引用本文： 王勇, 曹靖靖, 寇振宇, 韩菲菲, 刘爱华, 东莉洁. 骨形成蛋白4靶向调控SMAD9表达影响Müller细胞迁移和活性氧产生. 中华眼底病杂志, 2023, 39(9): 754-759. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220818-00462 复制
糖尿病视网膜病变（DR）眼底表现复杂多样，包括神经胶原细胞损伤、血管内皮细胞破坏、新生血管形成和细胞外纤维成分聚集等[1]。Müller细胞是眼内最丰富的视网膜胶质细胞，贯穿视网膜全层，是神经血管单元核心[2-3]。由于其介于视网膜神经元和血管之间，具有独特的形态和定位，其不仅为周围神经元提供营养和代谢支持，而且可以重新分配和缓冲代谢废物、钾和神经递质[4]。体外研究表明，Müller细胞激活后会释放生长因子、趋化因子等细胞因子[5-6]，其中多数对视网膜细胞产生不利影响。Müller细胞可能参与DR血视网膜屏障完整性的改变、新血管形成、视网膜神经胶质增生及慢性炎症等过程。骨形成蛋白4（BMP4）是一组参与各种细胞过程的骨形态发生蛋白[7]。其在黑色素瘤中上调并促进平滑肌细胞的侵袭和迁移[8]。在斑马鱼胚胎中，BMP4可通过与SMAD元件结合进而增加血管内皮生长因子（VEGF）的释放，从而促进肾纤维化和血管生成细胞增生[9]。近年有研究报道，BMP4在DR或DR相关疾病的病理生理学中发挥重要功能[10]。我们前期研究发现，高糖诱导下，视网膜血管内皮细胞中BMP4表达有明显差异，可促进内皮细胞增生和迁移以促进血管生成[11]。BMP4可刺激视网膜色素上皮（RPE）细胞中VEGF分泌进而调节DR患者眼部血管生成[12]。此外，BMP4在高糖刺激的Müller细胞中过表达，进而上调Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和促炎细胞因子的水平[13]。然而，BMP4如何通过影响Müller细胞的功能进而影响DR的发生发展仍不清楚。本研究初步探讨Müller细胞中BMP4的表达水平及BMP4靶向调控其潜在下游分子SMAD同源物9（SMAD9）对Müller细胞增生迁移的作用机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人Müller细胞（MIO-M1）由天津医科大学眼科医院自行保存。BMP4（ab238298）、SMAD9（ab262940）、VEGF（ab32152）、GFAP（ab7260）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，ab8245）（英国Abcam公司）；谷氨酰胺合成酶（GS）（DF7341，美国Affnity公司）；2', 7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐（DCFH-DA）、辣根过氧化物（HRP）偶联的二抗（美国Sigma公司）；siRNA/miRNA体外转染试剂（40806ES02，中国Yeasan公司）。
1.2 方法
细胞培养与分组。Müller细胞置于含10％胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中常规培养。细胞密度达70%～80%时传代，取对数生长期细胞用于后续实验。细胞分为分为正常对照组、BMP4组、BMP4+空载质粒组（BMP4+NC组）、BMP4+SMAD9小干扰质粒组（BMP4+siSMAD9）。BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养基加入100 ng/ml BMP4诱导细胞24 h[14]。其后，BMP4+NC组转染空载质粒；BMP4+siSMAD9组转染SMAD9小干扰质粒48 h。正常对照组细胞置于DMEM完全培养基培养。siRNA设计：SMAD9正向引物：GGAUUUACAGAUCCUUCAATT，反向引物：UGAAGGAUCUGUAAAUCCTT；NC-siRNA正向引物：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向引物：ACGU GAGUU CGG AGAATT。
细胞划痕实验测定BMP4对Müller细胞迁移的影响。细胞密度达到70%～80%时，对细胞进行消化并且以6×105的细胞密度接种于6孔板中。于孔板中央作“十”字状划痕，并将此时计作0 h，继续培养12 h后在相同划痕位置拍照记录。应用ImageJ软件计算细胞迁移面积，迁移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸区面积，St：各时间点裸区面积）。
