引用本文： 郝昕蕾, 袁满, 陈刘贵, 王文俊, 金玮, 杨安怀. 18例内源性眼内炎患者的临床特征和纳米孔技术测序结果. 中华眼底病杂志, 2022, 38(5): 396-399. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20210823-00456 复制
内源性眼内炎（EE）诊断金标准为病原体培养[1]。但苛养微生物存在或接受抗生素治疗后其培养阳性率下降，目前感染性疾病中病原体培养阳性率为40%～70%[2]。纳米孔测序技术（NST）具有长读长测序、周转时间快、生信分析难度低、便携等优势，高覆盖读取深度能提供更精确的结果；不仅可以进行微生物物种鉴定，亦能提供毒力、耐药性、代谢、菌株等方面的信息[3-5]。本研究回顾分析了一组EE患者的临床特征和NST测序结果，初步评估NST临床应用的可行性。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会审批（批准号：WDRY2021-KS054）；遵循《赫尔辛基宣言》原则；所有患者均获知情并签署书面知情同意书。
2019年1月至2020年9月于武汉大学人民医院眼科检查确诊的EE患者18例22只眼纳入本研究。其中，男性11例，女性7例；年龄（54.56±11.82）岁（29～73岁）。单眼14例，其中左眼、右眼分别为5、9例；双眼4例。
纳入标准：（1）有或无全身疾病，临床诊断为EE；（2）眼内脓性样本行NST测序和病原体培养；（3）手术或保守治疗。排除标准：（1）1年内有开放性眼外伤或内眼手术史；（2）临床诊断为非感染性葡萄膜炎；（3）眼内样本未行病原学检测。
所有患者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼压、裂隙灯显微镜、间接检眼镜检查，必要时行B型超声以及眼前节、眼底照相检查。采用Snellen视力表行BCVA检查，统计时换算为最小分辨角对数（logMAR）视力。眼前数指、手动、光感、无光感分别为logMAR 2.3、2.6、2.9、3.1[6]。
18例患者中，首诊眼科17例（94.44%，17/18）；多次人工肝治疗后因双眼胀痛就诊1例（5.56%，1/17）。首次出现症状至本院就诊时间为（26.11±31.27）（1～120）d。有外院就诊史13例（72.22%，13/18），其中诊断为眼内炎、葡萄膜炎、青光眼、巩膜炎分别为7（53.85%，7/13）、3（23.08%，3/13）、2（15.38%，2/13）、1（7.69%，1/13）例。合并全身疾病15例（83.33%，15/18），其中糖尿病、其他系统感染灶（如肺部感染、肝脓肿等）分别为6（33.33%，6/18）、4（22.22%，4/18）例；长期口服糖皮质激素等免疫抑制药物3例（16.67%，3/18）；带状疱疹1例（5.56%，1/18）；胸腺肿瘤切除手术后化学药物治疗中1例（5.56%，1/18）。发病前有发热史3例（16.67%，3/18）；特殊工作环境史1例（5.56%，1/18）。
所有患者均给予全身经验性广谱抗细菌或真菌药物以及眼局部散瞳、抗感染滴眼液治疗。22只眼中，行玻璃体切割手术（PPV）17只眼（77.27%，17/22），其中因眼部感染未控制行二次手术剜除眼内容物1只眼；因眼底白色“粟粒样”病灶（图1）给予视网膜激光光凝治疗1只眼（4.54%，1/22）；保守治疗2例3只眼（13.64%，3/22）（图2）；一期行眼内容物剜除手术1只眼（4.54%，1/22）。行PPV治疗者，手术中尽可能清除前房及玻璃体腔脓性病灶及炎性渗出，联合玻璃体腔注射抗细菌或真菌药物，必要时行白内障超声乳化吸除彻底清除玻璃体基底部病灶。保守治疗的2例中，因全身情况差无法耐受手术1例，抽取房水行病原学检测，全身抗真菌治疗；因眼部胀痛拒绝手术1例，给予系统性抗细菌药物治疗。
