引用本文： 曹靖靖, 李辉, 寇振宇, 吴桂佳, 东莉洁, 焦明菲. NDRG1基因在体外对视网膜血管内皮细胞血管形成能力的影响. 中华眼底病杂志, 2024, 40(7): 538-544. doi: 10.3760/cma.j.cn511434-20230529-00240 复制
糖尿病视网膜病变（DR）是全球工龄人群视力丧失的主要原因之一[1]。虽然激光光凝治疗、抗血管内皮生长因子（VEGF）药物和糖皮质激素在治疗DR中取得了显著的进展，然而部分患者的治疗效果并不理想[2-3]。因此明确新的抗新生血管药物的靶点十分必要。N-myc下游调节基因1（NDRG1）蛋白质与许多生理事件相关，如细胞分化、应激反应、发育、凋亡和脂质合成[4-6]。NDRG1基因在多种癌症类型中具有抗肿瘤和抗转移功能，其基因可以抑制肿瘤生长、肿瘤细胞迁移并调节血管生成[4, 7]。在新生血管实体瘤中，NDRG1基因可通过调节癌细胞和内皮细胞的行为来抑制肿瘤的生长[8]。这提示，在肿瘤中NDRG1基因能够抑制肿瘤细胞增殖迁移及新生血管形成。目前NDRG1基因对视网膜血管内皮细胞的作用尚不明确。本研究旨在建立体外视网膜血管内皮细胞高糖模型模拟DR患者的病理环境，初步探索NDRG1基因对视网膜血管内皮细胞增殖迁移和管腔形成的影响，以期为治疗DR提供新的诊断和治疗的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）由本实验室自行保存。Dulbecco改良eagle培养基（DMEM，L540KJ，上海源培生物科技股份有限公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）、甘露醇（SM8120）、葡萄糖（G8150）（北京索莱宝科技有限公司）；NDRG1基因（DF6865）、辣根过氧化物酶（HRP，S0001）、β-肌动蛋白（actin）（AF7018）一抗和二抗（美国Affinity公司）；Ttranswell共培养板（美国Corning公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，北京金克隆生物技术有限公司）；MatrigengeL Matrix标准型含酚红基质胶（上海诺娃医药科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本Takara公司）；iQ5实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。
1.2 方法
细胞培养。RF/6A细胞株置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。
RF/6A细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组、无靶基因的小干扰RNA（siRNA）阴性对照组（siRNA组）、30 nmol/L siRNA下调NDRG1基因组（siNDRG1组）、50 nmol/L siNDRG1组。正常组细胞常规培养；根据预实验结果，甘露醇组细胞加入25 mmol/L甘露醇，高糖组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养；siRNA组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养，再加入空白siRNA诱导；30、50 nmol/L siNDRG1组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养，再分别用30、50 nmol/L siNDRG1进行诱导。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。
免疫荧光染色计数正常组、siRNA组、siNDRG1组细胞核数量。各组细胞以2×104个/孔的密度接种于8孔板中，每孔滴加100 μl的DAPI避光染色5 min，磷酸盐缓冲液洗3次，5 min/次。荧光显微镜观察并计数。细胞核呈蓝色荧光。实验重复3次。
CCK-8检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞活性。细胞培养24 h后，CCK-8检测各组细胞活性。各组细胞以2×104个/ml密度接种于8孔板中，每孔滴加100 μl的CCK-8试剂孵育2 h，采用酶链免疫检测仪测量波长450 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设3个复孔，实验重复3次。
细胞划痕实验检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞迁移能力。各组细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中，待细胞铺满后，应用10 μl微量加样枪头于孔板中央作“十”字形划痕，并将此时计作0 h，继续培养12 h后于相同划痕位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区迁移情况并记录原始裸区（S0）和24 h裸区（S24）面积。迁移率=（S0-S24）/S0×100%。实验重复3次。