DCFH-DA探针检测BMP4对Müller细胞内ROS生成的影响。各组细胞与含有10 μmol/L DCFH-DA的50 μl 磷酸盐缓冲液于37 °C下孵育20 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测ROS表达情况。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测Müller细胞内SMAD9、GS、GFAP、VEGF蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入40 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h。牛血清白蛋白封闭，与一抗BMP4、SMAD9、VEGF、GS、GFAP 4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入HRP偶联的二抗，37 ℃孵育2 h。化学发光试剂盒显色，以GAPDH为内参，全自动化学发光图像分析仪曝光。应用Bio-Rad软件进行半定量分析。
实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测Müller细胞内GS、GFAP、SMAD9、VEGF mRNA相对表达量。按照试剂盒说明提取细胞总RNA（6 μg）。DNase I消化清除总RNA中残留的DNA杂质，将总RNA逆转录成cDNA。应用RevertAid cDNA合成试剂盒在20 μl反应混合物中对1 μg总RNA进行逆转录。SYBR Green qPCR Master Mix和Roche LC 480 qPCR系统进行qPCR。反应混合物包含SYBR Green FastStart、2倍Master Mix、cDNA模板和基因特异性引物。qPCR扩增条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s；59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 min，40个循环；95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，95℃作用15 s。以GAPDH作为内参。根据扩增曲线，输出循环阈值（CT），依照公式2−ΔΔCT法进行数据分析。
免疫荧光检测Müller细胞内VEGF的表达。4%多聚甲醛固定Müller细胞30 min，PBS清洗2次。0.1%Triton X-100的PBS渗透细胞5 min，5%脱脂奶粉孵育细胞。4 °C下与相应一抗过夜孵育，PBS洗涤细胞3次。室温下与10%山羊血清孵育2 h，荧光团（Alexa 488）结合的二级抗体对细胞进行染色，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚复染，甘油封片。荧光显微镜下观察拍照。
1.3 统计分析
采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用Student-t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 沉默SMAD9可降低BMP4诱导的Müller细胞迁移
细胞划痕实验检测结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞迁移率较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（F=68.319，P＜0.001）（图1）。
图1
沉默SMAD9对Müller细胞迁移的影响（n=6） 1A～1D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4组+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：200 μm）。BMP4+siSMAD9组仅有少量细胞迁移进入裸区，BMP4组、BMP4组+NC组可见大量细胞迁移进入裸区。1E示4组细胞迁移率比较，*** P＜0.001 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒
2.2 沉默SMAD9可降低BMP4诱导的Müller细胞ROS产生
DCFH-DA探针检测结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞内ROS水平较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（F=52.158，P＜0.001）（图2）。
图2
沉默SMAD9对Müller细胞ROS产生的影响（n=6） 2A～2D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4组+NC组、BMP4+siSMAD9组流式细胞仪检测图；2E示4组ROS水平比较。BMP4+siSMAD9组ROS水平较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，***P＜0.001 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；ROS：活性氧
