引用本文： 焦明菲, 曹靖靖, 李辉, 寇振宇, 吴桂佳, 东莉洁. 二甲双胍抑制糖尿病视网膜血管内皮细胞中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3炎症小体活化和细胞焦亡. 中华眼底病杂志, 2023, 39(5): 408-414. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20220818-00463 复制
高血糖和炎症是影响糖尿病视网膜病变（DR）病理生理的主要因素。在DR模型中，包括内皮细胞、周细胞、Müller细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞在内的许多类型视网膜细胞中存在细胞焦亡[1]。细胞焦亡是由炎性小体引发的一种细胞程序性死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂。核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体介导效应蛋白炎性半胱天冬酶1（Caspase-1）激活，同时可调节Caspase-1依赖的细胞焦亡[2]。研究表明，高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）焦亡，NLRP3、Caspase-1活性显著增加[3]。在RPE细胞中，NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）和cleaved-Caspase-1的蛋白表达水平随葡萄糖浓度升高而增加[4]。因此，NLRP3/cleaved-Caspase-1/cleaved-GSDMD在促进高血糖诱导的DR细胞焦亡方面发挥重要作用。二甲双胍（Met）是治疗2型糖尿病（DM）的一线药物，具有抗炎、抗氧化及降低血糖作用。近期研究表明，Met具有治疗DM相关微血管并发症的辅助作用，以剂量依赖性方式抑制血管生成，降低hRMEC中核因子（NF）-κB p65、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和白细胞介素（IL）-8等炎性因子的表达[5]。长期服用Met可有效降低严重非增生型DR或增生型DR的发生率。目前已有大量研究深入探讨DR发病的病理生理机制，但细胞焦亡在DR的发病机制中发挥的作用及Met对细胞焦亡的抑制作用研究较少。本研究目的是评估Met在小鼠视网膜中及在用晚期糖基化终末产物（AGE）处理的hRMEC中的抗焦亡作用及机制，初步探索经抗焦亡途径治疗DR的新药物。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
本研究由天津医科大学眼科医院动物伦理委员会批准（动物伦理批号：TJYY20190103002）。
动物模型建立及分组。8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠9只，随机分为DM组、正常对照组、DM+Met处理组（DM+Met组），每组各3只小鼠。正常对照组小鼠常规饲养，不作任何处理。DM组、DM+Met组小鼠禁食12 h后，按体重腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素，连续5 d，1周后小鼠尾静脉平均血糖＞16.7 mmol/L为建模成功[6]。DM+Met组给予二甲双胍250 mg/（kg·d）灌胃，连续14 d。建模后8周进行后续实验。
免疫组织化学染色检测正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜血管内皮细胞层中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，苏木精-伊红染色[7]。其后依次透膜、封闭，与一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min，清洗加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育30 min，清洗后甘油封片，光学显微镜下观察。应用Image J软件图像分析视网膜血管内皮细胞层中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达情况。实验重复3次。
1.2 体外细胞实验
细胞培养与分组。hRMEC（本实验室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基中常规培养。细胞分为常规细胞培养组（N组）、AGE诱导组（AGE组）、AGE+Met处理组（AGE+Met组）。N组细胞常规培养，不作任何处理；AGE组、AGE+Met组加入150 μg/ml AGE诱导细胞72 h；AGE+Met组同时加入2.0 mmol/L Met处理72 h。
流式细胞仪检测hRMEC焦亡率。N组、AGE组、AGE+Met组细胞按分组处理后，消化细胞后离心收集细胞，PBS浸洗，再离心去上清，按照膜联蛋白-V（Annexin-V）-APC/7-氨基放线菌素（7-AAD）试剂盒说明操作，加入Annexin V-APC溶液室温下避光反应15 min，再加入7-AAD染色液避光反应5 min，流式细胞仪检测各组细胞晚期（双阳性细胞）焦亡率，焦亡细胞为红色荧光。每组样品设置3个副孔Annexin-V，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复3次，检测结果通过Flowjo7.6软件进行分析。