图1
内源性眼内炎患者左眼彩色眼底像。鼻下方视网膜“粟粒样”病灶
图2
行保守治疗的内源性眼内炎患者双眼治疗前眼前节像。2A、2B分别示右眼、左眼。右眼前房大量纤维素性渗出，左眼前房白色团块样积脓
18例患者中，双眼眼内液行病原学培养和NST测序检测1例，患眼或较严重眼内脓性病灶行病原学培养和NST测序17例，共计采集样本19个。眼内脓性样本于无菌条件下采集，20 000 ×g高速离心10 min，弃上清液，留取200 μl沉淀用于核酸提取。应用Sanure DNA Extraction Kit提取试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司）提取微生物DNA。
16s rRNA的扩增产物和ITS1/2的扩增产物根据10∶3质量比进行混合，使用1D连接试剂盒（SQK-LSK109，英国牛津纳米孔）。文库使用Oxford Nanopore MinION测序仪进行测序。采用Albacore v2.3.1软件对MinION生成的Fast5文件进行basecalled和demultiplexed，读数质量小于7的过滤掉。Porechop用于原始数据中标签与接头序列修剪。将过滤后的测序读数通过Blast映射到美国国家生物技术信息中心FTP 16S rDNA/ITS参考数据库下载的参考数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci）中进行比对，从而对每个读数进行分类[7]。
污染控制，取材过程：（1）房水采集于消毒暗室中进行，前房穿刺前抗生素滴眼液点眼，5 min/次，6次；皮肤消毒、结膜囊冲洗，1 ml无菌注射器抽取房水。（2）玻璃体液采集均在无菌层流手术室按常规操作进行，PPV前未行灌注液时抽取玻璃体腔病灶。（3）采集样本放入无菌EP管中，低温储存。检测过程：（1）样本制备过程中，无菌试剂和经紫外线及酒精充分清洁的自动化提取设备进行核酸制备操作，提取环节避免高温引发气溶胶。（2）聚合酶链反应扩增过程中，TE缓冲液作为阴性对照；临床少见病原体作为阳性对照，排除假阴性结果（如核酸提取、文库制备或信息学故障），使用相同批次的试剂和工作流程将二者作为单独的样品处理。
采用SPSS26.0软件行统计学分析。计数资料以构成比表示。采用非参数检验、Spearman相关性分析、χ2检验等统计方法。所有检验采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
22只眼中，眼压升高4只眼（18.18%，4/22）；前房炎性反应17只眼（77.27%，17/22），其中合并前房积脓10只眼（45.45%，10/22）（黄色、绿色积脓各1只眼）。所有患眼手术中或B型超声检查均提示玻璃体腔积脓。行PPV的17只眼中，弥散性、局灶性脓液分别为14（82.35%，14/17）、3（17.65%，3/17）只眼；合并视网膜下脓肿2只眼（11.76%，2/17）。
患眼治疗前、出院时logMAR BCVA分别为2.60±0.76、2.36±0.91；治疗前后BCVA比较，差异无统计学意义（Z=－1.126，P=0.260）。相关性分析结果显示，出院时BCVA与治疗前BCVA有相关性（r=0.833，P＜0.001）。出院时，前房积脓、未积脓患眼logMAR BCVA分别为2.59±0.66、2.17±1.07，差异无统计学意义（Z=－0.853，P=0.394）；外院误诊、未误诊患眼logMAR BCVA分别为2.50±0.80、1.96±1.16，差异无统计学意义（Z=－0.980，P=0.327）。
