由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（COVID-19）是一种严重的疾病[1-2]。SARS-COV-2感染后会促进炎症反应，引起高凝状态，导致多种全身并发症，其入侵视网膜可引起视网膜炎症及其一系列眼部并发症，如结膜炎、视网膜出血、视网膜静脉阻塞、急性黄斑神经视网膜病变（AMN）等[3-6]。AMN是一种多发生于年轻、健康女性的较为罕见的视网膜疾病，其主要症状为患者眼部骤然出现1个或多个旁中心暗点，视力正常或轻度下降，黄斑区损伤较大的患者，可导致视力暂时或永久性下降[7]。AMN诱发因素包括口服避孕药、呼吸系统损伤、流感样疾病和咖啡因摄入等[8-9]。SARS-CoV-2感染和疫苗接种对AMN发生和发展可能具有一定影响[10-12]。SARS-CoV-2通过尖峰（S）蛋白与其受体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合的方式侵入眼部[13-14]。AMN患者视网膜敏感度降低的区域内，光感受器结构优先破坏，提示视网膜光感受器损伤与AMN发病机制相关[15]。然而，目前关于SARS-CoV-2在视网膜光感受器的研究鲜见报道。本研究通过体外细胞实验分析SARS-CoV-2在对小鼠光感受器细胞（661w细胞）细胞形态、增殖、凋亡、周期及免疫功能的作用，并初步探讨SARS-CoV-2引发AMN的潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
小鼠光感受器细胞细胞株（661w细胞，上海通派生物科技有限公司）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，L540KJ）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）（美国Gibco公司）；兔抗小鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α多克隆抗体（ab307164）、兔抗小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体（ab32503）（英国Abcam公司）；兔抗小鼠白细胞介素（IL）-6多克隆抗体、小鼠抗小鼠B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）单克隆抗体、兔抗小鼠β-肌动蛋白（actin）、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G二抗、山羊抗小鼠IgG二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG二抗、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽（40735ES75）、细胞凋亡及周期试剂盒（40302E）（上海翌圣生物科技股份有限公司）；兔抗小鼠ACE2单克隆抗体（PA5-47488，美国Thermo Fisher公司）；Triton X-100（上海生工生物工程股份有限公司）；ACE2 siRNA过表达慢病毒（siACE2）（上海吉凯公司）；SARS-CoV-2假病毒（PSV005，北京依翘神州生物技术公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，美国Selleck公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（北京兰杰柯科技有限公司）；DMEM高糖完全培养基、胰蛋白酶、20倍洗膜缓冲液（TBST）（北京索莱宝科技有限公司）；酶联免疫检测仪（ELX800，美国Bio-Teck公司）。正置光学显微镜（日本Olympus公司）；iQ5实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）仪、细胞流式检测仪（美国Thermo Fisher公司）；FV3000型激光扫描共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 方法
细胞培养和分组。661w细胞株置于含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，37℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养至贴壁，取对数生长期细胞用于实验。将661w细胞分为三组，分别为正常组（未经任何处理）、siACE2组（过表达ACE2且未感染假病毒）及感染组（过表达ACE2并感染假病毒），其中感染组分为5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组、30 TU/ml 假病毒组、50 TU/ml假病毒组分别诱导12、24、48、72 h。
构建siACE2过表达光感受器细胞。应用DMEM高糖完全培养基培养661w细胞，在37℃且含5% CO2的细胞培养箱中培养至贴壁。以1×104个/ml细胞密度接种于24孔板中，细胞贴壁后，加入1×108 TU/ml siACE2转染8 h，更换完全培养基，继续培养48～72 h，细胞密度达到70%～80%时，0.25%不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min，完全培养基重悬细胞，以1×105个661w细胞的密度接种于12孔板中，培养至贴壁后，更换含有3 μg/ml Puromycin的DMED完全培养基继续培养48 h，将ACE2过表达的661w细胞进行扩增及冻存保种。
激光共聚焦显微镜检测ACE2转染效率。将siACE2转染后的细胞5×103个/ml密度接种于共聚焦细胞培养皿中培养；细胞培养至50%后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，10 min/次；0.5% Triton X-100中孵育30 min，2%牛血清白蛋白封闭，室温静置1 h。加入兔抗小鼠ACE2一抗（1:500），4 ℃过夜孵育，PBS漂洗3次；加入羊抗小鼠IgG抗体（1:1 000），室温孵育2 h，PBS漂洗3次，DAPI封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
光学显微镜拍照观察各组细胞形态变化。细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，培养至细胞贴壁后，分别于假病毒诱导12、24、48、72 h，光学显微镜下观察细胞形态并采集图像。
