糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的重要并发症，尤其在工作年龄段人群中是视力损害的主要原因[1]。高血糖引发的神经炎症和微血管损伤破坏血视网膜屏障，促进病理性血管生成，是DR发展的关键环节[2]。轴突导向因子-1（NTN1）是一种在神经发育中促进轴突生长的蛋白，也被发现参与内皮细胞活化和血管生成，具有浓度依赖性的双相效应。低浓度的NTN1可激活内皮细胞，促进血管生成，但具体机制尚不完全清楚[3-5]。G蛋白抑制性α亚单位（Gαi1/Gαi3）在多种生长因子信号转导中发挥作用，通过活化蛋白激酶B（Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和细胞外信号调节激酶（Erk）-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，影响细胞增殖和迁移[6-11]。Gαi1/Gαi3介导的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路对视网膜血管新生至关重要，提示其在病理性血管生成中作为潜在治疗靶点的重要性[11-12]。本研究旨在探索Gαi1/Gαi3在NTN1信号转导和血管生成中的作用及其分子机制，通过建立糖尿病小鼠模型，深入了解血管生成的分子基础，以期为DR的早期干预和治疗策略提供新的理论依据和潜在靶标。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
雄性C57BL/6J小鼠55只，其中6～8周龄20只，体重20～25 g；2周龄35只，体重约10 g；均为无特定病原体级，由南京君科生物工程有限公司提供。所有小鼠饲养于标准（12 h明/暗循环）清洁级环境中。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得南京医科大学实验动物伦理委员会许可[许可证号：SYXK（苏）2018-0020]。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞株由本实验室自行保存。携绿色荧光蛋白（GFP）Gαi1/Gαi3 shRNA重组腺相关病毒（AAV5）载体（AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA）、仅携带GFP的空白AAV5载体、Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒、仅携带GFP的空白慢病毒（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）。无水葡萄糖（德国Biofroxx公司）；内皮细胞培养基（ECM培养基）（美国Sciencell公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、嘌呤霉素、辣根过氧化物酶（HRP）二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；链脲佐菌素（STZ）、磷酸盐缓冲液（PBS）（北京兰杰柯科技有限公司）；20倍洗膜缓冲液（TBST）（北京索莱宝科技有限公司）；核糖体蛋白S6激酶（S6K）抗体、磷酸化S6K（p-S6K）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；Erk1/2抗体、磷酸化Erk1/2（p-Erk1/2）抗体、Akt抗体、磷酸化Akt（p-Akt）抗体（杭州华安生物技术有限公司）；NTN1（美国Enzo公司）；β-肌动蛋白（actin）抗体（成都正能生物技术有限责任公司）。EdU-555细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Transwell共培养板、高蛋白浓度基质胶（美国Corning公司）；同工凝集素B4（IB4）（美国Sigma公司）；细胞/组织总RNA提取试剂盒、逆转录预混液、通用型高灵敏度染料法定量聚合酶链反应（qPCR）检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；PIKOReal 96实时荧光qPCR（qRT-PCR）仪（美国Thermo公司）；倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。
1.2 实验动物分组和糖尿病模型建立
采用随机数字表法将20只6～8周龄小鼠分为正常对照组、糖尿病组，每组各10只。糖尿病组小鼠空腹饥饿12 h（期间可自由进水）后，按10 mg/kg剂量予以小鼠腹腔注射STZ。1周后测空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，继续高糖、高脂饲养，期间定期监测血糖，使血糖维持在成模范围内直至实验结束。
将35只2周龄小鼠随机分为正常对照组、玻璃体腔注射NTN1组（NTN1组）、视网膜内皮细胞Gαi1/Gαi3特异性敲低+玻璃体腔注射NTN1组（Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组），其中正常对照组、NTN1组每组各15只，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组5只。NTN1组于小鼠2周龄时玻璃体腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组于小鼠2周龄时玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃体腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。玻璃体腔注射方式：腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，散瞳后微量注射器抽取AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl于小鼠眼鼻上方角膜缘后约1 mm处垂直穿刺进入玻璃体腔，向眼球中心方向进针，将药液缓慢注入玻璃体腔，眼内停留约30 s后拔出针头，涂左氧氟沙星眼膏。
1.3 细胞培养、转染分组
细胞培养。将HUVEC细胞株置于含5%胎牛血清和1%双抗的ECM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。
将HUVEC分为阴性对照慢病毒组（shC组）、阴性对照慢病毒+NTN1处理组（shC+NTN1组）、Gαi1/Gαi3敲低组（shGαi1/Gαi3组）、Gαi1/Gαi3敲低+NTN1处理组（shGαi1/Gαi3+NTN1组）。shC组细胞加入空白慢病毒；shGαi1/Gαi3组细胞加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导。转染20 h后换为正常完全培养基，然后正常传代，稳定细胞株通过含有嘌呤霉素的完全培养基筛选1周。shC+NTN1组细胞及shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞在嘌呤霉素筛选后使用NTN1（50 ng/ml）预处理24 h后进行后续实验。
