引用本文： 曹靖靖, 韩菲菲, 寇振宇, 东莉洁, 李文博, 梁景黎. 缺氧状态下SB431542对视网膜血管内皮细胞的作用. 中华眼底病杂志, 2023, 39(12): 1004-1009. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20221107-00590 复制
病理性视网膜新生血管是早产儿和工作年龄成人视力丧失的主要原因[1]。研究发现，缺氧可促使血管内皮生长因子（VEGF）的增加进而诱导视网膜内皮细胞的通透性和增殖，从而导致视网膜新生血管生成[2-3]。尽管抗VEGF药物治疗是目前的主要治疗方式，但长期抗VEGF药物治疗可能导致结缔组织生长因子增加，加重视网膜纤维化[4]。氧诱导视网膜病变（OIR）模型可用于对眼部疾病潜在抗VEGF药物验证研究[5]。转化生长因子-β（TGF-β）信号传导的分子途径在新生血管形成方面发挥重要作用[6]。SB431542为TGF-β信号传导抑制剂，可抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成的能力[7-8]。另有研究发现，SB431542可通过阻断Smad2/3通路抑制乳腺癌细胞系和异种移植物中的血管模拟生成[9]。目前尚无有关SB431542在视网膜新生血管方面的研究。本研究通过体内OIR模型联合体外细胞实验分析SB431542在缺氧环境中对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）增殖、迁移、管腔形成以及糖酵解水平的影响，旨在确定SB431542在hRMEC中的作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
本研究经天津医科大学眼科医院动物伦理委员会审批（批准号：TJYY20190103002）；实验动物饲养及操作均遵循国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定。
OIR模型建立和分组。C57BLKS/J小鼠，雌雄不限，无特定病原体级；北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将小鼠分为正常组、OIR组、OIR组+二甲基亚砜（DMSO）组、OIR+SB431542组。正常组小鼠在正常氧环境下饲养。其余3组小鼠参照文献[10]的方法构建OIR模型。小鼠12日龄时，OIR+DMSO组、OIR+SB431542组小鼠按体重腹腔注射10 mg/kg DMSO溶液或SB431542储备溶液。正常组小鼠不作任何处理。小鼠17日龄时，颈椎脱臼法处死小鼠后摘除眼球，进行后续实验，实验重复6次。
作视网膜铺片观察视网膜新生血管情况。用0.3% Triton X-100（北京索莱宝科技有限公司）和5%牛血清白蛋白（美国Sigma公司）处理视网膜。将视网膜置入IB4荧光染料（0.2 mg/ml，美国Invitrogen公司）中孵育过夜。采用共聚焦显微镜观察并记录小鼠视网膜新生血管面积、无灌注区面积。
苏木精-伊红（HE）染色计数突破视网膜内界膜（ILM）的血管内皮细胞核数。每组随机选取2只小鼠眼球，4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜；常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，作6 μm厚度连续切片。每只眼球取切片10张常规脱蜡后行HE染色[11]。40倍光学显微镜下观察拍照。全视野双盲法计数突破ILM的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞核时仅计数与ILM有紧密联系的细胞核，不含玻璃体腔内与ILM无联系的其他血管内皮细胞核。
1.2 体外细胞实验
细胞培养和分组。原代hRMEC（美国Cell Systems Corpor公司）置于含20%胎牛血清、50 U/ml内皮细胞生长因子以及1%胰岛素转铁蛋白硒组合的内皮细胞基础生长培养基中[12]，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。将细胞分为正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组。正常组细胞常规培养。其余3组细胞置于专用培养箱，2% O2中培养（通过注入N2）。细胞缺氧3 h后更换培养基，正常条件下进行后续实验。缺氧刺激后，缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组分别加入10 μmol/L DMSO、SB431542处理细胞48 h。实验重复3次。
噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖情况。各组细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板[13]，加入MTT前，在显微镜下每组随机拍摄5张不同视野照片。其后按照说明书加入MTT孵育4 h，弃上清液，加入150 μl DMSO，室温静置15 min，酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔细胞吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。实验重复3次。
Matrigel体外三维成型法检测SB431542对hRMEC管腔形成的影响。24孔板中每孔加入50 μl Matrigel胶，于37 ℃敷箱中放置30 min[14]。每孔加入1×105个细胞，37 ℃培养箱中孵育。6 h后，蔡司数码相机拍摄管腔形成情况。每组随机选取5张不同视野照片，计数管腔形成数量并取平均值。
细胞划痕实验检测hRMEC内细胞迁移情况。以细胞密度6×105个/孔接种于6孔板，每孔最终体系为2 ml，待生长融合为单层细胞后，用100～1 000 μl微量加样枪头于每孔中央行“十”字形划痕[15]，磷酸盐缓冲液冲洗后拍照。按实验分组给予干预刺激，常规培养24 h后于相同位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区迁移情况，采用CellSens Standard软件测量裸区面积。实验重复3次，按以下公式计算迁移率。迁移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸区面积；St：各时间点裸区面积）。每组随机选取5张不同视野照片，计数迁移情况并取平均值。
Seahorse XFe 96细胞能量代谢仪检测细胞外酸化率（ECAR）。hRMEC以细胞密度2×104个/孔接种于XFe 96孔微孔板中，各组进行相应处理后，依次添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脱氧葡萄糖，测定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备的ECAR。每个标绘值≥3个一式三份孔的平均值，根据基线ECAR和总蛋白水平进行标准化。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析。采用Graph-Prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OIR模型建立成功
视网膜铺片结果显示，OIR组中视网膜新生血管面积（t=41.621）、无灌注区面积（t=32.182）均显著高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.001）（图1）。
图1
OIR组和正常组小鼠视网膜新生血管情况比较（n=6）
1A示正常组视网膜铺片共聚焦显微镜像，无新生血管生成（标尺：200 μm ）；1B、1C示OIR组视网膜铺片共聚焦显微镜像（标尺：200 μm ），可见视网膜新生血管区（1B白色区域）及无灌注区（1C白色区域）；1D示两组小鼠视网膜新生血管面积比较，***
2.2 SB431542抑制OIR小鼠模型视网膜新生血管形成
光学显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜中未见突破ILM的血管内皮细胞核；OIR组、OIR+DMSO组小鼠视网膜中均可见大量突破ILM的血管内皮细胞核；OIR+SB431542组小鼠视网膜中可见少量突破ILM的血管内皮细胞核（图2A～2D）。正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组突破ILM的血管内皮细胞核数比较，差异有统计学意义（F=36.183，P＜0.001）（图2E）。
图2
正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组小鼠视网膜中突破ILM的血管内皮细胞核数比较（n=6）
2A～2D分别示正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组视网膜切片光学显微镜像（苏木精-伊红染色，标尺：50 μm）。正常组小鼠视网膜中未见突破ILM的血管内皮细胞核；OIR组、OIR+DMSO组小鼠视网膜中可见大量突破ILM的血管内皮细胞核（黑箭）；OIR+SB431542组小鼠视网膜中可见少量突破ILM的血管内皮细胞核（黑箭）。2E示各组突破ILM的血管内皮细胞核数量比较，***
2.3 SB431542抑制缺氧诱导的hRMEC细胞增殖
MTT比色法检测结果显示，与正常组、缺氧+SB431542组比较，缺氧组、缺氧+DMSO组细胞增殖显著增多，差异有统计学意义（F=39.316，P＜0.01）。缺氧+SB431542组细胞增殖较缺氧+DMSO组显著降低，差异有统计学意义（t=26.182，P＜0.001）（图3）。