行PPV治疗的17只眼中，手术后眼部感染未能控制1只眼（5.88%，1/17），再次行眼内容物剜除手术（4.54%，1/22）；行光凝治疗的1只眼，出院时BCVA提高。保守治疗的2例3只眼中，双眼患者，双眼眼前节炎性反应减轻，眼痛缓解，右眼BCVA提高，左眼无改善；单眼患者，眼痛缓解。
18例患者中，白细胞计数、中性粒细胞、C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、红细胞沉降率、降钙素原升高分别为8（44.44%，8/18）、10（55.56%，10/18）、12（66.67%，12/18）、12（66.67%，12/18）、11（61.11%，11/18）、10（55.56%，10/18）例。相关性分析结果显示，以上指标均与出院BCVA无相关性（r=0.104、0.163、0.089、0.239、0.071、0.219，P=0.645、0.470、0.694、0.284、0.753、0.328）。
19个样本中，病原体培养、NST测序阳性分别为6（31.58%，6/19）、18（94.74%，18/19）个，差异有统计学意义（χ2=13.685，P＜0.001）。病原体培养阳性样本均检出单一病原体，其中细菌、真菌分别为4（66.67%，4/6）、2（33.33%，2/6）个。NST测序阳性18个样本中，检出1～4种病原体分别为6（31.58%，6/19）、8（42.10%，8/19）、3（15.79%，3/19）、1（5.26%，1/19）个。其中，仅检出细菌、真菌分别为9（47.37%，9/19）、2（10.53%，2/19）个；细菌和真菌同时存在7个（36.84%，7/19）。病原体培养阳性6个样本中，与NST测序结果完全一致3个（50%，3/6）；NST测序除检出培养病原体外，同时发现其他病原体3个。
细菌、真菌培养时间分别为3～4、5～7 d；而无论细菌或真菌感染，获得NST测序细菌、真菌时间均为1～2 d。随时间推移，病原体培养得到多份检测报告。与最早病原体培养报告时间比较，NST测序结果所用时间更短，差异有统计学意义（Z=－3.831，P＜0.001）。
3 讨论
EE多发生于免疫功能缺陷人群，常见危险因素包括糖尿病、恶性肿瘤、肝脓肿、吸毒、广谱抗生素应用、留置静脉导管等[6, 8-9]。不同地区易感因素有地域差异，本组患者均来自湖北省内，最常见诱因为糖尿病，其次为合并肝脓肿等其他部位感染、系统性使用糖皮质激素和前驱发热史。
脉络膜血供丰富且血流较慢，病原体易随血液循环定植于此，因此眼内感染往往从眼后节开始，部分合并视网膜下脓肿[1, 10]。本组所有患眼均有玻璃体腔炎症反应，合并视网膜下脓肿2只眼。文献报道，因右眼血供从颈内动脉流出更为直接，右眼更易感染[11]，本研究结果与此一致。相较于同期外源性眼内炎，EE从首次出现症状至本院就诊时间长，临床特征缺乏特异性，全身病史疏漏和病原体培养阴性结果，易导致误诊或漏诊；部分病原体如白色念珠菌性眼内炎常伪装成葡萄膜炎，初诊误诊率达50%[10, 12]。本组患者多有外院就诊史，误诊率为46.15%（6/13），外院诊断为葡萄膜炎或巩膜炎均接受系统和局部糖皮质激素治疗，眼部症状先缓解后逐渐加重。
EE病原学诊断金标准为病原体培养，但阳性率不高[1, 5]。随着测序技术的不断革新为感染性疾病的病原学诊断提供了新的思路，NST作为三代测序方法之一，利用纳米孔进行测序，根据不同核苷酸碱基通过纳米孔时电流变化区分碱基，实现测序目的[3-4]，具有实时数据采集、便携、长读序列长等特点[4]。MinION测序仪携带方便，能够现场检测，数据周转快，已在乌苏图病毒、埃博拉病毒等流行病检测中显示其稳定性，成为追踪疾病爆发和传播动态的有效工具[5, 13-15]。本研究所有NST测序结果均在48 h内得到，明显短于病原体培养时间，检出阳性率明显高于培养阳性率，提示临床应用可行性。