1.4 IB4染色法检测Gαi1/Gαi3敲低对NTN1诱导的视网膜新生血管的影响
正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组小鼠4周龄时腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，将弯镊沿颞侧眶壁进入呈先垂直再平行向鼻侧走形，至眼球下方夹住视神经，摘取完整眼球，置于4%多聚甲醛中固定40 min，转移至含PBS的10 cm细胞培养皿中。用眼科剪和眼科镊去除眼球周围组织，沿角膜缘剪开眼球，去除眼前节，移除晶状体和玻璃体，分离视网膜，切成4瓣。固定、通透封闭，IB4染料（1∶50）4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，10 min/次。在每个视网膜瓣的中间区域随机选取视野，于荧光显微镜下按序拍摄。
1.5 EdU实验观察细胞增殖能力
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入10 μmol/L EdU工作液，于37℃孵育箱中培养2 h，固定及洗涤后，DAPI避光染色10 min，PBS洗涤3次，5 min/次。荧光显微镜观察并计数。细胞核呈蓝色荧光。实验重复3次。
1.6 Transwell实验观察细胞的迁移能力
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于Transwell小室上室内，无血清培养基培养；下室加入含5%胎牛血清的ECM培养基。细胞培养板置于孵箱中培育24 h，多聚甲醛固定下室表面细胞15 min，棉签擦去上室未向下室迁移的细胞，常规结晶紫染色3 min。光学显微镜下观察拍照。每组随机选取6～8个视野以计数小室底膜上、下室侧附着的细胞，即为发生迁移的细胞数。每组各设3个复孔，重复3次。
1.7 Matrigel实验检测细胞管腔形成能力
将4℃高蛋白浓度基质胶40 μl缓慢加入24孔板中，于37℃孵育箱中培养30 min。shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔板中孵育，6 h后观察管腔形成情况。计数相同视野面积下的管腔形成数量。实验重复3次。
1.8 qPCR检测小鼠视网膜及HUVEC中Ntn1、Gαi1、Gαi3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的mRNA相对表达量
过量麻醉处死小鼠，摘除眼球剥离视网膜，RNA提取试剂盒提取总RNA；HUVEC传代后铺于6孔板，细胞汇合度为90%～100%时RNA提取试剂盒提取总RNA。反转录试剂逆转录成cDNA，按相应基因配置SYBR Green qPCR扩增反应体系进行qPCR检测。应用Express 3.0软件设计引物序列（表1）。置于qRT-PCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以GAPDH为内参照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
表1
引物序列
1.9 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜组织及HUVEC中NTN1、Gαi1、Gαi3、Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达
收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入10 μl待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；140 V恒压50 min，400 mA转膜40 min。5%脱脂牛奶封闭2 h，1∶1 000一抗4℃孵育过夜（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min，重复3次；加入化学发光剂，暗室曝光。Image J软件分析蛋白条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照β-actin蛋白条带灰度值，磷酸化蛋白相对总蛋白相对表达量=磷酸化蛋白条带灰度值/总蛋白条带灰度值。
1.10 统计学方法
采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验；三组间比较采用单因素方差分析；多因素比较采用事后Dunnett检验。采用Graph-prism软件对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DR模型小鼠视网膜组织中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表达升高
与正常对照组比较，糖尿病组小鼠视网膜内Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著增加，差异有统计学意义（t=11.800、9.298、10.620、7.503、3.432、8.037，P＜0.000 1）（图1）。
图1
正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 1A示Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量，****P＜0.000 1；1B示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；1C示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量比较，**P＜0.01，***P＜0.001 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；正常对照组：不做任何处理；糖尿病组：腹腔注射链脲佐菌素10 mg/kg
2.2 Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导后HUVEC中 Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量受到抑制
与shC组比较，shGαi1/Gαi3组HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义（t=16.310、16.300、13.600、9.068，P＜0.000 1）（图2）。
图2