2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测hRMEC中活性氧（ROS）表达。N组、AGE组、AGE+Met组细胞按分组处理后，无血清培养基配置线粒体超氧化物荧光探针DCFDA（终浓度2.5 μmol/L），孔板中孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞中ROS水平。实验重复3次。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1蛋白相对表达量。收集各组细胞，取40 μg蛋白样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V恒压0.5 h，分离胶100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，二喹啉甲酸封闭，一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1（美国Affnity公司） 4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（美国Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化学发光底物进行曝光并拍照。以β-肌动蛋白（actin）为内参照，采用Bio-Rad软件分析目的蛋白表达量。实验重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1 mRNA相对表达量。应用总RNA提取试剂盒（上海怡泽生物科技有限公司）纯化总RNA，分光光度计检测其浓度，逆转录酶（武汉赛维尔生物科技有限公司）合成cDNA，以β-actin为内参照。应用Primer Premier软件设计引物序列（表1）。PCR反应体系包括2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合。PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，59℃退火15 s，72℃延伸10 min，40个循环；95℃反应15 s，60℃反应1 min，95℃作用15 s。实时荧光定量PCR（瑞士Roche 公司LC480）进行检测，通过2−△△CT计算mRNA相对表达量。实验重复3次。
表1
基因扩增测序引物
1.3 统计学分析
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（
）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析，分析前对数据的方差齐性进行检验。采用Graph-Prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体内动物实验结果
与DM组比较，正常对照组、DM+Met组小鼠视网膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达显著下降。三组间NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达比较，差异有统计学意义（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）（图1）。
图1
正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达比较（n=6） DM：糖尿病；Met：二甲双胍；NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；正常对照组：常规饲养，不作任何处理；DM组：糖尿病组；DM+Met组：给予Met 400 mg/（kg·d）干预。**P＜0.01
2.2 体外细胞实验
流式细胞仪检测结果显示，N组、AGE组、AGE+Met组细胞焦亡率分别为3.80%、69.20%、39.86%；N组、AGE+Met组细胞焦亡率显著低于AGE组，差异有统计学意义（F=32.598，P＜0.01）（图2）。
图2
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC焦亡率比较（n=3） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Annexin-V-PE：膜联蛋白-V-聚乙烯；7-AAD：7-氨基放线菌素；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。2A～2C分别示N组、AGE组、AGE+Met组流式细胞仪检测像；2D示3组细胞焦亡率比较，**P＜0.01
DCFH-DA荧光探针检测结果显示，N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内ROS表达量分别为1.26×101、1.00×103、1.20×101；AGE组ROS表达水平较N组、AGE+Met组显著升高，差异有统计学意义（F=47.267，P＜0.01）（图3）。
图3
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内ROS水平比较（n=3） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ROS：活性氧；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。3A示3组流式细胞仪检测像；3B示3组ROS水平比较，**P＜0.01