相比于二代测序，NST读长更长，可跨越大多数重复序列，能完整组装复杂微生物基因组[5]。Sanderson等[16]同时利用NST和Illumina宏基因组测序检测感染样本，NST在1个样本中展示了较高物种水平的分辨率，而二代测序只能鉴定至属水平，其余样本中，两种测序与培养结果一致。对于基因组水平高度相似的物种，NST结果更为准确[5, 16-17]。研究证明，基于16S rRNA和ITS序列的纳米孔靶向测序能成功识别临床血液样本中的细菌或真菌，并被Sanger测序证实，二者核苷酸序列的一致率达99%[18]。
本研究结果显示，NST测序检出细菌感染、真菌感染以及两者共同感染比例分别为47.37%、10.53%、36.84%；病原体培养结果与之类似。文献报道，以白色念珠菌为主的真菌感染较为普遍，尤其在西方国家[8, 19]。另有学者报道，亚洲地区细菌感染占多数，革兰阴性菌特别是与肝脓肿相关的肺炎克雷伯杆菌较为常见[9, 20]。本组患眼检出细菌感染数量多，可能与地域差异、样本量较小、细菌性EE发病率升高有关。NST测序检出多种病原体比例较高，可能与测序技术特点有关。病原体培养中优势菌的存在可能影响其他病原体的检出，苛养微生物的存在或接受抗生素治疗会导致培养阳性率降低[4]，而NST测序对于病原微生物的发现没有偏倚性。
测序技术局限性在于检测样品、试剂或实验室环境中微生物污染，致使结果的解释分析变得复杂[21]。因此，需秉持无菌操作理念，遵守工作流程及质量控制程序，尽可能保持无菌和无核酸的测试环境；使用阴性对照、试剂评估和定期检查，确保实验室和样品交叉污染不产生假阳性结果；熟悉临床样本中常见的微生物菌群[22-24]。
本研究最终接受眼内容物剜除手术的2只眼中，眼压均高于正常，推测眼压对于EE患者眼球是否得以保留具有提示性，但尚需更多研究加以验证。本研究存在的局限性：（1）纳入研究样本量较少，取材时间不一致，前期抗感染治疗可能影响样本中病原体数量；（2）NST测序结果未经聚合酶链反应或Sanger、二代测序验证；（3）研究期间因新冠疫情部分患者失访，仅记录出院视力。
内源性眼内炎（EE）诊断金标准为病原体培养[1]。但苛养微生物存在或接受抗生素治疗后其培养阳性率下降，目前感染性疾病中病原体培养阳性率为40%～70%[2]。纳米孔测序技术（NST）具有长读长测序、周转时间快、生信分析难度低、便携等优势，高覆盖读取深度能提供更精确的结果；不仅可以进行微生物物种鉴定，亦能提供毒力、耐药性、代谢、菌株等方面的信息[3-5]。本研究回顾分析了一组EE患者的临床特征和NST测序结果，初步评估NST临床应用的可行性。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经武汉大学人民医院伦理委员会审批（批准号：WDRY2021-KS054）；遵循《赫尔辛基宣言》原则；所有患者均获知情并签署书面知情同意书。
2019年1月至2020年9月于武汉大学人民医院眼科检查确诊的EE患者18例22只眼纳入本研究。其中，男性11例，女性7例；年龄（54.56±11.82）岁（29～73岁）。单眼14例，其中左眼、右眼分别为5、9例；双眼4例。
纳入标准：（1）有或无全身疾病，临床诊断为EE；（2）眼内脓性样本行NST测序和病原体培养；（3）手术或保守治疗。排除标准：（1）1年内有开放性眼外伤或内眼手术史；（2）临床诊断为非感染性葡萄膜炎；（3）眼内样本未行病原学检测。
所有患者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼压、裂隙灯显微镜、间接检眼镜检查，必要时行B型超声以及眼前节、眼底照相检查。采用Snellen视力表行BCVA检查，统计时换算为最小分辨角对数（logMAR）视力。眼前数指、手动、光感、无光感分别为logMAR 2.3、2.6、2.9、3.1[6]。