2.3 沉默SMAD9可抑制Müller细胞活化标志物GS、GFAP表达
Western blot、qPCR检查结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞内GS、GFAP蛋白（F=42.715、36.618）、mRNA相对表达量（F=45.164、43.165）较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1，图3）。
表1
4组细胞内GS、GFAP蛋白相对表达量比较（x±s）
图3
4组细胞内GS、GFAP mRNA相对表达量（n=6） BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；GS：谷氨酰胺合成酶；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；**P＜0.01
2.4 沉默SMAD9可下调BMP4诱导的VEGF水平
免疫荧光检测结果显示，BMP4组、BMP4+NC组细胞内VEGF荧光强度较正常对照组、BMP4+siSMAD9组显著升高，差异有统计学意义（F=46.384，P＜0.05）（图4）。
图4
沉默SMAD9对BMP4诱导的VEGF表达的影响（n=6） 4A～4D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组荧光显微镜像（标尺：50 μm），绿色荧光为VEGF表达，蓝色荧光为细胞核染色。BMP4组、BMP4+NC组细胞内VEGF荧光强度较正常对照组、BMP4+siSMAD9组显著升高。4E示4组荧光强度比较，*P＜0.05 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；VEGF：血管内皮生长因子
3 讨论
Müller细胞作为视网膜中最为主要的胶质细胞，对双极细胞的稳态维持，能量供应等方面都起着重要的作用。因此，Müller细胞的功能障碍会严重影响视网膜神经细胞的活动，从而引起视力下降[15]。氧化应激是指氧化成分和抗氧化成分的失衡，在目前的研究中主要是氧化成分过多，包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2－）、ROS等。过氧化物主要是由细胞内的线粒体所产生，当线粒体功能障碍时就会引起大量的过氧化物的产生，而过氧化物的产生又会引起线粒体的损伤从而进入细胞胞质内[16]。一方面，胞质内的ROS可以通过如BMP4/SMAD信号通路引起细胞功能改变；另一方面，线粒体的损伤也会因为能量供应问题而引起细胞的损伤。
本研究结果显示，BMP4可显著促进Müller细胞迁移及ROS生成，并上调SMAD9的表达水平；沉默SMAD9可有效拮抗BMP4的作用，包括降低Müller细胞的迁移率并减少Müller细胞中ROS的生成。此外，BMP4可显著上调Müller细胞标志物GS、GFAP的表达，并可促进VEGF的表达，同时沉默SMAD9可发挥其拮抗BMP4的作用，即下调GS、GFAP和VEGF的表达。因此，我们推测BMP4可通过上调SMAD9表达进而促进Müller细胞的迁移及ROS生成。
本研究结果显示，BMP4组细胞迁移率明显增加，且ROS生成亦明显增高。BMP信号转导参与DR相关细胞的生理和病理过程调节。前期研究发现，BMP4和SMAD9在DR的体内动物模型和体外多种细胞模型（包括视网膜内皮细胞、Müller细胞及RPE细胞）中均表达上调[11]。BMP4可通过促进内皮运动和侵袭及细胞增生以促进血管生成[10]。我们前期研究也发现4-羟基壬烯醛诱导状态下，视网膜血管内皮细胞中BMP4表达上调，BMP4可促进内皮细胞增生和迁移以促进血管生成[17]。因此，BMP4可促进Müller细胞的迁移及细胞ROS的生成。
BMP4可通过与BMP激活的SMAD结合元件结合，影响R-SMAD（SMAD1、SMAD5和SMAD9）的磷酸化并与SMAD4形成复合物，最终激活BMP靶基因，从而以剂量和时间依赖性方式增加VEGF分泌[18]。大量研究表明，BMP4在C2C12、H9c2、3T3-L1、HepG2、B16细胞和原代成纤维细胞等许多细胞类型中上调SMAD9表达[19-20]。据此我们推测，BMP4在Müller细胞模型中通过SMAD9来发挥作用，进而导致细胞的损伤。
本研究结果显示，BMP4可显著上调VEGF表达；沉默SMAD9可发挥其拮抗BMP4的作用，即下调VEGF表达。此外，采用BMP4处理的ARPE-19细胞显示分泌到培养基中的VEGF显著增加，表明BMP4可能通过VEGF诱导的机制促进眼部血管生成[12]。研究表明，高糖诱导Müller细胞活化和炎性细胞因子产生，BMP4在Müller细胞中上调，miR-340-5p过表达对炎症细胞因子VEGF、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α分泌的抑制作用可被BMP4上调所抵消，提示BMP4可促进Müller细胞的活化和炎症细胞因子的产生[13]。因此，本研究推测BMP4可能通过调控SMAD9的表达进而促进Müller细胞的迁移及ROS生成。