shC组、shGαi1/Gαi3组HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 2A示Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量结果，****P＜0.000 1；2B示Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；2C示中Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量，***P＜0.001, ****P<0.000 1 HUVEC：人脐静脉内皮细胞；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；actin：肌动蛋白；shC组：空白慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导
2.3 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的HUVEC增殖、迁移与管腔形成能力
与shC组比较，shC+NTN1组HUVEC增殖率、迁移数量、管腔形成数量均显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC增殖率、迁移数量、管腔形成数量均显著减少，差异均有统计学意义（F=62.750、49.830、54.900，P＜0.000 1）（图3~5）。
图3
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC增殖率比较（n=3） 3A～3D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组荧光显微镜像（DAPI染色，标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞增殖率显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞增殖率无明显变化；3E示四组细胞增殖率比较，***P＜0.001，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
图4
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC迁移数量比较（n=3） 4A～4D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组光学显微镜像（结晶紫染色，标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞迁移数量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞迁移数量无明显变化；4E示四组细胞迁移数量比较，**P＜0.01，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
图5
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC管腔形成情况比较（n=3） 5A～5D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞倒置相差显微镜像（标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞管腔形成数量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞管腔形成数量显著减少；5E示四组细胞管腔形成数目比较，*P＜0.05 ，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
2.4 敲低Gαi1/Gαi3基因检测结果抑制NTN1诱导的Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表达
qPCR、Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组小鼠视网膜组织中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著下降，差异有统计学意义（t=10.920、13.460、9.219、10.500，P＜0.000 1）（图6）。
图6
正常对照组、Gαi1/Gαi3 eKD组小鼠视网膜组织中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 6A示Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量；6B示Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；6C示Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量，****P＜0.000 1 Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；AAV：腺相关病毒；TIE1：人酪氨酸蛋白激酶受体tie-1；正常对照组：不做任何处理；Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组：玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3，1周后玻璃体腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl
2.5 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的视网膜新生血管形成
免疫荧光染色结果显示，与正常对照组相比，NTN1组视网膜新生血管形成面积显著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管形成面积显著减小，差异有统计学意义（F=24.010，P＜0.000 1）（图7）。
图7
正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管面积比较（n=3） 7A～7C分别示正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜荧光显微镜像（IB4染色，标尺：200 μm），下图为上图黄框区域放大像，与正常对照组相比，NTN1组视网膜新生血管形成面积显著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管形成面积显著减小；7D示三组视网膜新生血管面积比较，*P＜0.05，**P＜0.01 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；AAV：腺相关病毒；正常对照组：不做任何处理；NTN1组：玻璃体腔注射2 μl 50 ng/ml NTN1；Gαi1/Gαi3 eKD组+NTN1组：玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃体腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl；IB4：同工凝集素B4