Matrigel实验检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞管腔形成能力。4 ℃ MatrigengeL Matrix标准型含酚红基质胶40 μl缓慢加入96孔板中，于37℃孵育箱中放置30 min。各组细胞以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板中孵育，6 h后观察管腔形成情况。计数相同视野面积下管腔形成数量。实验重复3次。
qPCR检测各组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量。RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，逆转录成cDNA。应用Primer 5.0软件设计引物序列。NDRG1 正向引物：GGGCTGAAAAGCATTATTGG，反向引物：CTCCACCATCTCAGGGTTGT；β-actin正向引物：ATTGCCGACAGGATGCAGAA，反向引物：GCTGATCCACATCTGCTGGAA。置于qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Cq值），以β-actin为内参照，依照公式2-ΔΔCq计算mRNA的相对表达量。实验重复3次。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞中NDRG1蛋白相对表达量。参照文献[9]的方法，收集各组细胞，提取蛋白定量。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳，转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入NDRG1、β-actin一抗，4℃孵育过夜，洗膜缓冲液（TBST）洗膜，加入HRP羊抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜，加入化学发光底物进行曝光并拍照，凝胶成像系统扫描分析蛋白条带。Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白相对表达水平。实验重复3次。
1.3 统计学分析
采用SPSS软件进行统计学分析。定量数据以均数±标准差（x±s）表示。经Kolmogorov-Smirnov检验，数据符合正态分布且方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用t检验。采用Graphpad Prism 9.0对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖促进RF/6A细胞增殖、迁移，提高管腔形成能力
细胞培养12 h后，正常组、甘露醇组仅有少量细胞迁移进入裸区，高糖组可见大量细胞迁移进入裸区（图1A～1C）。与正常组比较，甘露醇组细胞迁移率上升，但差异无统计学意义（t=47.154，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞迁移率上升（t=24.745、33.638），差异均有统计学意义（P＜0.01）（图1D）。与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞增殖显著增多（t=36.659、57.645），差异有统计学意义，（P＜0.01）（图1D，1E）。
图1
高糖促进RF/6A细胞迁移能力（n=3） 1A～1C分别示正常组、甘露醇组、高糖组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：100 μm），正常组、甘露醇组仅有少量细胞迁移进入裸区，高糖组大量细胞迁移进入裸区；1D、1E分别示三组细胞迁移率、增殖率比较，**P＜0.01 A值：吸光度值；RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞：正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
细胞接种6 h后，正常组、甘露醇组细胞管腔形成数量比较，差异无统计学意义（t=49.132，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞管腔形成数量显著增加，差异有统计学意义（t=41.276、22.867，P＜0.01）（图2）。
图2
高糖促进RF/6A细胞管腔形成能力（n=3） 2A～2C分别示正常组、甘露醇组、高糖组细胞显微镜像（标尺：100 μm），与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞管腔形成数量显著增加；2D示三组细胞管腔形成数量比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
2.2 高糖诱导RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达降低
qPCR、Western blot检测结果显示，正常组、甘露醇组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（t=44.756、14.677，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞中NDRG1基因的mRNA（t=36.738、32.976）、蛋白相对表达量显著下降（t=46.145、21.541），差异有统计学意义（P＜0.001）（图3A）。