视网膜新生血管和纤维化是增生型DR的标志。近年，有学者提出在DR中应用双靶点治疗的思路，即抑制新生血管以及抑制纤维化在DR的治疗中被认为是同等重要的。本研究发现BMP4经调控SMAD9表达进而促进Müller细胞的迁移，这提示通过拮抗BMP4和SMAD9可能在治疗DR中发挥重要且全面的作用。拮抗BMP4和SMAD9的表达有望成为增生型DR双靶点治疗的潜在靶点，同时也将成为本课题组今后的研究和探索方向。
糖尿病视网膜病变（DR）眼底表现复杂多样，包括神经胶原细胞损伤、血管内皮细胞破坏、新生血管形成和细胞外纤维成分聚集等[1]。Müller细胞是眼内最丰富的视网膜胶质细胞，贯穿视网膜全层，是神经血管单元核心[2-3]。由于其介于视网膜神经元和血管之间，具有独特的形态和定位，其不仅为周围神经元提供营养和代谢支持，而且可以重新分配和缓冲代谢废物、钾和神经递质[4]。体外研究表明，Müller细胞激活后会释放生长因子、趋化因子等细胞因子[5-6]，其中多数对视网膜细胞产生不利影响。Müller细胞可能参与DR血视网膜屏障完整性的改变、新血管形成、视网膜神经胶质增生及慢性炎症等过程。骨形成蛋白4（BMP4）是一组参与各种细胞过程的骨形态发生蛋白[7]。其在黑色素瘤中上调并促进平滑肌细胞的侵袭和迁移[8]。在斑马鱼胚胎中，BMP4可通过与SMAD元件结合进而增加血管内皮生长因子（VEGF）的释放，从而促进肾纤维化和血管生成细胞增生[9]。近年有研究报道，BMP4在DR或DR相关疾病的病理生理学中发挥重要功能[10]。我们前期研究发现，高糖诱导下，视网膜血管内皮细胞中BMP4表达有明显差异，可促进内皮细胞增生和迁移以促进血管生成[11]。BMP4可刺激视网膜色素上皮（RPE）细胞中VEGF分泌进而调节DR患者眼部血管生成[12]。此外，BMP4在高糖刺激的Müller细胞中过表达，进而上调Müller细胞中胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和促炎细胞因子的水平[13]。然而，BMP4如何通过影响Müller细胞的功能进而影响DR的发生发展仍不清楚。本研究初步探讨Müller细胞中BMP4的表达水平及BMP4靶向调控其潜在下游分子SMAD同源物9（SMAD9）对Müller细胞增生迁移的作用机制。
1 材料和方法
1.1 主要材料
人Müller细胞（MIO-M1）由天津医科大学眼科医院自行保存。BMP4（ab238298）、SMAD9（ab262940）、VEGF（ab32152）、GFAP（ab7260）、磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，ab8245）（英国Abcam公司）；谷氨酰胺合成酶（GS）（DF7341，美国Affnity公司）；2', 7'-二氯二氢荧光素双乙酸盐（DCFH-DA）、辣根过氧化物（HRP）偶联的二抗（美国Sigma公司）；siRNA/miRNA体外转染试剂（40806ES02，中国Yeasan公司）。
1.2 方法
细胞培养与分组。Müller细胞置于含10％胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中常规培养。细胞密度达70%～80%时传代，取对数生长期细胞用于后续实验。细胞分为分为正常对照组、BMP4组、BMP4+空载质粒组（BMP4+NC组）、BMP4+SMAD9小干扰质粒组（BMP4+siSMAD9）。BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养基加入100 ng/ml BMP4诱导细胞24 h[14]。其后，BMP4+NC组转染空载质粒；BMP4+siSMAD9组转染SMAD9小干扰质粒48 h。正常对照组细胞置于DMEM完全培养基培养。siRNA设计：SMAD9正向引物：GGAUUUACAGAUCCUUCAATT，反向引物：UGAAGGAUCUGUAAAUCCTT；NC-siRNA正向引物：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT，反向引物：ACGU GAGUU CGG AGAATT。
细胞划痕实验测定BMP4对Müller细胞迁移的影响。细胞密度达到70%～80%时，对细胞进行消化并且以6×105的细胞密度接种于6孔板中。于孔板中央作“十”字状划痕，并将此时计作0 h，继续培养12 h后在相同划痕位置拍照记录。应用ImageJ软件计算细胞迁移面积，迁移率=（S0-St）/S0×100%（S0：原始裸区面积，St：各时间点裸区面积）。