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA相对表达量分别为1.63±0.15、6.22±0.02、1.75±0.07，1.54±0.09、 6.25±0.07、1.62±0.11和1.59±0.07、5.93±0.04、1.64±0.11；蛋白相对表达量分别为0.50、1.05、0.57，0.73、1.30、0.86和0.55、1.15、0.75。与N组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相对表达量比较，AGE组均升高，AGE+Met组均降低，差异有统计学意义（mRNA相对表达量：F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01；蛋白相对表达量：F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）（图4）。
图4
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA、蛋白相对表达量比较（n=6） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。4A示3组mRNA相对表达量结果，**P＜0.01；4B分别示3组蛋白相对表达量结果，**P＜0.01
3 讨论
大量研究表明，炎症和氧化应激可造成视网膜损伤和细胞死亡，进而导致DR的发生发展[8]。AGE在人体内的积累可能诱发氧化应激，导致内皮细胞功能障碍[9]，因此在体外模型中，本研究采用AGE诱导以模拟DR中血管内皮细胞的氧化应激反应。
细胞焦亡是由炎性小体引发的一种炎症状态下的细胞程序性死亡。这与在一定生理或病理条件下，受体内遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的细胞焦亡完全不同。细胞焦亡主要依靠炎性小体激活Caspase-1，使其激活并切割GSDMD，活化的GSDMD转位到膜上，形成孔洞，细胞肿胀，胞质外流，最终导致细胞膜破裂，细胞焦亡[10]。NLRP3作为最具特征的炎性小体，可被广泛的危险信号激活，这些信号可能来自微生物或代谢失调异常产物。ROS是主要来源于线粒体的氧代谢副产物，可以积累和破坏DNA、脂质、蛋白质和线粒体DNA等细胞成分，参与众多与眼病相关的病理过程。过量ROS的产生会导致氧化应激。ROS可通过从其抑制剂硫氧还蛋白中释放对ROS敏感的NLRP3配体硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP），进而导致NLRP3炎性小体的激活。NLRP3炎性小体的激活是诱导炎症反应及细胞焦亡的关键机制[11]。原花青素可通过减少ROS的产生并抑制NLRP3炎性小体的活化来减轻高糖诱导的RPE细胞损伤[12]。AGE诱导ROS的大量产生可导致NLRP3炎性小体的过度活化和炎症级联反应，最终导致角膜上皮细胞的慢性炎症和焦亡[13]。有研究发现，hRMEC中高糖对ROS的诱导增加了TXNIP的表达，进而触发NLRP3炎症小体的激活，NLRP3基因沉默导致IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、血管内皮生长因子、ICAM-1减少，表明NLRP3炎性小体是炎性级联反应的关键引发剂。而米诺环素可通过ROS-TXNIP通路介导的NLRP3活性抑制减轻DM大鼠的视网膜血管通透性并抑制hRMEC的焦亡[14]。本研究结果显示，AGE组hRMEC内ROS大量产生，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达水平上调。这表明AGE-ROS-NLRP3-Caspase-1-GSDMD轴介导的炎症及细胞焦亡参与了DR的发病机制。
Met是一种双胍类药物，广泛应用于2型DM治疗。其通过抑制肝脏糖异生、激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及抑制线粒体ROS对细胞代谢的直接影响发挥其主要抗糖作用[15]。Met对正常细胞和组织在某些情况下具有自我保护作用。线粒体是Met的主要亚细胞靶点，其中线粒体复合物Ⅰ抑制的直接结果是减少ROS的产生。既往研究表明，Met可减弱百草枯诱导的ROS升高及相关DNA损伤和突变。从Met治疗8周的小鼠中分离出的脂肪干细胞中ROS和一氧化氮减少，而超氧化物歧化酶水平上调，这也提示Met触发了抗氧化反应。Met可通过减弱ROS的生成来抑制缺血再灌注诱导的脂肪肝氧化应激[16]。
此外，新近研究数据表明，Met对视网膜相关疾病亦具有抗炎、抗血管生成和抗氧化保护作用，包括DR、老年性黄斑变性、遗传性视网膜变性、原发性开角型青光眼、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎等。葡萄膜炎患者房水IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-18水平升高，Met可以激活AMPK，抑制环氧合酶2、诱导型一氧化氮合酶和NF-κB的激活，从而抑制以上因子的表达[17]。Met还可以抑制TNF诱导的ICAM-1和MCP-1的表达，以及抑制内皮细胞增生、迁移和管腔形成，从而防止视网膜新生血管形成[18]。文献报道，Met可通过调节AMPK和去乙酰化酶抑制炎症、ROS生成、内皮细胞衰老和新生血管形成，从而抑制DM及其并发症的发展，这可能是预防或减轻DR的潜在机制[19]。因此，启发我们探索Met在DR中的具体治疗机制，即是否可通过抑制ROS的生成进而抑制细胞焦亡，以达到治疗DR的目的。本研究结果显示，AGE+Met组hRMEC中ROS水平下降，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达水平下调，表明Met的应用可减少ROS的产生并抑制细胞焦亡。
尽管本研究已初步明确AGE可诱导ROS大量产生，激活NLRP3炎性小体，导致hRMEC的炎症反应及细胞焦亡，而Met可减少ROS的产生并抑制NLRP3的活化进而抑制细胞焦亡，但在实验设计方面仍然存在一定局限性和不足之处。一方面存在剂量值和观察时间点单一的问题，会影响对结果的动态或深入分析；另一方面，研究结果还仅仅停留在Met对NLRP3炎症小体活化和焦亡的影响，但对Met发挥作用的分子机制尚未能很好地阐明。未来我们将进一步深入研究Met通过抑制细胞焦亡对病理性新生血管相关疾病的保护作用及机制，并取多个时间点及剂量浓度，实现对量效关系的动态解读，并引入NLRP3的激动剂以期全方位多层次探究Met的作用及机制，明确其抗炎和抗焦亡的作用。