18例患者中，首诊眼科17例（94.44%，17/18）；多次人工肝治疗后因双眼胀痛就诊1例（5.56%，1/17）。首次出现症状至本院就诊时间为（26.11±31.27）（1～120）d。有外院就诊史13例（72.22%，13/18），其中诊断为眼内炎、葡萄膜炎、青光眼、巩膜炎分别为7（53.85%，7/13）、3（23.08%，3/13）、2（15.38%，2/13）、1（7.69%，1/13）例。合并全身疾病15例（83.33%，15/18），其中糖尿病、其他系统感染灶（如肺部感染、肝脓肿等）分别为6（33.33%，6/18）、4（22.22%，4/18）例；长期口服糖皮质激素等免疫抑制药物3例（16.67%，3/18）；带状疱疹1例（5.56%，1/18）；胸腺肿瘤切除手术后化学药物治疗中1例（5.56%，1/18）。发病前有发热史3例（16.67%，3/18）；特殊工作环境史1例（5.56%，1/18）。
所有患者均给予全身经验性广谱抗细菌或真菌药物以及眼局部散瞳、抗感染滴眼液治疗。22只眼中，行玻璃体切割手术（PPV）17只眼（77.27%，17/22），其中因眼部感染未控制行二次手术剜除眼内容物1只眼；因眼底白色“粟粒样”病灶（图1）给予视网膜激光光凝治疗1只眼（4.54%，1/22）；保守治疗2例3只眼（13.64%，3/22）（图2）；一期行眼内容物剜除手术1只眼（4.54%，1/22）。行PPV治疗者，手术中尽可能清除前房及玻璃体腔脓性病灶及炎性渗出，联合玻璃体腔注射抗细菌或真菌药物，必要时行白内障超声乳化吸除彻底清除玻璃体基底部病灶。保守治疗的2例中，因全身情况差无法耐受手术1例，抽取房水行病原学检测，全身抗真菌治疗；因眼部胀痛拒绝手术1例，给予系统性抗细菌药物治疗。
图1
内源性眼内炎患者左眼彩色眼底像。鼻下方视网膜“粟粒样”病灶
图2
行保守治疗的内源性眼内炎患者双眼治疗前眼前节像。2A、2B分别示右眼、左眼。右眼前房大量纤维素性渗出，左眼前房白色团块样积脓
18例患者中，双眼眼内液行病原学培养和NST测序检测1例，患眼或较严重眼内脓性病灶行病原学培养和NST测序17例，共计采集样本19个。眼内脓性样本于无菌条件下采集，20 000 ×g高速离心10 min，弃上清液，留取200 μl沉淀用于核酸提取。应用Sanure DNA Extraction Kit提取试剂盒（圣湘生物科技股份有限公司）提取微生物DNA。
16s rRNA的扩增产物和ITS1/2的扩增产物根据10∶3质量比进行混合，使用1D连接试剂盒（SQK-LSK109，英国牛津纳米孔）。文库使用Oxford Nanopore MinION测序仪进行测序。采用Albacore v2.3.1软件对MinION生成的Fast5文件进行basecalled和demultiplexed，读数质量小于7的过滤掉。Porechop用于原始数据中标签与接头序列修剪。将过滤后的测序读数通过Blast映射到美国国家生物技术信息中心FTP 16S rDNA/ITS参考数据库下载的参考数据库（ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci）中进行比对，从而对每个读数进行分类[7]。
污染控制，取材过程：（1）房水采集于消毒暗室中进行，前房穿刺前抗生素滴眼液点眼，5 min/次，6次；皮肤消毒、结膜囊冲洗，1 ml无菌注射器抽取房水。（2）玻璃体液采集均在无菌层流手术室按常规操作进行，PPV前未行灌注液时抽取玻璃体腔病灶。（3）采集样本放入无菌EP管中，低温储存。检测过程：（1）样本制备过程中，无菌试剂和经紫外线及酒精充分清洁的自动化提取设备进行核酸制备操作，提取环节避免高温引发气溶胶。（2）聚合酶链反应扩增过程中，TE缓冲液作为阴性对照；临床少见病原体作为阳性对照，排除假阴性结果（如核酸提取、文库制备或信息学故障），使用相同批次的试剂和工作流程将二者作为单独的样品处理。