图3
高糖诱导RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低（n=3） 3A示正常组、甘露醇组、高糖组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量比较，***P＜0.001；3B示电泳图；3C示正常组、甘露醇组、高糖组细胞中NDRG1蛋白相对表达量比较，***P＜0.001 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；actin：肌动蛋白；正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
2.3 下调NDRG1基因促进RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低
qPCR、Western blot检测结果显示，与siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1基因的mRNA（t=44.275、40.7577）、蛋白（t=57.167、25.877）相对表达量均下调，差异有统计学意义（P＜0.001）；三组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（F=73.144、64.462，P＜0.001）（图4A）。
图4
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低（n=3） 4A示siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量比较，***P＜0.001；4B示电泳图；4C示siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1蛋白相对表达量比较，***P＜0.001 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；actin：肌动蛋白；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导；50 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用50 nmol/L siNDRG1进行诱导
2.4 下调NDRG1基因增加RF/6A细胞活性
与正常组、siRNA组比较，30nmmol/L siNDRG1组细胞核数量明显增加（图5A～5C）。三组细胞活性比较，差异有统计学意义（F=21.162，P＜0.01）（图5D）。
图5
下调NDRG1基因减少RF/6A细胞凋亡、增加细胞活性（n=3） 5A～5C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组细胞荧光显微镜像（DAPI，标尺：20 μm），蓝色荧光代表细胞核，用来表征细胞数量，可见30 nmol/L siNDRG1组细胞核数量较正常组、siRNA组明显增加；5D示三组细胞活性比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.5 下调NDRG1基因促进高糖诱导的RF/6A细胞迁移
细胞培养12 h后，正常组、siRNA组仅有少量细胞迁移进入裸区，30 nmol/L siNDRG1组可见大量细胞迁移进入裸区（图6A～6C）。三组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（F=46.124，P＜0.01）（图6D）。
图6
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞迁移（n=3） 6A～6C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/LsiNDRG1组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：100 μm），正常组、siRNA组仅有少量细胞迁移进入裸区，30 nmol/L siNDRG1组可见大量细胞迁移进入裸区；6D示三组细胞迁移率比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导
2.6 下调NDRG1基因促进细胞管腔形成
细胞接种6 h后，与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组细胞管腔形成数量明显增加，差异有统计学意义（t=63.446、42.742，P＜0.01）（图7）。
图7
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞管腔形成（n=3） 7A～7C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组细胞显微镜像（标尺：100 μm），与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组细胞管腔形成数量显著增加；7D示三组细胞管腔形成数量比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导
3 讨论