图8
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC中p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白表达情况（n=3） 8A示电泳图；8B示各组HUVEC中p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量比较，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1 Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；S6K：核糖体蛋白S6激酶；p-S6K：磷酸化S6K；Erk1/2：细胞外调节蛋白激酶；磷酸化Erk1/2；NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
2.6 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的HUVEC中Akt-mTOR和Erk的信号通路激活
Western blot检测结果显示，与shC组相比，shC+NTN1组p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量显著减少，差异有统计学意义（F=78.610、144.400、77.010，P＜0.000 1）（图8）。
3 讨论
DR作为一种典型的微血管并发症，其发病机制涉及多种生长因子和信号通路的复杂交互。Gαi1/Gαi3介导的VEGF信号通路的活化是VEGF促视网膜血管新生的核心机制，为病理性血管新生提供了新的治疗靶点。通过敲低Gαi1和Gαi3基因可显著抑制碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管形成，并减少了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠的视网膜新生血管形成[11-12]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1作为催化糖异生的关键限速酶，通过促进Gαi3蛋白表达增加和Akt-mTOR信号通路激活，在体内外发挥促新生血管作用[13]。此外，Gαi1和Gαi3还是R-脊椎蛋白3诱导的Akt-mTOR激活和新生血管生成所需的关键信号蛋白[14]。
研究表明，NTN1具有双向调节血管活性的作用。在大鼠角膜碱烧伤模型中，角膜上皮中Ntn1 mRNA的表达水平降低，抑制角膜新生血管形成[15]。NTN1也可以作为促血管生成因子，正向调控内皮细胞迁移，促进DR等血管新生相关疾病的进程[16-17]。研究报道，在OIR小鼠模型中，视网膜组织Ntn1基因表达水平显著升高，抑制Ntn1基因表达后视网膜新生血管减少[18]。在大鼠DR模型中，静脉注射100 ng/ml NTN1加速视网膜新生血管的形成[6]。研究报道，大鼠DR模型的视网膜组织中Ntn1 mRNA及蛋白表达均明显增加，这提示其可能促进内皮细胞的增殖和分化，进而诱导视网膜新生血管形成[19]。NTN1在不同模型及微环境下的差异性表达和作用，反映其可能在血管生成调控中具有复杂性和多功能性。
本研究发现，12周糖尿病模型小鼠视网膜中Ntn1、Gαi1和Gαi3基因的mRNA和蛋白表达均显著增加，这提示DR过程中持续异常分泌的NTN1蛋白在血管生成过程中的重要作用。外源性添加低浓度NTN1（50 ng/ml）蛋白刺激后，HUVEC增殖、迁移与细胞成管能力增强，小鼠视网膜新生血管增多，这与以往研究结果一致[15-16]。为了进一步明确Ntn1基因促进新生血管的具体机制，我们在HUVEC中转染shRNA Gαi1和shRNA Gαi3沉默Gαi1/Gαi3，随后发现NTN1诱导的促血管生成作用被抑制，这表明Gαi1和Gαi3介导了NTN1诱导的体内外促血管生成作用。既往研究报道，NTN1诱导下游Akt-mTOR信号通路和Erk激活[20-22]。本研究证实，NTN1可以在HUVEC中诱导下游Akt-mTOR信号通路和Erk激活，而这种激活作用在Gαi1和Gαi3基因敲除后几乎被完全抑制。据此我们推测，Gαi1和Gαi3蛋白是介导NTN1诱导的下游Akt-mTOR与Erk-MAPK信号通路激活和血管生成的信号蛋白。这进一步表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信号转导增加可能与DR异常血管生成有关。
在DR的进程中，NTN1可能作为一种促血管生成因子，诱导新生血管的形成。而这种作用可能与NTN1与细胞膜上特定受体，如结肠癌缺失蛋白、不协调5同系物、黑色素瘤细胞黏附分子等的结合有关，从而激活下游的信号通路[23-24]。Gαi1和Gαi3是包括VEGF受体及白细胞介素-4受体内吞和内化的关键蛋白，而接头蛋白Grb2关联结合蛋白1招募往往在Gαi1和Gαi3蛋白诱导的下游信号转导中发挥重要作用[11, 14, 25]。这说明在DR中，Gαi1和Gαi3基因可能通过类似的机制参与NTN1诱导的血管生成过程。
DR被认为是一种微血管疾病，以选择性视网膜周细胞丢失、基底膜增厚、毛细血管闭塞等毛细血管内皮损害、血视网膜屏障功能受损、微血管渗漏、广泛的视网膜缺血缺氧促发VEGF等生长因子表达增加，最终导致视网膜新生血管形成。目前临床使用的VEGF单克隆抗体在一定程度上能够阻止血管渗漏和新生血管的形成，但由于DR病理性血管生成过程涉及其他生长因子和各种炎症细胞因子的参与，部分患者对VEGF单克隆抗体敏感性有限且治疗后易复发[26]。因此确定控制DR进展的新的治疗靶点是极其重要的。本研究结果表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信号转导可能是DR异常血管生成的重要原因之一，这种级联反应提示DR分子治疗的新靶点。然而目前研究存在一定局限性。首先，目前结果侧重于体外细胞实验，尚无法全方位立体模拟错综复杂的体内环境。其次，在研究方法上，本研究仅通过敲低Gαi1和Gαi3基因以观察其对血管生成的影响，虽揭示Gαi1和Gαi3基因在介导NTN1促血管生成效应中的作用，但对于这一信号通路更深入的分子机制、调控细节及其与其他信号通路的交互作用，并未进行深入探究。为实现以干预NTN1-Gαi1/Gαi3信号为靶点的治疗方法，未来需进一步探索体内外实验，通过基因敲低、敲除、过表达、显性阴性突变、挽救Ntn1、Gαi1、Gαi3基因等多种方法，正负向调节NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表达或活化水平，探索影响其血管生成的具体机制。结合蛋白和转录组学技术，全面分析NTN1刺激下细胞内的基因转录和蛋白质表达的变化。在未来需重点关注NTN1-Gαi1/Gαi3参与血管新生调控的具体机制，为视网膜新生血管性疾病的治疗提供新的思路和策略。