图3
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞增殖情况比较（n=3）
hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；DMSO：二甲基亚砜；**
2.4 SB431542抑制缺氧诱导的hRMEC血管生成、细胞迁移
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数分别为（2.0±0.4）、（18.4±1.09）、（16.13±3.43）、（4.2±0.16）个，迁移细胞数分别为（23.04±1.24）%、（40.27±2.03）%、（39.7±1.23）%、（25.17±0.17）%；四组完整管腔形成数、迁移细胞数比较，差异均有统计学意义（F=34.513、41.862，P＜0.001、＜0.01）。与缺氧+DMSO组比较，缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数、迁移细胞数明显下降，差异有统计学意义（t=44.723、31.178，P＜0.001、＜0.01）（图4，5）。
图4
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数比较（n=3）
4A～4D分别示正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组倒置相差显微镜像（标尺：100 μm）。与缺氧组、缺氧+DMSO组比较，正常组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数明显减少。4E示各组细胞完整管腔形成数比较，***
图5
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组迁移细胞数比较（n=3）
5A～5D分别示正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞显微镜像（标尺：100 μm）。正常组、缺氧+SB431542组仅有少量细胞迁移进入裸区，缺氧组、缺氧+DMSO组可见大量细胞迁移进入裸区。5E示各组细胞迁移率比较，**
2.5 SB431542导致缺氧条件下线粒体糖酵解能力的改变
细胞能量代谢测定结果显示，缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞内糖酵解、糖酵解储备、糖酵解容量的ECAR分别为（10.27±3.99）%、（8.01±2.05）%，（20.17±4.82）%、（4.04±3.54）%，（5.05±0.28）%、（8.02±2.15）%；与缺氧+DMSO组比较，缺氧+SB431542组细胞内糖酵解、糖酵解储备的ECAR降低，糖酵解容量的ECAR增高，差异均有统计学意义（t=26.175、33.623、37.276，P＜0.05）（图6）。
图6
缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组hRMEC内糖酵解水平比较（n=3）hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；DMSO：二甲基亚砜；ECAR：细胞外酸化率；*P＜0.01
3 讨论
研究显示TGF-β家族可促进新生血管形成[16]。在缺血小鼠脑内发现了TGF-β相关通路的激活，并促进小鼠血管生成及抑制细胞凋亡[17]。在黑色素瘤进展中，亦发现有TGF-β的参与，可通过直接影响肿瘤细胞运动性和侵袭性以发挥其促瘤功能，同时伴有血管形成[18]。TGF-β诱导眼眶成纤维细胞促血管生成活性可被姜黄素抑制[19]。本研究中体内实验发现，TGF-β信号传导抑制剂SB431542可降低OIR小鼠视网膜新生血管数量；体外细胞实验发现，SB431542可抑制hRMEC的增殖、迁移以及侵袭能力，其与新生血管形成相关。
视网膜是生物体内代谢最活跃的组织之一，对氧水平变化极为敏感[20]。TGF-β信号通路在调节葡萄糖和能量稳态中发挥重要作用，通过阻断其信号传导可预防肥胖和糖尿病[21]。TGF-β被发现可诱导癌症在上皮间充质转化（EMT）过程中发生代谢重编程，伴有糖酵解水平的增加[22]。在眼部疾病中，TGF-β可抑制视网膜色素上皮细胞的线粒体呼吸，与糖酵解水平增加相关[23]。本研究通过检测TGF-β信号传导抑制剂SB431542对hRMEC中ECAR指标以表征糖酵解水平的变化，发现SB431542可抑制缺氧条件下诱导的hRMEC中糖酵解水平的升高。