研究报道，高血糖诱发的视网膜内皮细胞功能障碍与增生前DR的病理特征有关[9-10]，引发新生血管形成[11-12]。体外血管生成的过程，包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等过程[11]。然而目前尚无治疗DR的有效方法。本研究通过体外建立高糖模型模拟DR患者的眼部病理环境，观察在高糖环境中RF/6A增殖、迁移及管腔形成的改变，明确抑制视网膜新生血管的新的分子靶点。
NDRG蛋白家族由4个成员NDRG1～4组成[13]。NDRG1蛋白参与胚胎发生和发育、细胞生长和分化、迁移、炎症、氧化应激反应和免疫等生物学过程[14]。NDRG1蛋白是调节内皮炎症，血栓形成反应的关键介质，参与动脉粥样硬化血栓形成等炎症性血管疾病的发生[15]。研究表明，NDRG1蛋白可降低胰腺癌细胞中CXC趋化因子的表达水平，在抑制胰腺癌细胞炎症和血管生成中起重要作用[16]。在NDRG蛋白家族中，NDRG1蛋白受到缺氧引发的抑制作用最大，上调NDRG1基因表达可抑制缺氧诱导的癌细胞的氧化应激反应，并降低癌细胞的迁移率[17]。NDRG1蛋白作为肿瘤抑制因子或肿瘤启动子的作用取决于肿瘤类型。NDRG1蛋白在胰腺癌细胞中的过表达抑制肿瘤生长和血管生成，而NDRG1蛋白在胃癌细胞中的过表达促进肿瘤生长和血管生成。研究发现，NDRG1蛋白可调节巨噬细胞系分化，促进骨重塑和血管生成的稳态平衡[13]。
NDRG1蛋白也可抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达[18]。其中VEGF是参与新生血管形成的重要因子，而MMP-9可以裂解许多细胞外基质蛋白来调节细胞外基质重塑，参与上皮-间充质转化（EMT）引发纤维化的发生[19]。NDRG1蛋白通过与细胞紧密连接的组成成分相互作用并促进其在结直肠癌中的泛素化来抑制EMT生物行为[20]。NDRG1蛋白在哺乳动物视网膜中的作用尚不明确，但研究发现，NDRG1蛋白缺乏阻碍了斑马鱼的早期视网膜血管发育，而在成年后，NDRG1蛋白的表达水平显著降低[21]，这提示NDRG1蛋白可能在视网膜的稳定性中发挥重要作用，因此本研究聚焦NDRG1对RF/6A的管腔形成能力的影响，初步发现下调NDRG1基因后可抑制RF/6A的细胞管腔形成能力，但在不同年龄阶段的视网膜中NDRG1基因的作用尚需进一步的研究。
目前已知在肿瘤中，NDRG1基因在炎症、氧化应激、新生血管与纤维化方面均发挥抑制作用，这为明确NDRG1基因在DR中的全面作用提供了重要的思路。DR患者由于持续性高血糖，可引发炎症、氧化应激的发生，进而刺激眼部新生血管生成，后期可发展为纤维化，造成不可逆的视力损伤。本研究初步对NDRG1基因在新生血管方面的作用进行了详细的研究，发现NDRG1基因在高糖诱导的RF/6A细胞中低表达，下调RF/6A细胞中NDRG1基因，可诱导其增殖、迁移和管腔形成，提示NDRG1基因可能在抑制视网膜新生血管方面发挥重要作用。
本研究存在局限性是仅验证了下调NDRG1基因对RF/6A细胞的影响，未观察上调NDRG1基因后的具体作用。未来需进一步探究上调NDRG1基因后对视网膜血管内皮细胞的保护作用以及在炎症、氧化应激与纤维化方面的重要性，以明确治疗DR的新靶点。
糖尿病视网膜病变（DR）是全球工龄人群视力丧失的主要原因之一[1]。虽然激光光凝治疗、抗血管内皮生长因子（VEGF）药物和糖皮质激素在治疗DR中取得了显著的进展，然而部分患者的治疗效果并不理想[2-3]。因此明确新的抗新生血管药物的靶点十分必要。N-myc下游调节基因1（NDRG1）蛋白质与许多生理事件相关，如细胞分化、应激反应、发育、凋亡和脂质合成[4-6]。NDRG1基因在多种癌症类型中具有抗肿瘤和抗转移功能，其基因可以抑制肿瘤生长、肿瘤细胞迁移并调节血管生成[4, 7]。在新生血管实体瘤中，NDRG1基因可通过调节癌细胞和内皮细胞的行为来抑制肿瘤的生长[8]。这提示，在肿瘤中NDRG1基因能够抑制肿瘤细胞增殖迁移及新生血管形成。目前NDRG1基因对视网膜血管内皮细胞的作用尚不明确。本研究旨在建立体外视网膜血管内皮细胞高糖模型模拟DR患者的病理环境，初步探索NDRG1基因对视网膜血管内皮细胞增殖迁移和管腔形成的影响，以期为治疗DR提供新的诊断和治疗的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
恒河猴视网膜血管内皮细胞（RF/6A）由本实验室自行保存。Dulbecco改良eagle培养基（DMEM，L540KJ，上海源培生物科技股份有限公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）、甘露醇（SM8120）、葡萄糖（G8150）（北京索莱宝科技有限公司）；NDRG1基因（DF6865）、辣根过氧化物酶（HRP，S0001）、β-肌动蛋白（actin）（AF7018）一抗和二抗（美国Affinity公司）；Ttranswell共培养板（美国Corning公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，北京金克隆生物技术有限公司）；MatrigengeL Matrix标准型含酚红基质胶（上海诺娃医药科技有限公司）；SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本Takara公司）；iQ5实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）仪（美国Applied Biosystems公司）。