糖尿病视网膜病变（DR）是糖尿病的重要并发症，尤其在工作年龄段人群中是视力损害的主要原因[1]。高血糖引发的神经炎症和微血管损伤破坏血视网膜屏障，促进病理性血管生成，是DR发展的关键环节[2]。轴突导向因子-1（NTN1）是一种在神经发育中促进轴突生长的蛋白，也被发现参与内皮细胞活化和血管生成，具有浓度依赖性的双相效应。低浓度的NTN1可激活内皮细胞，促进血管生成，但具体机制尚不完全清楚[3-5]。G蛋白抑制性α亚单位（Gαi1/Gαi3）在多种生长因子信号转导中发挥作用，通过活化蛋白激酶B（Akt）-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和细胞外信号调节激酶（Erk）-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，影响细胞增殖和迁移[6-11]。Gαi1/Gαi3介导的血管内皮生长因子（VEGF）信号通路对视网膜血管新生至关重要，提示其在病理性血管生成中作为潜在治疗靶点的重要性[11-12]。本研究旨在探索Gαi1/Gαi3在NTN1信号转导和血管生成中的作用及其分子机制，通过建立糖尿病小鼠模型，深入了解血管生成的分子基础，以期为DR的早期干预和治疗策略提供新的理论依据和潜在靶标。
1 材料和方法
1.1 实验动物及主要材料、仪器
雄性C57BL/6J小鼠55只，其中6～8周龄20只，体重20～25 g；2周龄35只，体重约10 g；均为无特定病原体级，由南京君科生物工程有限公司提供。所有小鼠饲养于标准（12 h明/暗循环）清洁级环境中。饲养环境及实验操作均符合国家科学技术委员会《实验动物管理条例》规定，并获得南京医科大学实验动物伦理委员会许可[许可证号：SYXK（苏）2018-0020]。
人脐静脉内皮细胞（HUVEC）细胞株由本实验室自行保存。携绿色荧光蛋白（GFP）Gαi1/Gαi3 shRNA重组腺相关病毒（AAV5）载体（AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA）、仅携带GFP的空白AAV5载体、Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒、仅携带GFP的空白慢病毒（上海吉凯基因医学科技股份有限公司）。无水葡萄糖（德国Biofroxx公司）；内皮细胞培养基（ECM培养基）（美国Sciencell公司）；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、嘌呤霉素、辣根过氧化物酶（HRP）二抗（上海碧云天生物技术有限公司）；链脲佐菌素（STZ）、磷酸盐缓冲液（PBS）（北京兰杰柯科技有限公司）；20倍洗膜缓冲液（TBST）（北京索莱宝科技有限公司）；核糖体蛋白S6激酶（S6K）抗体、磷酸化S6K（p-S6K）抗体（美国Cell Signaling Technology公司）；Erk1/2抗体、磷酸化Erk1/2（p-Erk1/2）抗体、Akt抗体、磷酸化Akt（p-Akt）抗体（杭州华安生物技术有限公司）；NTN1（美国Enzo公司）；β-肌动蛋白（actin）抗体（成都正能生物技术有限责任公司）。EdU-555细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；Transwell共培养板、高蛋白浓度基质胶（美国Corning公司）；同工凝集素B4（IB4）（美国Sigma公司）；细胞/组织总RNA提取试剂盒、逆转录预混液、通用型高灵敏度染料法定量聚合酶链反应（qPCR）检测试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）；PIKOReal 96实时荧光qPCR（qRT-PCR）仪（美国Thermo公司）；倒置荧光显微镜（日本Olympus公司）。
1.2 实验动物分组和糖尿病模型建立
采用随机数字表法将20只6～8周龄小鼠分为正常对照组、糖尿病组，每组各10只。糖尿病组小鼠空腹饥饿12 h（期间可自由进水）后，按10 mg/kg剂量予以小鼠腹腔注射STZ。1周后测空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功，继续高糖、高脂饲养，期间定期监测血糖，使血糖维持在成模范围内直至实验结束。
将35只2周龄小鼠随机分为正常对照组、玻璃体腔注射NTN1组（NTN1组）、视网膜内皮细胞Gαi1/Gαi3特异性敲低+玻璃体腔注射NTN1组（Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组），其中正常对照组、NTN1组每组各15只，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组5只。NTN1组于小鼠2周龄时玻璃体腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组于小鼠2周龄时玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃体腔注射50 ng/ml NTN1 2 μl。玻璃体腔注射方式：腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉小鼠，散瞳后微量注射器抽取AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl于小鼠眼鼻上方角膜缘后约1 mm处垂直穿刺进入玻璃体腔，向眼球中心方向进针，将药液缓慢注入玻璃体腔，眼内停留约30 s后拔出针头，涂左氧氟沙星眼膏。
1.3 细胞培养、转染分组
细胞培养。将HUVEC细胞株置于含5%胎牛血清和1%双抗的ECM培养基中常规培养。取对数生长期细胞用于实验。
将HUVEC分为阴性对照慢病毒组（shC组）、阴性对照慢病毒+NTN1处理组（shC+NTN1组）、Gαi1/Gαi3敲低组（shGαi1/Gαi3组）、Gαi1/Gαi3敲低+NTN1处理组（shGαi1/Gαi3+NTN1组）。shC组细胞加入空白慢病毒；shGαi1/Gαi3组细胞加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导。转染20 h后换为正常完全培养基，然后正常传代，稳定细胞株通过含有嘌呤霉素的完全培养基筛选1周。shC+NTN1组细胞及shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞在嘌呤霉素筛选后使用NTN1（50 ng/ml）预处理24 h后进行后续实验。