高血糖和炎症是影响糖尿病视网膜病变（DR）病理生理的主要因素。在DR模型中，包括内皮细胞、周细胞、Müller细胞和视网膜色素上皮（RPE）细胞在内的许多类型视网膜细胞中存在细胞焦亡[1]。细胞焦亡是由炎性小体引发的一种细胞程序性死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂。核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体介导效应蛋白炎性半胱天冬酶1（Caspase-1）激活，同时可调节Caspase-1依赖的细胞焦亡[2]。研究表明，高糖诱导人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）焦亡，NLRP3、Caspase-1活性显著增加[3]。在RPE细胞中，NLRP3、cleaved-膜穿孔蛋白D（GSDMD）和cleaved-Caspase-1的蛋白表达水平随葡萄糖浓度升高而增加[4]。因此，NLRP3/cleaved-Caspase-1/cleaved-GSDMD在促进高血糖诱导的DR细胞焦亡方面发挥重要作用。二甲双胍（Met）是治疗2型糖尿病（DM）的一线药物，具有抗炎、抗氧化及降低血糖作用。近期研究表明，Met具有治疗DM相关微血管并发症的辅助作用，以剂量依赖性方式抑制血管生成，降低hRMEC中核因子（NF）-κB p65、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、单核细胞趋化蛋白（MCP）-1和白细胞介素（IL）-8等炎性因子的表达[5]。长期服用Met可有效降低严重非增生型DR或增生型DR的发生率。目前已有大量研究深入探讨DR发病的病理生理机制，但细胞焦亡在DR的发病机制中发挥的作用及Met对细胞焦亡的抑制作用研究较少。本研究目的是评估Met在小鼠视网膜中及在用晚期糖基化终末产物（AGE）处理的hRMEC中的抗焦亡作用及机制，初步探索经抗焦亡途径治疗DR的新药物。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
本研究由天津医科大学眼科医院动物伦理委员会批准（动物伦理批号：TJYY20190103002）。
动物模型建立及分组。8周龄健康雄性C57BL/6J小鼠9只，随机分为DM组、正常对照组、DM+Met处理组（DM+Met组），每组各3只小鼠。正常对照组小鼠常规饲养，不作任何处理。DM组、DM+Met组小鼠禁食12 h后，按体重腹腔注射50 mg/kg链脲佐菌素，连续5 d，1周后小鼠尾静脉平均血糖＞16.7 mmol/L为建模成功[6]。DM+Met组给予二甲双胍250 mg/（kg·d）灌胃，连续14 d。建模后8周进行后续实验。
免疫组织化学染色检测正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜血管内皮细胞层中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的表达。每组随机选取3只小鼠，过量麻醉处死，摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，苏木精-伊红染色[7]。其后依次透膜、封闭，与一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min，清洗加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，室温孵育30 min，清洗后甘油封片，光学显微镜下观察。应用Image J软件图像分析视网膜血管内皮细胞层中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达情况。实验重复3次。
1.2 体外细胞实验
细胞培养与分组。hRMEC（本实验室自行保存）置于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合液的Dulbecco改良Eagle培养基中常规培养。细胞分为常规细胞培养组（N组）、AGE诱导组（AGE组）、AGE+Met处理组（AGE+Met组）。N组细胞常规培养，不作任何处理；AGE组、AGE+Met组加入150 μg/ml AGE诱导细胞72 h；AGE+Met组同时加入2.0 mmol/L Met处理72 h。
流式细胞仪检测hRMEC焦亡率。N组、AGE组、AGE+Met组细胞按分组处理后，消化细胞后离心收集细胞，PBS浸洗，再离心去上清，按照膜联蛋白-V（Annexin-V）-APC/7-氨基放线菌素（7-AAD）试剂盒说明操作，加入Annexin V-APC溶液室温下避光反应15 min，再加入7-AAD染色液避光反应5 min，流式细胞仪检测各组细胞晚期（双阳性细胞）焦亡率，焦亡细胞为红色荧光。每组样品设置3个副孔Annexin-V，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复3次，检测结果通过Flowjo7.6软件进行分析。