1.2 方法
细胞培养。RF/6A细胞株置于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。
RF/6A细胞分为正常组、甘露醇组、高糖组、无靶基因的小干扰RNA（siRNA）阴性对照组（siRNA组）、30 nmol/L siRNA下调NDRG1基因组（siNDRG1组）、50 nmol/L siNDRG1组。正常组细胞常规培养；根据预实验结果，甘露醇组细胞加入25 mmol/L甘露醇，高糖组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养；siRNA组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养，再加入空白siRNA诱导；30、50 nmol/L siNDRG1组细胞加入25 mmol/L葡萄糖培养，再分别用30、50 nmol/L siNDRG1进行诱导。所有细胞均孵育24 h进行后续实验。
免疫荧光染色计数正常组、siRNA组、siNDRG1组细胞核数量。各组细胞以2×104个/孔的密度接种于8孔板中，每孔滴加100 μl的DAPI避光染色5 min，磷酸盐缓冲液洗3次，5 min/次。荧光显微镜观察并计数。细胞核呈蓝色荧光。实验重复3次。
CCK-8检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞活性。细胞培养24 h后，CCK-8检测各组细胞活性。各组细胞以2×104个/ml密度接种于8孔板中，每孔滴加100 μl的CCK-8试剂孵育2 h，采用酶链免疫检测仪测量波长450 nm处的吸光度［A，旧称光密度（OD）］值。每组设3个复孔，实验重复3次。
细胞划痕实验检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞迁移能力。各组细胞以2×105个/孔的密度接种于12孔板中，待细胞铺满后，应用10 μl微量加样枪头于孔板中央作“十”字形划痕，并将此时计作0 h，继续培养12 h后于相同划痕位置再次拍照，观察各孔细胞向裸区迁移情况并记录原始裸区（S0）和24 h裸区（S24）面积。迁移率=（S0-S24）/S0×100%。实验重复3次。
Matrigel实验检测正常组、甘露醇组、高糖组、siRNA组、siNDRG1组细胞管腔形成能力。4 ℃ MatrigengeL Matrix标准型含酚红基质胶40 μl缓慢加入96孔板中，于37℃孵育箱中放置30 min。各组细胞以1.5×104个/孔的密度接种于96孔板中孵育，6 h后观察管腔形成情况。计数相同视野面积下管腔形成数量。实验重复3次。
qPCR检测各组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量。RNA提取试剂盒提取各组细胞总RNA，逆转录成cDNA。应用Primer 5.0软件设计引物序列。NDRG1 正向引物：GGGCTGAAAAGCATTATTGG，反向引物：CTCCACCATCTCAGGGTTGT；β-actin正向引物：ATTGCCGACAGGATGCAGAA，反向引物：GCTGATCCACATCTGCTGGAA。置于qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Cq值），以β-actin为内参照，依照公式2-ΔΔCq计算mRNA的相对表达量。实验重复3次。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组细胞中NDRG1蛋白相对表达量。参照文献[9]的方法，收集各组细胞，提取蛋白定量。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳，转至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入NDRG1、β-actin一抗，4℃孵育过夜，洗膜缓冲液（TBST）洗膜，加入HRP羊抗兔二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜，加入化学发光底物进行曝光并拍照，凝胶成像系统扫描分析蛋白条带。Image J软件分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白相对表达水平。实验重复3次。
1.3 统计学分析
采用SPSS软件进行统计学分析。定量数据以均数±标准差（x±s）表示。经Kolmogorov-Smirnov检验，数据符合正态分布且方差齐性，多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用t检验。采用Graphpad Prism 9.0对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖促进RF/6A细胞增殖、迁移，提高管腔形成能力
细胞培养12 h后，正常组、甘露醇组仅有少量细胞迁移进入裸区，高糖组可见大量细胞迁移进入裸区（图1A～1C）。与正常组比较，甘露醇组细胞迁移率上升，但差异无统计学意义（t=47.154，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞迁移率上升（t=24.745、33.638），差异均有统计学意义（P＜0.01）（图1D）。与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞增殖显著增多（t=36.659、57.645），差异有统计学意义，（P＜0.01）（图1D，1E）。
