酰化酶沉默信息调节因子2相关酶1的表达，促进周细胞向内皮细胞的转化[26]。这说明，周细胞内表达上调的cPWWP2A可通过外泌体从周细胞传递至内皮细胞，对内皮细胞起保护性调控作用。与对照组相比，周细胞内cPWWP2A沉默使得内皮的通透性显著增高[26]。cPWWP2A从周细胞至内皮细胞的传递影响了内皮细胞增生、迁移及新生血管形成的过程。以上研究结果表明，circRNA可作为周细胞与内皮细胞之间的媒介，调控两者在高葡萄糖应急状态下的相互作用，在DR病理状态下造成视网膜微血管的功能失调。周细胞与内皮细胞之间数量及功能的不协调，以及周细胞的增生及招募不足使新生血管的成熟过程受影响，导致病理性新生血管的通透性增高及机械作用差。circRNA在周细胞变性及视网膜微血管功能失调中的作用，为进一步阐明DR的发病机制及创新DR的治疗手段提供了新的思路。
3 circRNA在DR血视网膜外屏障破坏中发挥的作用
血视网膜屏障由内屏障和外屏障组成，其中视网膜毛细血管内皮及其连接构成了内屏障，视网膜色素上皮（RPE）细胞形成了血视网膜外屏障。RPE细胞使视网膜组织液与脉络膜组织液分离，在DR中，RPE细胞的结构和功能失调造成的血视网膜外屏障被破坏及炎症反应使得血管渗出物经破坏的外屏障外漏，在DR发展及患者视力丧失中发挥重要作用[27]。 Li等[28]发现，在高葡萄糖诱导的DR模型RPE细胞中，circRNA_0084043的表达量明显升高，并促进细胞增生，抑制细胞凋亡。circRNA_0084043沉默使得RPE细胞的氧化应激过程被抑制，相应地丙二醛水平被下调，超氧化物歧化酶及谷胱甘肽过氧化酶活性被激活，肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-6及环氧化酶-2等炎症介质释放减少。circRNA_0084043通过调控miR-140-3p，促进细胞凋亡及炎症过程，特别是TNF-α的高表达，参与DR的进展[28]。Sun和Kang[29]也发现，has_circ_0041795的表达量在高葡萄糖诱导下的RPE细胞中显著升高，并促进了细胞凋亡。has_circ_0041795显著上调TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达，促进炎症反应，并抑制其下游的miR-646表达，发挥circRNA的海绵作用，并上调VEGF-C的表达，从而在DR进展中发挥作用[29]。而Zhou等[30]发现，糖尿病大鼠RPE细胞中circ-ITCH表达量显著低于对照组。在糖尿病大鼠模型RPE细胞中过表达circ-ITCH，MMP-2、MMP-9及TNF-α的表达均被抑制[30]。作为miR-22的“海绵”circRNA，circ-ITCH在RPE细胞中的低表达促进了miR-22的活性，进而上调了MMP-2、MMP-9及TNF-α的表达，在糖尿病视网膜慢性微血管炎症反应及新生血管形成过程中发挥了重要作用[30]。以上研究结果提示，circRNA的表达量改变在DR发生发展中诱导了RPE细胞凋亡，并通过调控一系列炎症介质的释放进一步影响RPE细胞及视网膜血管内皮细胞的结构及功能，造成了血视网膜屏障的破坏，参与DR的发展。
4 小结与展望
视网膜微血管功能失调、炎症反应过度激活以及神经元的退行性病变是DR的主要发病机制[31]。这三个关键环节相互影响，共同参与了DR病程的进展，但背后具体的调控机制及其在发生过程中的先后顺序目前尚不明确。circRNA广泛存在视网膜中并参与各种眼底疾病的发生发展过程，但对其功能还知之甚少。目前对circRNA的研究主要集中在肿瘤领域，其中具有调控细胞增生作用的circ-ITCH及circHIPK3不仅在肿瘤的分子诊断、靶向治疗及预后判断上有光明的前景，同时也被发现参与了视网膜病变的病理过程[16, 30, 32-33]。circRNA在DR过程中的机制研究逐渐得到重视，其中circPDE4B、cZNF609不仅在视网膜呈特异性高表达，而且被证实参与了细胞增生调节和病理性新生血管形成过程，在DR的分子诊断及靶向治疗方面具有重要的价值[14, 34]。总的来说，针对DR过程中circRNA发挥作用的研究，目前尤以circRNA对高葡萄糖应激内环境下视网膜微血管病变失调的影响最为集中，其他作用机制方面仍有待进一步探索。
现有的对于circRNA参与DR病理生理过程的研究也存在着一些局限与不足：（1）多数实验仅建立在单一细胞系或实验动物层面，特定的circRNA实际在人视网膜中的表达及DR病理过程中的变化不能明确；（2）从DR患者获得的病理标本由于眼科学的特殊性，样本量少且缺乏多中心的样本，结果偏倚难以避免；（3）circRNA的提取、量化和分析方法以及平台的不同，缺乏标准化，各研究之间难以比较；（4）多种与DR相关的circRNA被发现，相互之间缺乏联系，随着目标circRNA的增多，以circRNA为DR诊断生物学标志及治疗靶标的对象选择面临挑战；（5）目前研究主要集中于circRNA在调控视网膜微血管功能失调及炎症反应过度激活中所起的作用，对于circRNA对DR神经退行性病变影响方面的研究依然缺乏。
未来，对circRNA在DR中的探索将深入阐明DR的病理生理过程，在视网膜微血管功能失调、炎症反应尤其是应激状态下神经退行性病变中circRNA所起的作用将进一步完善DR的发病机制。研究的进展及理论的更新有望使circRNA成为早期诊断DR的有效生物学标志，并为DR的精准治疗提供崭新的生物学靶点。