DCFH-DA探针检测BMP4对Müller细胞内ROS生成的影响。各组细胞与含有10 μmol/L DCFH-DA的50 μl 磷酸盐缓冲液于37 °C下孵育20 min，PBS洗涤2次，流式细胞仪检测ROS表达情况。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测Müller细胞内SMAD9、GS、GFAP、VEGF蛋白相对表达量。收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入40 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h。牛血清白蛋白封闭，与一抗BMP4、SMAD9、VEGF、GS、GFAP 4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入HRP偶联的二抗，37 ℃孵育2 h。化学发光试剂盒显色，以GAPDH为内参，全自动化学发光图像分析仪曝光。应用Bio-Rad软件进行半定量分析。
实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）检测Müller细胞内GS、GFAP、SMAD9、VEGF mRNA相对表达量。按照试剂盒说明提取细胞总RNA（6 μg）。DNase I消化清除总RNA中残留的DNA杂质，将总RNA逆转录成cDNA。应用RevertAid cDNA合成试剂盒在20 μl反应混合物中对1 μg总RNA进行逆转录。SYBR Green qPCR Master Mix和Roche LC 480 qPCR系统进行qPCR。反应混合物包含SYBR Green FastStart、2倍Master Mix、cDNA模板和基因特异性引物。qPCR扩增条件：95 ℃预变性1 min，95 ℃变性15 s；59 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 min，40个循环；95 ℃反应15 s，60 ℃反应1 min，95℃作用15 s。以GAPDH作为内参。根据扩增曲线，输出循环阈值（CT），依照公式2−ΔΔCT法进行数据分析。
免疫荧光检测Müller细胞内VEGF的表达。4%多聚甲醛固定Müller细胞30 min，PBS清洗2次。0.1%Triton X-100的PBS渗透细胞5 min，5%脱脂奶粉孵育细胞。4 °C下与相应一抗过夜孵育，PBS洗涤细胞3次。室温下与10%山羊血清孵育2 h，荧光团（Alexa 488）结合的二级抗体对细胞进行染色，4', 6-二脒基-2-苯基吲哚复染，甘油封片。荧光显微镜下观察拍照。
1.3 统计分析
采用SPSS22.0软件进行统计分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用Student-t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 沉默SMAD9可降低BMP4诱导的Müller细胞迁移
细胞划痕实验检测结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞迁移率较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（F=68.319，P＜0.001）（图1）。
图1
沉默SMAD9对Müller细胞迁移的影响（n=6） 1A～1D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4组+NC组、BMP4+siSMAD9组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：200 μm）。BMP4+siSMAD9组仅有少量细胞迁移进入裸区，BMP4组、BMP4组+NC组可见大量细胞迁移进入裸区。1E示4组细胞迁移率比较，*** P＜0.001 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒
2.2 沉默SMAD9可降低BMP4诱导的Müller细胞ROS产生
DCFH-DA探针检测结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞内ROS水平较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（F=52.158，P＜0.001）（图2）。
图2
沉默SMAD9对Müller细胞ROS产生的影响（n=6） 2A～2D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4组+NC组、BMP4+siSMAD9组流式细胞仪检测图；2E示4组ROS水平比较。BMP4+siSMAD9组ROS水平较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，***P＜0.001 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；ROS：活性氧
2.3 沉默SMAD9可抑制Müller细胞活化标志物GS、GFAP表达
Western blot、qPCR检查结果显示，BMP4+siSMAD9组细胞内GS、GFAP蛋白（F=42.715、36.618）、mRNA相对表达量（F=45.164、43.165）较BMP4组、BMP4+NC组显著降低，差异有统计学意义（P＜0.01）（表1，图3）。