图1
高糖促进RF/6A细胞迁移能力（n=3） 1A～1C分别示正常组、甘露醇组、高糖组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：100 μm），正常组、甘露醇组仅有少量细胞迁移进入裸区，高糖组大量细胞迁移进入裸区；1D、1E分别示三组细胞迁移率、增殖率比较，**P＜0.01 A值：吸光度值；RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞：正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
细胞接种6 h后，正常组、甘露醇组细胞管腔形成数量比较，差异无统计学意义（t=49.132，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞管腔形成数量显著增加，差异有统计学意义（t=41.276、22.867，P＜0.01）（图2）。
图2
高糖促进RF/6A细胞管腔形成能力（n=3） 2A～2C分别示正常组、甘露醇组、高糖组细胞显微镜像（标尺：100 μm），与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞管腔形成数量显著增加；2D示三组细胞管腔形成数量比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
2.2 高糖诱导RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达降低
qPCR、Western blot检测结果显示，正常组、甘露醇组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（t=44.756、14.677，P＞0.05）；与正常组、甘露醇组比较，高糖组细胞中NDRG1基因的mRNA（t=36.738、32.976）、蛋白相对表达量显著下降（t=46.145、21.541），差异有统计学意义（P＜0.001）（图3A）。
图3
高糖诱导RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低（n=3） 3A示正常组、甘露醇组、高糖组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量比较，***P＜0.001；3B示电泳图；3C示正常组、甘露醇组、高糖组细胞中NDRG1蛋白相对表达量比较，***P＜0.001 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；actin：肌动蛋白；正常组：细胞常规培养；甘露醇组：加入25 mmol/L甘露醇；高糖组：加入25 mmol/L葡萄糖
2.3 下调NDRG1基因促进RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低
qPCR、Western blot检测结果显示，与siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1基因的mRNA（t=44.275、40.7577）、蛋白（t=57.167、25.877）相对表达量均下调，差异有统计学意义（P＜0.001）；三组细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（F=73.144、64.462，P＜0.001）（图4A）。
图4
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞中NDRG1基因的mRNA和蛋白表达水平降低（n=3） 4A示siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1 mRNA相对表达量比较，***P＜0.001；4B示电泳图；4C示siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组、50 nmol/L siNDRG1组细胞中NDRG1蛋白相对表达量比较，***P＜0.001 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；actin：肌动蛋白；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导；50 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用50 nmol/L siNDRG1进行诱导
2.4 下调NDRG1基因增加RF/6A细胞活性
与正常组、siRNA组比较，30nmmol/L siNDRG1组细胞核数量明显增加（图5A～5C）。三组细胞活性比较，差异有统计学意义（F=21.162，P＜0.01）（图5D）。
图5
下调NDRG1基因减少RF/6A细胞凋亡、增加细胞活性（n=3） 5A～5C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组细胞荧光显微镜像（DAPI，标尺：20 μm），蓝色荧光代表细胞核，用来表征细胞数量，可见30 nmol/L siNDRG1组细胞核数量较正常组、siRNA组明显增加；5D示三组细胞活性比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