1.4 IB4染色法检测Gαi1/Gαi3敲低对NTN1诱导的视网膜新生血管的影响
正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组小鼠4周龄时腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉，将弯镊沿颞侧眶壁进入呈先垂直再平行向鼻侧走形，至眼球下方夹住视神经，摘取完整眼球，置于4%多聚甲醛中固定40 min，转移至含PBS的10 cm细胞培养皿中。用眼科剪和眼科镊去除眼球周围组织，沿角膜缘剪开眼球，去除眼前节，移除晶状体和玻璃体，分离视网膜，切成4瓣。固定、通透封闭，IB4染料（1∶50）4℃孵育过夜，PBS洗涤3次，10 min/次。在每个视网膜瓣的中间区域随机选取视野，于荧光显微镜下按序拍摄。
1.5 EdU实验观察细胞增殖能力
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入10 μmol/L EdU工作液，于37℃孵育箱中培养2 h，固定及洗涤后，DAPI避光染色10 min，PBS洗涤3次，5 min/次。荧光显微镜观察并计数。细胞核呈蓝色荧光。实验重复3次。
1.6 Transwell实验观察细胞的迁移能力
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于Transwell小室上室内，无血清培养基培养；下室加入含5%胎牛血清的ECM培养基。细胞培养板置于孵箱中培育24 h，多聚甲醛固定下室表面细胞15 min，棉签擦去上室未向下室迁移的细胞，常规结晶紫染色3 min。光学显微镜下观察拍照。每组随机选取6～8个视野以计数小室底膜上、下室侧附着的细胞，即为发生迁移的细胞数。每组各设3个复孔，重复3次。
1.7 Matrigel实验检测细胞管腔形成能力
将4℃高蛋白浓度基质胶40 μl缓慢加入24孔板中，于37℃孵育箱中培养30 min。shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞以8×104个/孔的密度接种于24孔板中孵育，6 h后观察管腔形成情况。计数相同视野面积下的管腔形成数量。实验重复3次。
1.8 qPCR检测小鼠视网膜及HUVEC中Ntn1、Gαi1、Gαi3、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Gapdh）基因的mRNA相对表达量
过量麻醉处死小鼠，摘除眼球剥离视网膜，RNA提取试剂盒提取总RNA；HUVEC传代后铺于6孔板，细胞汇合度为90%～100%时RNA提取试剂盒提取总RNA。反转录试剂逆转录成cDNA，按相应基因配置SYBR Green qPCR扩增反应体系进行qPCR检测。应用Express 3.0软件设计引物序列（表1）。置于qRT-PCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以GAPDH为内参照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
表1
引物序列
1.9 蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测小鼠视网膜组织及HUVEC中NTN1、Gαi1、Gαi3、Akt、p-Akt、S6K、p-S6K、Erk1/2、p-Erk1/2蛋白表达
收集各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入10 μl待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；140 V恒压50 min，400 mA转膜40 min。5%脱脂牛奶封闭2 h，1∶1 000一抗4℃孵育过夜（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗，室温孵育1 h，TBST洗膜10 min，重复3次；加入化学发光剂，暗室曝光。Image J软件分析蛋白条带的灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照β-actin蛋白条带灰度值，磷酸化蛋白相对总蛋白相对表达量=磷酸化蛋白条带灰度值/总蛋白条带灰度值。
1.10 统计学方法
采用SPSS20.0软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。两组间比较采用t检验；三组间比较采用单因素方差分析；多因素比较采用事后Dunnett检验。采用Graph-prism软件对所获得数据进行图表整理。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 DR模型小鼠视网膜组织中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表达升高
与正常对照组比较，糖尿病组小鼠视网膜内Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著增加，差异有统计学意义（t=11.800、9.298、10.620、7.503、3.432、8.037，P＜0.000 1）（图1）。
图1
正常对照组、糖尿病组小鼠视网膜中Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 1A示Ntn1、Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量，****P＜0.000 1；1B示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；1C示NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量比较，**P＜0.01，***P＜0.001 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；正常对照组：不做任何处理；糖尿病组：腹腔注射链脲佐菌素10 mg/kg
2.2 Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导后HUVEC中 Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量受到抑制
与shC组比较，shGαi1/Gαi3组HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著降低，差异有统计学意义（t=16.310、16.300、13.600、9.068，P＜0.000 1）（图2）。
图2