本研究体内实验结果显示，给予SB431542处理后可以抑制OIR小鼠模型视网膜新生血管生成；体外细胞实验结果显示，SB431542可降低缺氧诱导的细胞成管能力、细胞增殖及细胞迁移率。这表明SB431542可能在抑制视网膜新生血管形成中发挥重要作用。此外，本研究还证实在hRMEC中SB431542可以抑制糖酵解水平，这可能在调节hRMEC对缺氧反应的变化中起着至关重要的作用。因此，本研究结果表明SB431542或许是新生血管相关眼病的潜在治疗靶点。
SB431542是TGF-β信号传导过程中的抑制剂，本研究目前仅主要通过细胞实验观察了SB431542对细胞增殖、迁移及糖酵解水平的影响。未来我们将通过体内实验进行验证，并深入探索SB431542对TGF-β相关信号通路的影响，旨在多方位、更全面的为临床应用提供理论基础。
病理性视网膜新生血管是早产儿和工作年龄成人视力丧失的主要原因[1]。研究发现，缺氧可促使血管内皮生长因子（VEGF）的增加进而诱导视网膜内皮细胞的通透性和增殖，从而导致视网膜新生血管生成[2-3]。尽管抗VEGF药物治疗是目前的主要治疗方式，但长期抗VEGF药物治疗可能导致结缔组织生长因子增加，加重视网膜纤维化[4]。氧诱导视网膜病变（OIR）模型可用于对眼部疾病潜在抗VEGF药物验证研究[5]。转化生长因子-β（TGF-β）信号传导的分子途径在新生血管形成方面发挥重要作用[6]。SB431542为TGF-β信号传导抑制剂，可抑制脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞血管生成的能力[7-8]。另有研究发现，SB431542可通过阻断Smad2/3通路抑制乳腺癌细胞系和异种移植物中的血管模拟生成[9]。目前尚无有关SB431542在视网膜新生血管方面的研究。本研究通过体内OIR模型联合体外细胞实验分析SB431542在缺氧环境中对人视网膜微血管内皮细胞（hRMEC）增殖、迁移、管腔形成以及糖酵解水平的影响，旨在确定SB431542在hRMEC中的作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 体内动物实验
本研究经天津医科大学眼科医院动物伦理委员会审批（批准号：TJYY20190103002）；实验动物饲养及操作均遵循国家科学技术委员会《实验动物管理条例》的规定。
OIR模型建立和分组。C57BLKS/J小鼠，雌雄不限，无特定病原体级；北京维通利华实验动物技术有限公司提供。将小鼠分为正常组、OIR组、OIR组+二甲基亚砜（DMSO）组、OIR+SB431542组。正常组小鼠在正常氧环境下饲养。其余3组小鼠参照文献[10]的方法构建OIR模型。小鼠12日龄时，OIR+DMSO组、OIR+SB431542组小鼠按体重腹腔注射10 mg/kg DMSO溶液或SB431542储备溶液。正常组小鼠不作任何处理。小鼠17日龄时，颈椎脱臼法处死小鼠后摘除眼球，进行后续实验，实验重复6次。
作视网膜铺片观察视网膜新生血管情况。用0.3% Triton X-100（北京索莱宝科技有限公司）和5%牛血清白蛋白（美国Sigma公司）处理视网膜。将视网膜置入IB4荧光染料（0.2 mg/ml，美国Invitrogen公司）中孵育过夜。采用共聚焦显微镜观察并记录小鼠视网膜新生血管面积、无灌注区面积。
苏木精-伊红（HE）染色计数突破视网膜内界膜（ILM）的血管内皮细胞核数。每组随机选取2只小鼠眼球，4%多聚甲醛中4 ℃固定过夜；常规脱水、透明、浸蜡，石蜡包埋，作6 μm厚度连续切片。每只眼球取切片10张常规脱蜡后行HE染色[11]。40倍光学显微镜下观察拍照。全视野双盲法计数突破ILM的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞核时仅计数与ILM有紧密联系的细胞核，不含玻璃体腔内与ILM无联系的其他血管内皮细胞核。
1.2 体外细胞实验
细胞培养和分组。原代hRMEC（美国Cell Systems Corpor公司）置于含20%胎牛血清、50 U/ml内皮细胞生长因子以及1%胰岛素转铁蛋白硒组合的内皮细胞基础生长培养基中[12]，37 ℃、5% CO2细胞培养箱培养。将细胞分为正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组。正常组细胞常规培养。其余3组细胞置于专用培养箱，2% O2中培养（通过注入N2）。细胞缺氧3 h后更换培养基，正常条件下进行后续实验。缺氧刺激后，缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组分别加入10 μmol/L DMSO、SB431542处理细胞48 h。实验重复3次。
噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖情况。各组细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板[13]，加入MTT前，在显微镜下每组随机拍摄5张不同视野照片。其后按照说明书加入MTT孵育4 h，弃上清液，加入150 μl DMSO，室温静置15 min，酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔细胞吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。实验重复3次。
Matrigel体外三维成型法检测SB431542对hRMEC管腔形成的影响。24孔板中每孔加入50 μl Matrigel胶，于37 ℃敷箱中放置30 min[14]。每孔加入1×105个细胞，37 ℃培养箱中孵育。6 h后，蔡司数码相机拍摄管腔形成情况。每组随机选取5张不同视野照片，计数管腔形成数量并取平均值。
细胞划痕实验检测hRMEC内细胞迁移情况。以细胞密度6×105个/孔接种于6孔板，每孔最终体系为2 ml，待生长融合为单层细胞后，用100～1 000 μl微量加样枪头于每孔中央行“十”字形划痕[15]，磷酸盐缓冲液冲洗后拍照。按实验分组给予干预刺激，常规培养24 h后于相同位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区迁移情况，采用CellSens Standard软件测量裸区面积。实验重复3次，按以下公式计算迁移率。迁移率=（S0-St）/ S0×100%（S0：原始裸区面积；St：各时间点裸区面积）。每组随机选取5张不同视野照片，计数迁移情况并取平均值。
Seahorse XFe 96细胞能量代谢仪检测细胞外酸化率（ECAR）。hRMEC以细胞密度2×104个/孔接种于XFe 96孔微孔板中，各组进行相应处理后，依次添加10 mmo/L葡萄糖、1 μmo/L寡霉素、50 mmo/L 2-脱氧葡萄糖，测定糖酵解、糖酵解能力、糖酵解储备的ECAR。每个标绘值≥3个一式三份孔的平均值，根据基线ECAR和总蛋白水平进行标准化。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较行独立样本t检验；三组间比较行单因素方差分析。采用Graph-Prism软件对数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 OIR模型建立成功
视网膜铺片结果显示，OIR组中视网膜新生血管面积（t=41.621）、无灌注区面积（t=32.182）均显著高于正常组，差异有统计学意义（P＜0.001）（图1）。
图1
OIR组和正常组小鼠视网膜新生血管情况比较（n=6）
1A示正常组视网膜铺片共聚焦显微镜像，无新生血管生成（标尺：200 μm ）；1B、1C示OIR组视网膜铺片共聚焦显微镜像（标尺：200 μm ），可见视网膜新生血管区（1B白色区域）及无灌注区（1C白色区域）；1D示两组小鼠视网膜新生血管面积比较，***
2.2 SB431542抑制OIR小鼠模型视网膜新生血管形成
光学显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜中未见突破ILM的血管内皮细胞核；OIR组、OIR+DMSO组小鼠视网膜中均可见大量突破ILM的血管内皮细胞核；OIR+SB431542组小鼠视网膜中可见少量突破ILM的血管内皮细胞核（图2A～2D）。正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组突破ILM的血管内皮细胞核数比较，差异有统计学意义（F=36.183，P＜0.001）（图2E）。
图2
正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组小鼠视网膜中突破ILM的血管内皮细胞核数比较（n=6）
2A～2D分别示正常组、OIR组、OIR+DMSO组、OIR+SB431542组视网膜切片光学显微镜像（苏木精-伊红染色，标尺：50 μm）。正常组小鼠视网膜中未见突破ILM的血管内皮细胞核；OIR组、OIR+DMSO组小鼠视网膜中可见大量突破ILM的血管内皮细胞核（黑箭）；OIR+SB431542组小鼠视网膜中可见少量突破ILM的血管内皮细胞核（黑箭）。2E示各组突破ILM的血管内皮细胞核数量比较，***
2.3 SB431542抑制缺氧诱导的hRMEC细胞增殖
MTT比色法检测结果显示，与正常组、缺氧+SB431542组比较，缺氧组、缺氧+DMSO组细胞增殖显著增多，差异有统计学意义（F=39.316，P＜0.01）。缺氧+SB431542组细胞增殖较缺氧+DMSO组显著降低，差异有统计学意义（t=26.182，P＜0.001）（图3）。
图3
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞增殖情况比较（n=3）
hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；DMSO：二甲基亚砜；**
