引用本文： 郭庆歌, 李亚, 游雅, 刘长庚, 李舒茵, 雷博. CEP290基因新变异相关单纯视锥视杆细胞营养不良基因型与临床表型分析. 中华眼底病杂志, 2022, 38(8): 650-655. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220706-00396 复制
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CEP290基因变异导致的遗传性视网膜疾病具有高度表型异质性，既可表现为非综合征眼病，也可表现为累及全身的综合征，临床诊断较为困难。CEP290基因位于染色体12q21.32，跨越54个外显子，其编码一种相对分子质量290×103的中心体蛋白，参与纤毛的组装和运输。表型的异质性可能与变异蛋白对纤毛结构产生不同的影响有关[1-6]。CEP290基因变异所致的非综合征眼病多数为Leber先天性黑矇（LCA）。但近年国外已有部分表型较轻的单纯性CEP290基因相关视网膜变性报道，如早发性严重性视网膜营养不良（EOSRD）、视网膜色素变性（RP）、视锥视杆细胞营养不良（CORD）等[6-11]。而国内相关研究尚少。我们在一症状较轻的CORD家系中发现了CEP290基因2个新的变异位点，并通过生物信息学分析其致病性，同时对患者的临床表型进行了观察。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审核[批准号：HNEECKY-2019（15）]。研究过程遵循《赫尔辛基宣言》原则；所有受检者均获知情并签署书面知情同意书。
2021年12月于河南省立眼科医院就诊并经基因检查确诊的1个CORD家系中的2例患者及2名家系成员纳入本研究。详细询问病史和家族史，绘制家系图（图1）。受检者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼压、裂隙灯显微镜、彩色眼底照相、自身荧光（AF）、扫频源光相干断层扫描（SS-OCT）、自适应光学眼底成像、静态阈值视野、全视野和多焦视网膜电图（ERG）检查。
图1
CORD家系图。采集受检者的外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用自主设计研发的包含有376个遗传性视网膜疾病致病基因的检测试剂盒（PS400）对先证者行外显子区和相邻内含子区域（50 bp）及已知内含子突变检测[12-15]。构建目的基因DNA文库（150～200 bp），富集后应用美国Illumina公司Illumina NovaSeq 6000测序仪进行双端测序，平均测序深度200×。采用BWA软件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）对测序数据进行比对拼接，参考人类基因组为hg19，提取单核苷酸多态性、删除和插入变异、错义突变。应用人群基因频率数据库（gnomAD，https://gnomad.broadinstitute.org/）、千人基因组计划数据库（http://www.1000genomes.org/）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）收录信息进行对比。采用在线分析工具Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）对变异位点的致病性进行预测；采用GERP++、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、Weblogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）等软件对变异位点进行保守性分析。对候选致病基因变异采用Sanger测序，进一步在家系成员中进行基因型和表型的共分离验证。参照美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南[16]对变异位点的致病性进行分析。
2 结果