表1
4组细胞内GS、GFAP蛋白相对表达量比较（x±s）
图3
4组细胞内GS、GFAP mRNA相对表达量（n=6） BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；GS：谷氨酰胺合成酶；GFAP：胶质纤维酸性蛋白；**P＜0.01
2.4 沉默SMAD9可下调BMP4诱导的VEGF水平
免疫荧光检测结果显示，BMP4组、BMP4+NC组细胞内VEGF荧光强度较正常对照组、BMP4+siSMAD9组显著升高，差异有统计学意义（F=46.384，P＜0.05）（图4）。
图4
沉默SMAD9对BMP4诱导的VEGF表达的影响（n=6） 4A～4D分别示正常对照组、BMP4组、BMP4+NC组、BMP4+siSMAD9组荧光显微镜像（标尺：50 μm），绿色荧光为VEGF表达，蓝色荧光为细胞核染色。BMP4组、BMP4+NC组细胞内VEGF荧光强度较正常对照组、BMP4+siSMAD9组显著升高。4E示4组荧光强度比较，*P＜0.05 BMP4：骨形成蛋白4；BMP4+NC：BMP4+转染转染空载质粒；BMP4+siSMAD9：BMP4+转染SMAD9小干扰质粒；VEGF：血管内皮生长因子
3 讨论
Müller细胞作为视网膜中最为主要的胶质细胞，对双极细胞的稳态维持，能量供应等方面都起着重要的作用。因此，Müller细胞的功能障碍会严重影响视网膜神经细胞的活动，从而引起视力下降[15]。氧化应激是指氧化成分和抗氧化成分的失衡，在目前的研究中主要是氧化成分过多，包括过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2－）、ROS等。过氧化物主要是由细胞内的线粒体所产生，当线粒体功能障碍时就会引起大量的过氧化物的产生，而过氧化物的产生又会引起线粒体的损伤从而进入细胞胞质内[16]。一方面，胞质内的ROS可以通过如BMP4/SMAD信号通路引起细胞功能改变；另一方面，线粒体的损伤也会因为能量供应问题而引起细胞的损伤。
本研究结果显示，BMP4可显著促进Müller细胞迁移及ROS生成，并上调SMAD9的表达水平；沉默SMAD9可有效拮抗BMP4的作用，包括降低Müller细胞的迁移率并减少Müller细胞中ROS的生成。此外，BMP4可显著上调Müller细胞标志物GS、GFAP的表达，并可促进VEGF的表达，同时沉默SMAD9可发挥其拮抗BMP4的作用，即下调GS、GFAP和VEGF的表达。因此，我们推测BMP4可通过上调SMAD9表达进而促进Müller细胞的迁移及ROS生成。
本研究结果显示，BMP4组细胞迁移率明显增加，且ROS生成亦明显增高。BMP信号转导参与DR相关细胞的生理和病理过程调节。前期研究发现，BMP4和SMAD9在DR的体内动物模型和体外多种细胞模型（包括视网膜内皮细胞、Müller细胞及RPE细胞）中均表达上调[11]。BMP4可通过促进内皮运动和侵袭及细胞增生以促进血管生成[10]。我们前期研究也发现4-羟基壬烯醛诱导状态下，视网膜血管内皮细胞中BMP4表达上调，BMP4可促进内皮细胞增生和迁移以促进血管生成[17]。因此，BMP4可促进Müller细胞的迁移及细胞ROS的生成。
BMP4可通过与BMP激活的SMAD结合元件结合，影响R-SMAD（SMAD1、SMAD5和SMAD9）的磷酸化并与SMAD4形成复合物，最终激活BMP靶基因，从而以剂量和时间依赖性方式增加VEGF分泌[18]。大量研究表明，BMP4在C2C12、H9c2、3T3-L1、HepG2、B16细胞和原代成纤维细胞等许多细胞类型中上调SMAD9表达[19-20]。据此我们推测，BMP4在Müller细胞模型中通过SMAD9来发挥作用，进而导致细胞的损伤。
本研究结果显示，BMP4可显著上调VEGF表达；沉默SMAD9可发挥其拮抗BMP4的作用，即下调VEGF表达。此外，采用BMP4处理的ARPE-19细胞显示分泌到培养基中的VEGF显著增加，表明BMP4可能通过VEGF诱导的机制促进眼部血管生成[12]。研究表明，高糖诱导Müller细胞活化和炎性细胞因子产生，BMP4在Müller细胞中上调，miR-340-5p过表达对炎症细胞因子VEGF、白细胞介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子-α分泌的抑制作用可被BMP4上调所抵消，提示BMP4可促进Müller细胞的活化和炎症细胞因子的产生[13]。因此，本研究推测BMP4可能通过调控SMAD9的表达进而促进Müller细胞的迁移及ROS生成。
视网膜新生血管和纤维化是增生型DR的标志。近年，有学者提出在DR中应用双靶点治疗的思路，即抑制新生血管以及抑制纤维化在DR的治疗中被认为是同等重要的。本研究发现BMP4经调控SMAD9表达进而促进Müller细胞的迁移，这提示通过拮抗BMP4和SMAD9可能在治疗DR中发挥重要且全面的作用。拮抗BMP4和SMAD9的表达有望成为增生型DR双靶点治疗的潜在靶点，同时也将成为本课题组今后的研究和探索方向。