2.4 SB431542抑制缺氧诱导的hRMEC血管生成、细胞迁移
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数分别为（2.0±0.4）、（18.4±1.09）、（16.13±3.43）、（4.2±0.16）个，迁移细胞数分别为（23.04±1.24）%、（40.27±2.03）%、（39.7±1.23）%、（25.17±0.17）%；四组完整管腔形成数、迁移细胞数比较，差异均有统计学意义（F=34.513、41.862，P＜0.001、＜0.01）。与缺氧+DMSO组比较，缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数、迁移细胞数明显下降，差异有统计学意义（t=44.723、31.178，P＜0.001、＜0.01）（图4，5）。
图4
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数比较（n=3）
4A～4D分别示正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组倒置相差显微镜像（标尺：100 μm）。与缺氧组、缺氧+DMSO组比较，正常组、缺氧+SB431542组细胞完整管腔形成数明显减少。4E示各组细胞完整管腔形成数比较，***
图5
正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组迁移细胞数比较（n=3）
5A～5D分别示正常组、缺氧组、缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞显微镜像（标尺：100 μm）。正常组、缺氧+SB431542组仅有少量细胞迁移进入裸区，缺氧组、缺氧+DMSO组可见大量细胞迁移进入裸区。5E示各组细胞迁移率比较，**
2.5 SB431542导致缺氧条件下线粒体糖酵解能力的改变
细胞能量代谢测定结果显示，缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组细胞内糖酵解、糖酵解储备、糖酵解容量的ECAR分别为（10.27±3.99）%、（8.01±2.05）%，（20.17±4.82）%、（4.04±3.54）%，（5.05±0.28）%、（8.02±2.15）%；与缺氧+DMSO组比较，缺氧+SB431542组细胞内糖酵解、糖酵解储备的ECAR降低，糖酵解容量的ECAR增高，差异均有统计学意义（t=26.175、33.623、37.276，P＜0.05）（图6）。
图6
缺氧+DMSO组、缺氧+SB431542组hRMEC内糖酵解水平比较（n=3）hRMEC：人视网膜微血管内皮细胞；DMSO：二甲基亚砜；ECAR：细胞外酸化率；*P＜0.01
3 讨论
研究显示TGF-β家族可促进新生血管形成[16]。在缺血小鼠脑内发现了TGF-β相关通路的激活，并促进小鼠血管生成及抑制细胞凋亡[17]。在黑色素瘤进展中，亦发现有TGF-β的参与，可通过直接影响肿瘤细胞运动性和侵袭性以发挥其促瘤功能，同时伴有血管形成[18]。TGF-β诱导眼眶成纤维细胞促血管生成活性可被姜黄素抑制[19]。本研究中体内实验发现，TGF-β信号传导抑制剂SB431542可降低OIR小鼠视网膜新生血管数量；体外细胞实验发现，SB431542可抑制hRMEC的增殖、迁移以及侵袭能力，其与新生血管形成相关。
视网膜是生物体内代谢最活跃的组织之一，对氧水平变化极为敏感[20]。TGF-β信号通路在调节葡萄糖和能量稳态中发挥重要作用，通过阻断其信号传导可预防肥胖和糖尿病[21]。TGF-β被发现可诱导癌症在上皮间充质转化（EMT）过程中发生代谢重编程，伴有糖酵解水平的增加[22]。在眼部疾病中，TGF-β可抑制视网膜色素上皮细胞的线粒体呼吸，与糖酵解水平增加相关[23]。本研究通过检测TGF-β信号传导抑制剂SB431542对hRMEC中ECAR指标以表征糖酵解水平的变化，发现SB431542可抑制缺氧条件下诱导的hRMEC中糖酵解水平的升高。
本研究体内实验结果显示，给予SB431542处理后可以抑制OIR小鼠模型视网膜新生血管生成；体外细胞实验结果显示，SB431542可降低缺氧诱导的细胞成管能力、细胞增殖及细胞迁移率。这表明SB431542可能在抑制视网膜新生血管形成中发挥重要作用。此外，本研究还证实在hRMEC中SB431542可以抑制糖酵解水平，这可能在调节hRMEC对缺氧反应的变化中起着至关重要的作用。因此，本研究结果表明SB431542或许是新生血管相关眼病的潜在治疗靶点。
SB431542是TGF-β信号传导过程中的抑制剂，本研究目前仅主要通过细胞实验观察了SB431542对细胞增殖、迁移及糖酵解水平的影响。未来我们将通过体内实验进行验证，并深入探索SB431542对TGF-β相关信号通路的影响，旨在多方位、更全面的为临床应用提供理论基础。