先证者（Ⅱ-1），男，29岁。双眼视力下降20年。全身系统性检查无异常。双眼无明显眼球震颤。BCVA：右眼＋0.5/－0.75×20→0.3，左眼＋0.25/－0.5×165→0.4。双眼眼前节无明显异常。双眼黄斑区颜色晦暗，中心凹反光消失；视网膜未见明显色素沉着（图2A）。眼底AF检查，双眼黄斑中心凹弱荧光背景下强荧光斑点（图2B）。SS-OCT检查，双眼黄斑区外核层变薄，椭圆体带及嵌合体带光反射信号减弱（图2C）。自适应光学眼底成像，双眼黄斑中心10°视角内视锥细胞光反射信号失常、密度降低，部分区域视锥细胞萎缩透见视网膜色素上皮细胞（图2D，2E）。静态阈值视野检查，双眼呈不规则暗点（图2F）。全视野、多焦ERG检查，双眼视锥细胞功能严重降低，视杆细胞功能中度降低（图2G，2H）。其弟弟（Ⅱ-2），21岁。双眼视力下降10余年。全身系统性检查无异常。左眼眼球震颤。BCVA：右眼－5.25/－2×10→0.7，左眼－5.5/－2×180→0.4。双眼呈豹纹状眼底改变，其余表现同先证者。其父亲（Ⅰ-1）全身及眼部检查无异常；母亲（Ⅰ-2）除双眼高度近视外，其余眼部及全身检查无明显异常。
图2
CORD家系先证者（Ⅱ-1）左眼眼部检查像。2A示彩色眼底像，视网膜无明显色素沉着。2B示AF像，黄斑中心凹表现为弱荧光背景下的强荧光斑点。2C示SS-OCT像，黄斑区椭圆体带及嵌合体带光反射信号减弱。2D示自适应光学眼底成像，黄斑中心10°视角内视锥细胞光反射信号失常、密度降低；2E为2D右下角红色方框4°视角的放大像，部分区域视锥细胞萎缩透见RPE（白箭）。2F示视野检查灰度图，30°视野内多个不规则暗点。2G示多焦ERG检查结果，视锥细胞功能严重降低。2H示全视野ERG检查结果，视锥细胞功能严重降低，视杆细胞功能中度降低。CORD：视锥视杆细胞营养不良；AF：自身荧光；SS-OCT：扫频源光相干断层扫描；RPE：视网膜色素上皮；ERG：视网膜电图
基因检测结果显示，先证者（Ⅱ-1）及其弟弟（Ⅱ-2）均携带CEP290 c.950T>A（p.Leu317*）（M1）、c.4144_4149del （p.Tyr1382_Glu1383del）（M2）复合杂合突变。其父亲、母亲（Ⅰ-1、Ⅰ-2）分别携带M2、M1（图3）。M1、M2在gnomAD、ExAC、千人基因组计划等数据库中未见。M1为新发现无义突变，M2为新发现缺失突变，分别位于chr12-88520208、chr12-88481601。M1：Mutation Taster、CADD软件预测该变异位点为有害，GERP++显示其影响的氨基酸高度保守（图4）。根据ACMG指南，评估该变异位点为疑似致病性变异（PVS1+PM2）。M2根据ACMG指南，评估其致病性为临床意义未明变异（PM4+PM2）。先证者父母临床表型未见明显异常。Sanger测序验证，符合家系共分离。
图3
CORD家系先证者及其家系成员基因Sanger测序图。3A示先证者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其母亲（I-2）均携带M1：CEP290 c.950T＞A（p.Leu317*）变异；3B示先证者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其父亲（I-1）均携带M2：CEP290 c.4144_4149del（p.Tyr1382_Glu1383del）变异。CORD：视锥视杆细胞营养不良
图4
物种间序列保守性分析。4A、4B分别示Clustal Omega、Weblogo的分析结果。CEP290 p.Leu317*、p.Tyr1382_Glu1383del分别所对应的第317、1 382～1 383号氨基酸序列位点在斑马鱼、鸡、小鼠、大鼠、猪、牛、人、狗、马等物种中高度保守（红色线框、红箭）
3 讨论
本研究中2例CORD患者均携带M1、M2复合杂合突变，但眼部表型较轻，相对于CEP290基因相关的LCA或EOSRD，患者具有更好的视力及可记录到的ERG波形；SS-OCT检查可见黄斑部结构轻度异常。
CEP290基因变异所致的非综合征眼病多为LCA，多数患者出生时或出生不久即已失明，相对较轻的表型称为EOSRD[2-3, 6]。目前已发现，与LCA相关的14个致病基因中CEP290较为常见[17]。CEP290基因最常见突变位点是c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）内含子变异，主要出现在欧洲西北部和美国，占所有LCA患者的26%[3, 18]。该突变位点常导致较重的表型[2]，患者出生后即表现出严重视力损害、眼球震颤、远视、不可记录的ERG波形、异常瞳孔反应以及明显的眼底异常[19-20]，但病程进展缓慢[21-22]。国内该突变位点出现较少[20]。