2.5 下调NDRG1基因促进高糖诱导的RF/6A细胞迁移
细胞培养12 h后，正常组、siRNA组仅有少量细胞迁移进入裸区，30 nmol/L siNDRG1组可见大量细胞迁移进入裸区（图6A～6C）。三组细胞迁移率比较，差异有统计学意义（F=46.124，P＜0.01）（图6D）。
图6
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞迁移（n=3） 6A～6C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/LsiNDRG1组细胞培养12 h倒置相差显微镜像（标尺：100 μm），正常组、siRNA组仅有少量细胞迁移进入裸区，30 nmol/L siNDRG1组可见大量细胞迁移进入裸区；6D示三组细胞迁移率比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导
2.6 下调NDRG1基因促进细胞管腔形成
细胞接种6 h后，与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组细胞管腔形成数量明显增加，差异有统计学意义（t=63.446、42.742，P＜0.01）（图7）。
图7
下调NDRG1基因促进RF/6A细胞管腔形成（n=3） 7A～7C分别示正常组、siRNA组、30 nmol/L siNDRG1组细胞显微镜像（标尺：100 μm），与正常组、siRNA组比较，30 nmol/L siNDRG1组细胞管腔形成数量显著增加；7D示三组细胞管腔形成数量比较，**P＜0.01 RF/6A细胞：恒河猴视网膜血管内皮细胞；正常组：细胞常规培养；siRNA组：加入25 mmol/L葡萄糖，再加入空白siRNA诱导；30 nmol/L siNDRG1组：加入25 mmol/L葡萄糖，用30 nmol/L siNDRG1进行诱导
3 讨论
研究报道，高血糖诱发的视网膜内皮细胞功能障碍与增生前DR的病理特征有关[9-10]，引发新生血管形成[11-12]。体外血管生成的过程，包括内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等过程[11]。然而目前尚无治疗DR的有效方法。本研究通过体外建立高糖模型模拟DR患者的眼部病理环境，观察在高糖环境中RF/6A增殖、迁移及管腔形成的改变，明确抑制视网膜新生血管的新的分子靶点。
NDRG蛋白家族由4个成员NDRG1～4组成[13]。NDRG1蛋白参与胚胎发生和发育、细胞生长和分化、迁移、炎症、氧化应激反应和免疫等生物学过程[14]。NDRG1蛋白是调节内皮炎症，血栓形成反应的关键介质，参与动脉粥样硬化血栓形成等炎症性血管疾病的发生[15]。研究表明，NDRG1蛋白可降低胰腺癌细胞中CXC趋化因子的表达水平，在抑制胰腺癌细胞炎症和血管生成中起重要作用[16]。在NDRG蛋白家族中，NDRG1蛋白受到缺氧引发的抑制作用最大，上调NDRG1基因表达可抑制缺氧诱导的癌细胞的氧化应激反应，并降低癌细胞的迁移率[17]。NDRG1蛋白作为肿瘤抑制因子或肿瘤启动子的作用取决于肿瘤类型。NDRG1蛋白在胰腺癌细胞中的过表达抑制肿瘤生长和血管生成，而NDRG1蛋白在胃癌细胞中的过表达促进肿瘤生长和血管生成。研究发现，NDRG1蛋白可调节巨噬细胞系分化，促进骨重塑和血管生成的稳态平衡[13]。
NDRG1蛋白也可抑制基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白的表达[18]。其中VEGF是参与新生血管形成的重要因子，而MMP-9可以裂解许多细胞外基质蛋白来调节细胞外基质重塑，参与上皮-间充质转化（EMT）引发纤维化的发生[19]。NDRG1蛋白通过与细胞紧密连接的组成成分相互作用并促进其在结直肠癌中的泛素化来抑制EMT生物行为[20]。NDRG1蛋白在哺乳动物视网膜中的作用尚不明确，但研究发现，NDRG1蛋白缺乏阻碍了斑马鱼的早期视网膜血管发育，而在成年后，NDRG1蛋白的表达水平显著降低[21]，这提示NDRG1蛋白可能在视网膜的稳定性中发挥重要作用，因此本研究聚焦NDRG1对RF/6A的管腔形成能力的影响，初步发现下调NDRG1基因后可抑制RF/6A的细胞管腔形成能力，但在不同年龄阶段的视网膜中NDRG1基因的作用尚需进一步的研究。
目前已知在肿瘤中，NDRG1基因在炎症、氧化应激、新生血管与纤维化方面均发挥抑制作用，这为明确NDRG1基因在DR中的全面作用提供了重要的思路。DR患者由于持续性高血糖，可引发炎症、氧化应激的发生，进而刺激眼部新生血管生成，后期可发展为纤维化，造成不可逆的视力损伤。本研究初步对NDRG1基因在新生血管方面的作用进行了详细的研究，发现NDRG1基因在高糖诱导的RF/6A细胞中低表达，下调RF/6A细胞中NDRG1基因，可诱导其增殖、迁移和管腔形成，提示NDRG1基因可能在抑制视网膜新生血管方面发挥重要作用。
本研究存在局限性是仅验证了下调NDRG1基因对RF/6A细胞的影响，未观察上调NDRG1基因后的具体作用。未来需进一步探究上调NDRG1基因后对视网膜血管内皮细胞的保护作用以及在炎症、氧化应激与纤维化方面的重要性，以明确治疗DR的新靶点。