shC组、shGαi1/Gαi3组HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 2A示Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量结果，****P＜0.000 1；2B示Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；2C示中Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量，***P＜0.001, ****P<0.000 1 HUVEC：人脐静脉内皮细胞；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；actin：肌动蛋白；shC组：空白慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导
2.3 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的HUVEC增殖、迁移与管腔形成能力
与shC组比较，shC+NTN1组HUVEC增殖率、迁移数量、管腔形成数量均显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC增殖率、迁移数量、管腔形成数量均显著减少，差异均有统计学意义（F=62.750、49.830、54.900，P＜0.000 1）（图3~5）。
图3
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC增殖率比较（n=3） 3A～3D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组荧光显微镜像（DAPI染色，标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞增殖率显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞增殖率无明显变化；3E示四组细胞增殖率比较，***P＜0.001，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚
图4
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC迁移数量比较（n=3） 4A～4D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组光学显微镜像（结晶紫染色，标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞迁移数量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞迁移数量无明显变化；4E示四组细胞迁移数量比较，**P＜0.01，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
图5
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC管腔形成情况比较（n=3） 5A～5D分别示shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞倒置相差显微镜像（标尺：50 μm），与shC组比较，shC+NTN1组细胞管腔形成数量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组细胞管腔形成数量显著减少；5E示四组细胞管腔形成数目比较，*P＜0.05 ，****P＜0.000 1 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
2.4 敲低Gαi1/Gαi3基因检测结果抑制NTN1诱导的Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白表达
qPCR、Western blot检测结果显示，与正常对照组比较，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组小鼠视网膜组织中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著下降，差异有统计学意义（t=10.920、13.460、9.219、10.500，P＜0.000 1）（图6）。
图6
正常对照组、Gαi1/Gαi3 eKD组小鼠视网膜组织中Gαi1、Gαi3 mRNA及蛋白相对表达量比较（n=3） 6A示Gαi1、Gαi3 mRNA相对表达量；6B示Gαi1、Gαi3蛋白表达电泳图；6C示Gαi1、Gαi3蛋白相对表达量，****P＜0.000 1 Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；AAV：腺相关病毒；TIE1：人酪氨酸蛋白激酶受体tie-1；正常对照组：不做任何处理；Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组：玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3，1周后玻璃体腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl
2.5 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的视网膜新生血管形成
免疫荧光染色结果显示，与正常对照组相比，NTN1组视网膜新生血管形成面积显著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管形成面积显著减小，差异有统计学意义（F=24.010，P＜0.000 1）（图7）。
图7
正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管面积比较（n=3） 7A～7C分别示正常对照组、NTN1组、Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜荧光显微镜像（IB4染色，标尺：200 μm），下图为上图黄框区域放大像，与正常对照组相比，NTN1组视网膜新生血管形成面积显著增加，Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜新生血管形成面积显著减小；7D示三组视网膜新生血管面积比较，*P＜0.05，**P＜0.01 NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；AAV：腺相关病毒；正常对照组：不做任何处理；NTN1组：玻璃体腔注射2 μl 50 ng/ml NTN1；Gαi1/Gαi3 eKD组+NTN1组：玻璃体腔注射AAV5-TIE1-Gαi1/Gαi3 shRNA 2 μl，1周后玻璃体腔注射 50 ng/ml NTN1 2 μl；IB4：同工凝集素B4
图8