c.2991+1655A>G纯合子变异的患者倾向于具有较轻的视网膜表型[19]。但一项针对德裔患者的研究显示，该纯合变异患者较携带该内含子变异的复合杂合子患者表现出更严重的表型[23]。Chen等[1]报道1例携带CEP290 c.3310-1_3313delGCTTA、c.1666dupA复合杂合变异的LCA女性患儿，出生后5个月即检测到ERG严重异常。而Vilaplana等[6]报道1例CEP290 c.4028delA、c.5254C>T复合杂合致病变异相关CORD女性患者，57岁时仍保留20/100的视力。 Rafalska等[24]发现，CEP290基因4号内含子C.250+2T>C和第51外显子c.7027del复合杂合变异女性RP患者，30岁时仍有较好的黄斑中心凹解剖结构及中心视力。Barny等[25]报道携带c.1824+3A>G、c.6869dup 复合杂合变异的两兄妹具有相对轻微的视网膜营养不良表现，保留较好的中心视力。Birtel等[26]报道1例12号外显子c.982C>T和26号内含子c.2991+1655A>G复合杂合变异的女性患者，27岁时诊断为RP，70岁时视力仍有光感。
CEP290基因相关视网膜变性患者的视力与基因型、年龄、黄斑中心残留光感受器层厚度无显著相关性[27-28]。但也有研究显示，不伴眼球震颤的患者中央视网膜厚度保留更多，具有更好的视力[2]。尽管CEP290基因突变引起不同表型的原因尚不明确，但有研究者认为，CEP290基因多效性的起源不是突变对蛋白质功能的影响，而是与携带CEP290基因变异的细胞中保存部分或者全长CEP290蛋白的表达量有关[11, 29-30]。在c.2991+1655A>G变异的LCA患者淋巴母细胞或成纤维细胞中检测到的功能性CEP290蛋白含量减少约50% [19]。携带CEP290基因变异的成纤维细胞形成纤毛结构的能力降低，而慢病毒载体转导的CEP290基因能够弥补这种纤毛形成的缺陷[31]。
CEP290基因突变导致的遗传性视网膜疾病具有高度表型异质性。本研究确定了CEP290基因相关CORD新的复合杂合变异，拓宽了CEP290基因的致病基因谱。患者临床表型较轻，视锥、视杆细胞功能下降，黄斑区视锥细胞出现结构异常和密度下降时仅有轻度视觉损伤。相比国外发生率较高的内含子变异，本研究报道的新变异可引起相对较轻但在高分辨率影像检查中可见的视网膜结构改变。
CEP290基因变异导致的遗传性视网膜疾病具有高度表型异质性，既可表现为非综合征眼病，也可表现为累及全身的综合征，临床诊断较为困难。CEP290基因位于染色体12q21.32，跨越54个外显子，其编码一种相对分子质量290×103的中心体蛋白，参与纤毛的组装和运输。表型的异质性可能与变异蛋白对纤毛结构产生不同的影响有关[1-6]。CEP290基因变异所致的非综合征眼病多数为Leber先天性黑矇（LCA）。但近年国外已有部分表型较轻的单纯性CEP290基因相关视网膜变性报道，如早发性严重性视网膜营养不良（EOSRD）、视网膜色素变性（RP）、视锥视杆细胞营养不良（CORD）等[6-11]。而国内相关研究尚少。我们在一症状较轻的CORD家系中发现了CEP290基因2个新的变异位点，并通过生物信息学分析其致病性，同时对患者的临床表型进行了观察。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性研究。本研究经河南省立眼科医院伦理委员会审核[批准号：HNEECKY-2019（15）]。研究过程遵循《赫尔辛基宣言》原则；所有受检者均获知情并签署书面知情同意书。
2021年12月于河南省立眼科医院就诊并经基因检查确诊的1个CORD家系中的2例患者及2名家系成员纳入本研究。详细询问病史和家族史，绘制家系图（图1）。受检者均行最佳矫正视力（BCVA）、眼压、裂隙灯显微镜、彩色眼底照相、自身荧光（AF）、扫频源光相干断层扫描（SS-OCT）、自适应光学眼底成像、静态阈值视野、全视野和多焦视网膜电图（ERG）检查。
图1