2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针检测hRMEC中活性氧（ROS）表达。N组、AGE组、AGE+Met组细胞按分组处理后，无血清培养基配置线粒体超氧化物荧光探针DCFDA（终浓度2.5 μmol/L），孔板中孵育30 min，流式细胞仪检测各组细胞中ROS水平。实验重复3次。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1蛋白相对表达量。收集各组细胞，取40 μg蛋白样品行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，浓缩胶80 V恒压0.5 h，分离胶100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，二喹啉甲酸封闭，一抗NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1（美国Affnity公司） 4 ℃过夜孵育，磷酸盐缓冲液（PBS）洗膜10 min，3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（美国Sigma公司），37 ℃孵育1 h，PBS洗膜10 min，3次；加入化学发光底物进行曝光并拍照。以β-肌动蛋白（actin）为内参照，采用Bio-Rad软件分析目的蛋白表达量。实验重复3次。
实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved- Caspase-1 mRNA相对表达量。应用总RNA提取试剂盒（上海怡泽生物科技有限公司）纯化总RNA，分光光度计检测其浓度，逆转录酶（武汉赛维尔生物科技有限公司）合成cDNA，以β-actin为内参照。应用Primer Premier软件设计引物序列（表1）。PCR反应体系包括2 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合。PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，59℃退火15 s，72℃延伸10 min，40个循环；95℃反应15 s，60℃反应1 min，95℃作用15 s。实时荧光定量PCR（瑞士Roche 公司LC480）进行检测，通过2−△△CT计算mRNA相对表达量。实验重复3次。
表1
基因扩增测序引物
1.3 统计学分析
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析，分析前对数据的方差齐性进行检验。采用Graph-Prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 体内动物实验结果
与DM组比较，正常对照组、DM+Met组小鼠视网膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达显著下降。三组间NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达比较，差异有统计学意义（F=43.478、36.643、24.464，P＜0.01）（图1）。
图1
正常对照组、DM组、DM+Met组小鼠视网膜中NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达比较（n=6） DM：糖尿病；Met：二甲双胍；NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；正常对照组：常规饲养，不作任何处理；DM组：糖尿病组；DM+Met组：给予Met 400 mg/（kg·d）干预。**P＜0.01
2.2 体外细胞实验
流式细胞仪检测结果显示，N组、AGE组、AGE+Met组细胞焦亡率分别为3.80%、69.20%、39.86%；N组、AGE+Met组细胞焦亡率显著低于AGE组，差异有统计学意义（F=32.598，P＜0.01）（图2）。
图2
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC焦亡率比较（n=3） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；Annexin-V-PE：膜联蛋白-V-聚乙烯；7-AAD：7-氨基放线菌素；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。2A～2C分别示N组、AGE组、AGE+Met组流式细胞仪检测像；2D示3组细胞焦亡率比较，**P＜0.01
DCFH-DA荧光探针检测结果显示，N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内ROS表达量分别为1.26×101、1.00×103、1.20×101；AGE组ROS表达水平较N组、AGE+Met组显著升高，差异有统计学意义（F=47.267，P＜0.01）（图3）。
图3
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内ROS水平比较（n=3） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；ROS：活性氧；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。3A示3组流式细胞仪检测像；3B示3组ROS水平比较，**P＜0.01
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA相对表达量分别为1.63±0.15、6.22±0.02、1.75±0.07，1.54±0.09、 6.25±0.07、1.62±0.11和1.59±0.07、5.93±0.04、1.64±0.11；蛋白相对表达量分别为0.50、1.05、0.57，0.73、1.30、0.86和0.55、1.15、0.75。与N组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1 mRNA、蛋白相对表达量比较，AGE组均升高，AGE+Met组均降低，差异有统计学意义（mRNA相对表达量：F=51.563、32.192、44.473，P＜0.01；蛋白相对表达量：F=63.372、54.463、48.412，P＜0.01）（图4）。