采用SPSS26.0软件行统计学分析。计数资料以构成比表示。采用非参数检验、Spearman相关性分析、χ2检验等统计方法。所有检验采用双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
22只眼中，眼压升高4只眼（18.18%，4/22）；前房炎性反应17只眼（77.27%，17/22），其中合并前房积脓10只眼（45.45%，10/22）（黄色、绿色积脓各1只眼）。所有患眼手术中或B型超声检查均提示玻璃体腔积脓。行PPV的17只眼中，弥散性、局灶性脓液分别为14（82.35%，14/17）、3（17.65%，3/17）只眼；合并视网膜下脓肿2只眼（11.76%，2/17）。
患眼治疗前、出院时logMAR BCVA分别为2.60±0.76、2.36±0.91；治疗前后BCVA比较，差异无统计学意义（Z=－1.126，P=0.260）。相关性分析结果显示，出院时BCVA与治疗前BCVA有相关性（r=0.833，P＜0.001）。出院时，前房积脓、未积脓患眼logMAR BCVA分别为2.59±0.66、2.17±1.07，差异无统计学意义（Z=－0.853，P=0.394）；外院误诊、未误诊患眼logMAR BCVA分别为2.50±0.80、1.96±1.16，差异无统计学意义（Z=－0.980，P=0.327）。
行PPV治疗的17只眼中，手术后眼部感染未能控制1只眼（5.88%，1/17），再次行眼内容物剜除手术（4.54%，1/22）；行光凝治疗的1只眼，出院时BCVA提高。保守治疗的2例3只眼中，双眼患者，双眼眼前节炎性反应减轻，眼痛缓解，右眼BCVA提高，左眼无改善；单眼患者，眼痛缓解。
18例患者中，白细胞计数、中性粒细胞、C反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、红细胞沉降率、降钙素原升高分别为8（44.44%，8/18）、10（55.56%，10/18）、12（66.67%，12/18）、12（66.67%，12/18）、11（61.11%，11/18）、10（55.56%，10/18）例。相关性分析结果显示，以上指标均与出院BCVA无相关性（r=0.104、0.163、0.089、0.239、0.071、0.219，P=0.645、0.470、0.694、0.284、0.753、0.328）。
19个样本中，病原体培养、NST测序阳性分别为6（31.58%，6/19）、18（94.74%，18/19）个，差异有统计学意义（χ2=13.685，P＜0.001）。病原体培养阳性样本均检出单一病原体，其中细菌、真菌分别为4（66.67%，4/6）、2（33.33%，2/6）个。NST测序阳性18个样本中，检出1～4种病原体分别为6（31.58%，6/19）、8（42.10%，8/19）、3（15.79%，3/19）、1（5.26%，1/19）个。其中，仅检出细菌、真菌分别为9（47.37%，9/19）、2（10.53%，2/19）个；细菌和真菌同时存在7个（36.84%，7/19）。病原体培养阳性6个样本中，与NST测序结果完全一致3个（50%，3/6）；NST测序除检出培养病原体外，同时发现其他病原体3个。
细菌、真菌培养时间分别为3～4、5～7 d；而无论细菌或真菌感染，获得NST测序细菌、真菌时间均为1～2 d。随时间推移，病原体培养得到多份检测报告。与最早病原体培养报告时间比较，NST测序结果所用时间更短，差异有统计学意义（Z=－3.831，P＜0.001）。
3 讨论