CORD家系图。采集受检者的外周静脉血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用自主设计研发的包含有376个遗传性视网膜疾病致病基因的检测试剂盒（PS400）对先证者行外显子区和相邻内含子区域（50 bp）及已知内含子突变检测[12-15]。构建目的基因DNA文库（150～200 bp），富集后应用美国Illumina公司Illumina NovaSeq 6000测序仪进行双端测序，平均测序深度200×。采用BWA软件（http:// bio-bwa.sourceforge.net/）对测序数据进行比对拼接，参考人类基因组为hg19，提取单核苷酸多态性、删除和插入变异、错义突变。应用人群基因频率数据库（gnomAD，https://gnomad.broadinstitute.org/）、千人基因组计划数据库（http://www.1000genomes.org/）、ExAC数据库（http://exac.broadinstitute.org/）收录信息进行对比。采用在线分析工具Polyphen2（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/）、Mutation Taster（https://www.mutationtaster.org/）、SIFT（http://sift.jcvi.org/）、CADD（https://cadd.gs.washington.edu/）对变异位点的致病性进行预测；采用GERP++、Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）、Weblogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）等软件对变异位点进行保守性分析。对候选致病基因变异采用Sanger测序，进一步在家系成员中进行基因型和表型的共分离验证。参照美国医学遗传学和基因组学学会（ACMG）指南[16]对变异位点的致病性进行分析。
2 结果
先证者（Ⅱ-1），男，29岁。双眼视力下降20年。全身系统性检查无异常。双眼无明显眼球震颤。BCVA：右眼＋0.5/－0.75×20→0.3，左眼＋0.25/－0.5×165→0.4。双眼眼前节无明显异常。双眼黄斑区颜色晦暗，中心凹反光消失；视网膜未见明显色素沉着（图2A）。眼底AF检查，双眼黄斑中心凹弱荧光背景下强荧光斑点（图2B）。SS-OCT检查，双眼黄斑区外核层变薄，椭圆体带及嵌合体带光反射信号减弱（图2C）。自适应光学眼底成像，双眼黄斑中心10°视角内视锥细胞光反射信号失常、密度降低，部分区域视锥细胞萎缩透见视网膜色素上皮细胞（图2D，2E）。静态阈值视野检查，双眼呈不规则暗点（图2F）。全视野、多焦ERG检查，双眼视锥细胞功能严重降低，视杆细胞功能中度降低（图2G，2H）。其弟弟（Ⅱ-2），21岁。双眼视力下降10余年。全身系统性检查无异常。左眼眼球震颤。BCVA：右眼－5.25/－2×10→0.7，左眼－5.5/－2×180→0.4。双眼呈豹纹状眼底改变，其余表现同先证者。其父亲（Ⅰ-1）全身及眼部检查无异常；母亲（Ⅰ-2）除双眼高度近视外，其余眼部及全身检查无明显异常。
图2
CORD家系先证者（Ⅱ-1）左眼眼部检查像。2A示彩色眼底像，视网膜无明显色素沉着。2B示AF像，黄斑中心凹表现为弱荧光背景下的强荧光斑点。2C示SS-OCT像，黄斑区椭圆体带及嵌合体带光反射信号减弱。2D示自适应光学眼底成像，黄斑中心10°视角内视锥细胞光反射信号失常、密度降低；2E为2D右下角红色方框4°视角的放大像，部分区域视锥细胞萎缩透见RPE（白箭）。2F示视野检查灰度图，30°视野内多个不规则暗点。2G示多焦ERG检查结果，视锥细胞功能严重降低。2H示全视野ERG检查结果，视锥细胞功能严重降低，视杆细胞功能中度降低。CORD：视锥视杆细胞营养不良；AF：自身荧光；SS-OCT：扫频源光相干断层扫描；RPE：视网膜色素上皮；ERG：视网膜电图
基因检测结果显示，先证者（Ⅱ-1）及其弟弟（Ⅱ-2）均携带CEP290 c.950T>A（p.Leu317*）（M1）、c.4144_4149del （p.Tyr1382_Glu1383del）（M2）复合杂合突变。其父亲、母亲（Ⅰ-1、Ⅰ-2）分别携带M2、M1（图3）。M1、M2在gnomAD、ExAC、千人基因组计划等数据库中未见。M1为新发现无义突变，M2为新发现缺失突变，分别位于chr12-88520208、chr12-88481601。M1：Mutation Taster、CADD软件预测该变异位点为有害，GERP++显示其影响的氨基酸高度保守（图4）。根据ACMG指南，评估该变异位点为疑似致病性变异（PVS1+PM2）。M2根据ACMG指南，评估其致病性为临床意义未明变异（PM4+PM2）。先证者父母临床表型未见明显异常。Sanger测序验证，符合家系共分离。