shC组、shC+NTN1组、shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组HUVEC中p-Akt、Akt、p-S6K、S6K、p-Erk1/2、Erk1/2蛋白表达情况（n=3） 8A示电泳图；8B示各组HUVEC中p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量比较，*P＜0.05，**P＜0.01，****P＜0.000 1 Akt：蛋白激酶B；p-Akt：磷酸化Akt；S6K：核糖体蛋白S6激酶；p-S6K：磷酸化S6K；Erk1/2：细胞外调节蛋白激酶；磷酸化Erk1/2；NTN1：轴突导向因子1；Gαi1：G蛋白抑制性α亚单位1；Gαi3：G蛋白抑制性α亚单位3；shC组：加入空白慢病毒诱导；shC+NTN1组：加入空白慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导；shGαi1/Gαi3组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒诱导；shGαi1/Gαi3+NTN1组：加入Gαi1/Gαi3 shRNA重组慢病毒，用50 ng/ml NTN1诱导
2.6 敲低Gαi1/Gαi3基因抑制NTN1诱导的HUVEC中Akt-mTOR和Erk的信号通路激活
Western blot检测结果显示，与shC组相比，shC+NTN1组p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量显著增加，shGαi1/Gαi3组、shGαi1/Gαi3+NTN1组p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量显著减少，差异有统计学意义（F=78.610、144.400、77.010，P＜0.000 1）（图8）。
3 讨论
DR作为一种典型的微血管并发症，其发病机制涉及多种生长因子和信号通路的复杂交互。Gαi1/Gαi3介导的VEGF信号通路的活化是VEGF促视网膜血管新生的核心机制，为病理性血管新生提供了新的治疗靶点。通过敲低Gαi1和Gαi3基因可显著抑制碱烧伤诱导的小鼠角膜新生血管形成，并减少了氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠的视网膜新生血管形成[11-12]。磷酸烯醇丙酮酸羧激酶1作为催化糖异生的关键限速酶，通过促进Gαi3蛋白表达增加和Akt-mTOR信号通路激活，在体内外发挥促新生血管作用[13]。此外，Gαi1和Gαi3还是R-脊椎蛋白3诱导的Akt-mTOR激活和新生血管生成所需的关键信号蛋白[14]。
研究表明，NTN1具有双向调节血管活性的作用。在大鼠角膜碱烧伤模型中，角膜上皮中Ntn1 mRNA的表达水平降低，抑制角膜新生血管形成[15]。NTN1也可以作为促血管生成因子，正向调控内皮细胞迁移，促进DR等血管新生相关疾病的进程[16-17]。研究报道，在OIR小鼠模型中，视网膜组织Ntn1基因表达水平显著升高，抑制Ntn1基因表达后视网膜新生血管减少[18]。在大鼠DR模型中，静脉注射100 ng/ml NTN1加速视网膜新生血管的形成[6]。研究报道，大鼠DR模型的视网膜组织中Ntn1 mRNA及蛋白表达均明显增加，这提示其可能促进内皮细胞的增殖和分化，进而诱导视网膜新生血管形成[19]。NTN1在不同模型及微环境下的差异性表达和作用，反映其可能在血管生成调控中具有复杂性和多功能性。
本研究发现，12周糖尿病模型小鼠视网膜中Ntn1、Gαi1和Gαi3基因的mRNA和蛋白表达均显著增加，这提示DR过程中持续异常分泌的NTN1蛋白在血管生成过程中的重要作用。外源性添加低浓度NTN1（50 ng/ml）蛋白刺激后，HUVEC增殖、迁移与细胞成管能力增强，小鼠视网膜新生血管增多，这与以往研究结果一致[15-16]。为了进一步明确Ntn1基因促进新生血管的具体机制，我们在HUVEC中转染shRNA Gαi1和shRNA Gαi3沉默Gαi1/Gαi3，随后发现NTN1诱导的促血管生成作用被抑制，这表明Gαi1和Gαi3介导了NTN1诱导的体内外促血管生成作用。既往研究报道，NTN1诱导下游Akt-mTOR信号通路和Erk激活[20-22]。本研究证实，NTN1可以在HUVEC中诱导下游Akt-mTOR信号通路和Erk激活，而这种激活作用在Gαi1和Gαi3基因敲除后几乎被完全抑制。据此我们推测，Gαi1和Gαi3蛋白是介导NTN1诱导的下游Akt-mTOR与Erk-MAPK信号通路激活和血管生成的信号蛋白。这进一步表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信号转导增加可能与DR异常血管生成有关。
在DR的进程中，NTN1可能作为一种促血管生成因子，诱导新生血管的形成。而这种作用可能与NTN1与细胞膜上特定受体，如结肠癌缺失蛋白、不协调5同系物、黑色素瘤细胞黏附分子等的结合有关，从而激活下游的信号通路[23-24]。Gαi1和Gαi3是包括VEGF受体及白细胞介素-4受体内吞和内化的关键蛋白，而接头蛋白Grb2关联结合蛋白1招募往往在Gαi1和Gαi3蛋白诱导的下游信号转导中发挥重要作用[11, 14, 25]。这说明在DR中，Gαi1和Gαi3基因可能通过类似的机制参与NTN1诱导的血管生成过程。
DR被认为是一种微血管疾病，以选择性视网膜周细胞丢失、基底膜增厚、毛细血管闭塞等毛细血管内皮损害、血视网膜屏障功能受损、微血管渗漏、广泛的视网膜缺血缺氧促发VEGF等生长因子表达增加，最终导致视网膜新生血管形成。目前临床使用的VEGF单克隆抗体在一定程度上能够阻止血管渗漏和新生血管的形成，但由于DR病理性血管生成过程涉及其他生长因子和各种炎症细胞因子的参与，部分患者对VEGF单克隆抗体敏感性有限且治疗后易复发[26]。因此确定控制DR进展的新的治疗靶点是极其重要的。本研究结果表明，NTN1-Gαi1/Gαi3信号转导可能是DR异常血管生成的重要原因之一，这种级联反应提示DR分子治疗的新靶点。然而目前研究存在一定局限性。首先，目前结果侧重于体外细胞实验，尚无法全方位立体模拟错综复杂的体内环境。其次，在研究方法上，本研究仅通过敲低Gαi1和Gαi3基因以观察其对血管生成的影响，虽揭示Gαi1和Gαi3基因在介导NTN1促血管生成效应中的作用，但对于这一信号通路更深入的分子机制、调控细节及其与其他信号通路的交互作用，并未进行深入探究。为实现以干预NTN1-Gαi1/Gαi3信号为靶点的治疗方法，未来需进一步探索体内外实验，通过基因敲低、敲除、过表达、显性阴性突变、挽救Ntn1、Gαi1、Gαi3基因等多种方法，正负向调节NTN1、Gαi1、Gαi3蛋白表达或活化水平，探索影响其血管生成的具体机制。结合蛋白和转录组学技术，全面分析NTN1刺激下细胞内的基因转录和蛋白质表达的变化。在未来需重点关注NTN1-Gαi1/Gαi3参与血管新生调控的具体机制，为视网膜新生血管性疾病的治疗提供新的思路和策略。