EE多发生于免疫功能缺陷人群，常见危险因素包括糖尿病、恶性肿瘤、肝脓肿、吸毒、广谱抗生素应用、留置静脉导管等[6, 8-9]。不同地区易感因素有地域差异，本组患者均来自湖北省内，最常见诱因为糖尿病，其次为合并肝脓肿等其他部位感染、系统性使用糖皮质激素和前驱发热史。
脉络膜血供丰富且血流较慢，病原体易随血液循环定植于此，因此眼内感染往往从眼后节开始，部分合并视网膜下脓肿[1, 10]。本组所有患眼均有玻璃体腔炎症反应，合并视网膜下脓肿2只眼。文献报道，因右眼血供从颈内动脉流出更为直接，右眼更易感染[11]，本研究结果与此一致。相较于同期外源性眼内炎，EE从首次出现症状至本院就诊时间长，临床特征缺乏特异性，全身病史疏漏和病原体培养阴性结果，易导致误诊或漏诊；部分病原体如白色念珠菌性眼内炎常伪装成葡萄膜炎，初诊误诊率达50%[10, 12]。本组患者多有外院就诊史，误诊率为46.15%（6/13），外院诊断为葡萄膜炎或巩膜炎均接受系统和局部糖皮质激素治疗，眼部症状先缓解后逐渐加重。
EE病原学诊断金标准为病原体培养，但阳性率不高[1, 5]。随着测序技术的不断革新为感染性疾病的病原学诊断提供了新的思路，NST作为三代测序方法之一，利用纳米孔进行测序，根据不同核苷酸碱基通过纳米孔时电流变化区分碱基，实现测序目的[3-4]，具有实时数据采集、便携、长读序列长等特点[4]。MinION测序仪携带方便，能够现场检测，数据周转快，已在乌苏图病毒、埃博拉病毒等流行病检测中显示其稳定性，成为追踪疾病爆发和传播动态的有效工具[5, 13-15]。本研究所有NST测序结果均在48 h内得到，明显短于病原体培养时间，检出阳性率明显高于培养阳性率，提示临床应用可行性。
相比于二代测序，NST读长更长，可跨越大多数重复序列，能完整组装复杂微生物基因组[5]。Sanderson等[16]同时利用NST和Illumina宏基因组测序检测感染样本，NST在1个样本中展示了较高物种水平的分辨率，而二代测序只能鉴定至属水平，其余样本中，两种测序与培养结果一致。对于基因组水平高度相似的物种，NST结果更为准确[5, 16-17]。研究证明，基于16S rRNA和ITS序列的纳米孔靶向测序能成功识别临床血液样本中的细菌或真菌，并被Sanger测序证实，二者核苷酸序列的一致率达99%[18]。
本研究结果显示，NST测序检出细菌感染、真菌感染以及两者共同感染比例分别为47.37%、10.53%、36.84%；病原体培养结果与之类似。文献报道，以白色念珠菌为主的真菌感染较为普遍，尤其在西方国家[8, 19]。另有学者报道，亚洲地区细菌感染占多数，革兰阴性菌特别是与肝脓肿相关的肺炎克雷伯杆菌较为常见[9, 20]。本组患眼检出细菌感染数量多，可能与地域差异、样本量较小、细菌性EE发病率升高有关。NST测序检出多种病原体比例较高，可能与测序技术特点有关。病原体培养中优势菌的存在可能影响其他病原体的检出，苛养微生物的存在或接受抗生素治疗会导致培养阳性率降低[4]，而NST测序对于病原微生物的发现没有偏倚性。
测序技术局限性在于检测样品、试剂或实验室环境中微生物污染，致使结果的解释分析变得复杂[21]。因此，需秉持无菌操作理念，遵守工作流程及质量控制程序，尽可能保持无菌和无核酸的测试环境；使用阴性对照、试剂评估和定期检查，确保实验室和样品交叉污染不产生假阳性结果；熟悉临床样本中常见的微生物菌群[22-24]。
本研究最终接受眼内容物剜除手术的2只眼中，眼压均高于正常，推测眼压对于EE患者眼球是否得以保留具有提示性，但尚需更多研究加以验证。本研究存在的局限性：（1）纳入研究样本量较少，取材时间不一致，前期抗感染治疗可能影响样本中病原体数量；（2）NST测序结果未经聚合酶链反应或Sanger、二代测序验证；（3）研究期间因新冠疫情部分患者失访，仅记录出院视力。