图3
CORD家系先证者及其家系成员基因Sanger测序图。3A示先证者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其母亲（I-2）均携带M1：CEP290 c.950T＞A（p.Leu317*）变异；3B示先证者（Ⅱ-1）、其弟弟（Ⅱ-2）及其父亲（I-1）均携带M2：CEP290 c.4144_4149del（p.Tyr1382_Glu1383del）变异。CORD：视锥视杆细胞营养不良
图4
物种间序列保守性分析。4A、4B分别示Clustal Omega、Weblogo的分析结果。CEP290 p.Leu317*、p.Tyr1382_Glu1383del分别所对应的第317、1 382～1 383号氨基酸序列位点在斑马鱼、鸡、小鼠、大鼠、猪、牛、人、狗、马等物种中高度保守（红色线框、红箭）
3 讨论
本研究中2例CORD患者均携带M1、M2复合杂合突变，但眼部表型较轻，相对于CEP290基因相关的LCA或EOSRD，患者具有更好的视力及可记录到的ERG波形；SS-OCT检查可见黄斑部结构轻度异常。
CEP290基因变异所致的非综合征眼病多为LCA，多数患者出生时或出生不久即已失明，相对较轻的表型称为EOSRD[2-3, 6]。目前已发现，与LCA相关的14个致病基因中CEP290较为常见[17]。CEP290基因最常见突变位点是c.2991+1655A＞G（p.Cys998X）内含子变异，主要出现在欧洲西北部和美国，占所有LCA患者的26%[3, 18]。该突变位点常导致较重的表型[2]，患者出生后即表现出严重视力损害、眼球震颤、远视、不可记录的ERG波形、异常瞳孔反应以及明显的眼底异常[19-20]，但病程进展缓慢[21-22]。国内该突变位点出现较少[20]。
c.2991+1655A>G纯合子变异的患者倾向于具有较轻的视网膜表型[19]。但一项针对德裔患者的研究显示，该纯合变异患者较携带该内含子变异的复合杂合子患者表现出更严重的表型[23]。Chen等[1]报道1例携带CEP290 c.3310-1_3313delGCTTA、c.1666dupA复合杂合变异的LCA女性患儿，出生后5个月即检测到ERG严重异常。而Vilaplana等[6]报道1例CEP290 c.4028delA、c.5254C>T复合杂合致病变异相关CORD女性患者，57岁时仍保留20/100的视力。 Rafalska等[24]发现，CEP290基因4号内含子C.250+2T>C和第51外显子c.7027del复合杂合变异女性RP患者，30岁时仍有较好的黄斑中心凹解剖结构及中心视力。Barny等[25]报道携带c.1824+3A>G、c.6869dup 复合杂合变异的两兄妹具有相对轻微的视网膜营养不良表现，保留较好的中心视力。Birtel等[26]报道1例12号外显子c.982C>T和26号内含子c.2991+1655A>G复合杂合变异的女性患者，27岁时诊断为RP，70岁时视力仍有光感。
CEP290基因相关视网膜变性患者的视力与基因型、年龄、黄斑中心残留光感受器层厚度无显著相关性[27-28]。但也有研究显示，不伴眼球震颤的患者中央视网膜厚度保留更多，具有更好的视力[2]。尽管CEP290基因突变引起不同表型的原因尚不明确，但有研究者认为，CEP290基因多效性的起源不是突变对蛋白质功能的影响，而是与携带CEP290基因变异的细胞中保存部分或者全长CEP290蛋白的表达量有关[11, 29-30]。在c.2991+1655A>G变异的LCA患者淋巴母细胞或成纤维细胞中检测到的功能性CEP290蛋白含量减少约50% [19]。携带CEP290基因变异的成纤维细胞形成纤毛结构的能力降低，而慢病毒载体转导的CEP290基因能够弥补这种纤毛形成的缺陷[31]。
CEP290基因突变导致的遗传性视网膜疾病具有高度表型异质性。本研究确定了CEP290基因相关CORD新的复合杂合变异，拓宽了CEP290基因的致病基因谱。患者临床表型较轻，视锥、视杆细胞功能下降，黄斑区视锥细胞出现结构异常和密度下降时仅有轻度视觉损伤。相比国外发生率较高的内含子变异，本研究报道的新变异可引起相对较轻但在高分辨率影像检查中可见的视网膜结构改变。
