• 南京医科大学眼科医院, 南京 210029;
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目的 观察G蛋白抑制性α亚单位(Gαi)1和Gαi3对神经轴突导向因子-1(NTN1)诱导的信号转导和血管生成的影响,探讨其可能机制。方法 采用随机数字表法将20只6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、糖尿病组,每组各10只。糖尿病组通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病小鼠模型。造模12周后采用实时定量聚合酶链反应、蛋白质免疫印迹法检测各组小鼠视网膜中Ntn1、Gαi1、Gαi3的mRNA和蛋白相对表达量。采用随机数字表法将35只2周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常对照组、玻璃体腔注射NTN1组(NTN1组)、视网膜内皮细胞Gαi1/Gαi3特异性敲低+玻璃体腔注射NTN1组(Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组),其中正常对照组、NTN1组每组各15只,Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组5只。采用同工凝集素B4染色法观察各组小鼠视网膜新生血管形成情况。将体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分为阴性对照慢病毒组(shC组)、阴性对照慢病毒+NTN1处理组(shC+NTN1组)、Gαi1/Gαi3敲低组(shGαi1/Gαi3组)、Gαi1/Gαi3敲低+NTN1处理组(shGαi1/Gαi3+NTN1组)。采用EdU染色检测NTN1、Gαi1、Gαi3对HUVEC增殖的影响;Transwell实验测定NTN1、Gαi1、Gαi3对HUVEC迁移能力的影响;Matrigel实验检测NTN1、Gαi1、Gαi3对HUVEC管腔形成能力的影响。采用蛋白质免疫印迹法检测HUVEC中蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、核糖体蛋白S6激酶(S6K)、磷酸化S6K(p-S6K)、细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2)、磷酸化Erk1/2(p-Erk1/2)蛋白表达量。两组间比较采用t检验;三组间比较采用单因素方差分析;多因素比较采用事后Dunnett检验。结果 与正常对照组比较,糖尿病组小鼠视网膜组织中Ntn1Gαi1Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著增加,差异有统计学意义(t=11.800、9.298、10.620、7.503、3.432、8.037,P<0.000 1)。与shC组比较,shGαi1/Gαi3组HUVEC中Gαi1、Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著降低,差异有统计学意义(t=16.310、16.300、13.600、9.068,P<0.000 1)。HUVEC增殖率、迁移数量、管腔形成数量:与shC组比较,shC+NTN1组显著增加,而shGαi1/Gαi3组及shGαi1/Gαi3+NTN1组显著减少,差异均有统计学意义(F=62.750、49.830、54.900,P<0.000 1)。与正常对照组比较,Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组视网膜中Gαi1Gαi3 mRNA和蛋白相对表达量显著下降,差异有统计学意义(t=10.920、13.460、9.219、10.500,P<0.000 1)。视网膜新生血管形成面积:与正常对照组相比,NTN1组显著增加,而Gαi1/Gαi3 eKD+NTN1组显著减小,差异均有统计学意义(F=24.010,P<0.000 1)。p-Akt相对Akt、p-S6K相对S6K、p-Erk1/2相对Erk1/2蛋白相对表达量:与shC组相比,shC+NTN1组显著增加,而shGαi1/Gαi3组及shGαi1/Gαi3+NTN1组显著降低,差异均有统计学意义(F=78.610、144.400、77.010,P<0.000 1)。结论 NTN1诱导Gαi1/Gαi3介导下游Akt-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和Erk1/2的激活,从而在体内和体外环境中促进血管生成。敲低Gαi1/Gαi3能够显著减少NTN1诱导的血管生成效应。