图4
N组、AGE组、AGE+Met组hRMEC内NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1的mRNA、蛋白相对表达量比较（n=6） AGE：晚期糖基化终末产物；Met：二甲双胍；hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；NLRP3：核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白3；GSDMD：膜穿孔蛋白D；Caspase-1：半胱天冬酶1；N组：常规培养细胞组；AGE组：加入150 μg/ml AGE诱导；AGE+Met组：加入2.0 mmol/L Met干预，150 μg/ml AGE诱导。4A示3组mRNA相对表达量结果，**P＜0.01；4B分别示3组蛋白相对表达量结果，**P＜0.01
3 讨论
大量研究表明，炎症和氧化应激可造成视网膜损伤和细胞死亡，进而导致DR的发生发展[8]。AGE在人体内的积累可能诱发氧化应激，导致内皮细胞功能障碍[9]，因此在体外模型中，本研究采用AGE诱导以模拟DR中血管内皮细胞的氧化应激反应。
细胞焦亡是由炎性小体引发的一种炎症状态下的细胞程序性死亡。这与在一定生理或病理条件下，受体内遗传机制控制，按照自身程序主动性、生理性的细胞焦亡完全不同。细胞焦亡主要依靠炎性小体激活Caspase-1，使其激活并切割GSDMD，活化的GSDMD转位到膜上，形成孔洞，细胞肿胀，胞质外流，最终导致细胞膜破裂，细胞焦亡[10]。NLRP3作为最具特征的炎性小体，可被广泛的危险信号激活，这些信号可能来自微生物或代谢失调异常产物。ROS是主要来源于线粒体的氧代谢副产物，可以积累和破坏DNA、脂质、蛋白质和线粒体DNA等细胞成分，参与众多与眼病相关的病理过程。过量ROS的产生会导致氧化应激。ROS可通过从其抑制剂硫氧还蛋白中释放对ROS敏感的NLRP3配体硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP），进而导致NLRP3炎性小体的激活。NLRP3炎性小体的激活是诱导炎症反应及细胞焦亡的关键机制[11]。原花青素可通过减少ROS的产生并抑制NLRP3炎性小体的活化来减轻高糖诱导的RPE细胞损伤[12]。AGE诱导ROS的大量产生可导致NLRP3炎性小体的过度活化和炎症级联反应，最终导致角膜上皮细胞的慢性炎症和焦亡[13]。有研究发现，hRMEC中高糖对ROS的诱导增加了TXNIP的表达，进而触发NLRP3炎症小体的激活，NLRP3基因沉默导致IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α、血管内皮生长因子、ICAM-1减少，表明NLRP3炎性小体是炎性级联反应的关键引发剂。而米诺环素可通过ROS-TXNIP通路介导的NLRP3活性抑制减轻DM大鼠的视网膜血管通透性并抑制hRMEC的焦亡[14]。本研究结果显示，AGE组hRMEC内ROS大量产生，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达水平上调。这表明AGE-ROS-NLRP3-Caspase-1-GSDMD轴介导的炎症及细胞焦亡参与了DR的发病机制。
Met是一种双胍类药物，广泛应用于2型DM治疗。其通过抑制肝脏糖异生、激活一磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMPK）及抑制线粒体ROS对细胞代谢的直接影响发挥其主要抗糖作用[15]。Met对正常细胞和组织在某些情况下具有自我保护作用。线粒体是Met的主要亚细胞靶点，其中线粒体复合物Ⅰ抑制的直接结果是减少ROS的产生。既往研究表明，Met可减弱百草枯诱导的ROS升高及相关DNA损伤和突变。从Met治疗8周的小鼠中分离出的脂肪干细胞中ROS和一氧化氮减少，而超氧化物歧化酶水平上调，这也提示Met触发了抗氧化反应。Met可通过减弱ROS的生成来抑制缺血再灌注诱导的脂肪肝氧化应激[16]。
此外，新近研究数据表明，Met对视网膜相关疾病亦具有抗炎、抗血管生成和抗氧化保护作用，包括DR、老年性黄斑变性、遗传性视网膜变性、原发性开角型青光眼、视网膜静脉阻塞和葡萄膜炎等。葡萄膜炎患者房水IL-1β、TNF-α、MCP-1、IL-6和IL-18水平升高，Met可以激活AMPK，抑制环氧合酶2、诱导型一氧化氮合酶和NF-κB的激活，从而抑制以上因子的表达[17]。Met还可以抑制TNF诱导的ICAM-1和MCP-1的表达，以及抑制内皮细胞增生、迁移和管腔形成，从而防止视网膜新生血管形成[18]。文献报道，Met可通过调节AMPK和去乙酰化酶抑制炎症、ROS生成、内皮细胞衰老和新生血管形成，从而抑制DM及其并发症的发展，这可能是预防或减轻DR的潜在机制[19]。因此，启发我们探索Met在DR中的具体治疗机制，即是否可通过抑制ROS的生成进而抑制细胞焦亡，以达到治疗DR的目的。本研究结果显示，AGE+Met组hRMEC中ROS水平下降，NLRP3、cleaved-GSDMD、cleaved-Caspase-1表达水平下调，表明Met的应用可减少ROS的产生并抑制细胞焦亡。
尽管本研究已初步明确AGE可诱导ROS大量产生，激活NLRP3炎性小体，导致hRMEC的炎症反应及细胞焦亡，而Met可减少ROS的产生并抑制NLRP3的活化进而抑制细胞焦亡，但在实验设计方面仍然存在一定局限性和不足之处。一方面存在剂量值和观察时间点单一的问题，会影响对结果的动态或深入分析；另一方面，研究结果还仅仅停留在Met对NLRP3炎症小体活化和焦亡的影响，但对Met发挥作用的分子机制尚未能很好地阐明。未来我们将进一步深入研究Met通过抑制细胞焦亡对病理性新生血管相关疾病的保护作用及机制，并取多个时间点及剂量浓度，实现对量效关系的动态解读，并引入NLRP3的激动剂以期全方位多层次探究Met的作用及机制，明确其抗炎和抗焦亡的作用。