CCK-8法检测siACE组及感染组细胞活性。各组细胞以1×104个/ml密度接种于96孔板中，分别于假病毒诱导12、24、48、72 h，每孔滴加10 μl CCK-8试剂孵育1 h，酶链免疫检测仪测量波长450 nm处吸光度［A，旧称光密度（OD）］值，每组设3个复孔，实验重复3次。计算不同病毒感染浓度及不同感染时间的细胞存活率，统计细胞增殖情况。细胞存活率=[A（感染）－A（空白）/A（对照）－A（空白）)]×100%。
流式细胞仪检测siACE组及感染细胞凋亡情况。各组细胞以5×104个/ml的密度接种于24孔板中，细胞贴壁后对各组细胞进行处理。假病毒诱导12、24、48、72 h。0.25%无EDTA胰蛋白酶消化细胞，300 g离心5 min，加入膜联蛋白（Annexin） V-FITC探针混匀，室温避光孵育20min，加入碘化丙啶（PI）染色液混匀，冰浴避光孵育15 min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并使用 BDFACSuite软件进行分析。凋亡指数=（早期凋亡细胞数量+晚期凋亡细胞数量）/总细胞数量。
流式细胞仪检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞周期。siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞以1×105个/ml的密度接种于24孔板中，假病毒诱导72 h，0.25%胰蛋白酶消化，加入预冷70%乙醇重悬细胞，4 ℃甲醛固定过夜，加入10 μl RNase A、10 μl PI，37°C下避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞内白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白相对表达量。siACE组、30 TU/ml假病毒组以1×105个/ml细胞密度接种于6孔板中，假病毒诱导72 h，提取各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入30～50 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，一抗IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、ACE2、β-actin（1∶1 000） 4℃过夜孵育（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST洗膜10 min，重复5次；加入化学发光剂，暗室显影成像。采用Image J Program软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与β-actin 条带的比值代表蛋白的相对表达水平。
qPCR检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax、核因子（NF）激活的B细胞κ-轻链增强亚基（NF-kb）1、NF-kb2以及NF- kB增强子（P65）、前体蛋白（P100）mRNA相对表达量。siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞假病毒感染72 h，加入Trizol溶液裂解细胞；加入1/5总体积氯仿，充分混合并离心；将上层水相移至新管并加入等体积的异丙醇溶液，12000r/min低温离心10 min，移除上清液后加入无水乙醇再次低温离心，倒出上清液，室温放置干燥30 min，加入20 μl RNAse-free水，吹打溶解，提取各组细胞RNA，酶标仪检测RNA浓度及纯度；384孔板中依此加入2.5 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，加样全程在冰上避光操作。以离心半径7 cm、12 000 r/min离心10 min。引物序列由擎科生物公司提供（表1）。反应条件：50℃反应2 min，95℃变性10 min（1个循环）；95℃变性15 s（40个循环）；55℃扩增30 s；95℃反应15 s；60℃反应15 s，95℃ 反应15 s。置于qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以β-actin为阳性对照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
表1
引物序列
采用GraphPad Prism v9.1.0.221软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义
2 结果
2.1 siACE2成功转染至661w细胞
荧光显微镜观察结果显示，转染siACE2 48 h后，661w细胞中ACE2转染效率＞90%（图1A）。Western blot检测结果显示，与正常组比较，siACE组细胞中ACE2蛋白相对表达量显著增加，差异有统计学意义（t=18.55，P＜0.01）（图1B，1C）。
图1
siACE2转染效率验证（n=3） 1A示661w细胞荧光显微镜像（DAPI，标尺：100 μm ），转染siACE2 48 h后，ACE2转染效率＞90%；1B示电泳图；1C示正常组、siACE组细胞中ACE2蛋白相对表达量比较（n=3） ****P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；actin：肌动蛋白；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2过表达慢病毒；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；正常组：661w细胞常规培养；siACE组：661w细胞转染siACE2
2.2 siACE组及感染组假病毒不同感染时间细胞形态
SiACE2组细胞呈细长纤维状，细胞形态清晰、成簇或平行排列（图2A～2D）；感染组细胞均出现不同程度皱缩（图2E～2T）。与siACE组比较，5 TU/ml 假病毒组、15 TU/ml假病毒组细胞随假病毒感染时间增加，细胞形态无明显改变（图2E～2L）；72 h时，15 TU/ml 假病毒组细胞数量无明显改变（图2I～2L），部分细胞形态趋于圆形（图2L）。30 TU/ml 假病毒组细胞形态随假病毒诱导时间延长发生明显改变；12h、24h时，细胞形态无明显改变，48 h时，部分细胞形态出现皱缩，72 h时，细胞严重皱缩，形态趋于圆形（图2M～2P）。50 TU/ml 假病毒组细胞假病毒诱导24 h时出现皱缩，随时间延长逐渐严重，形态趋于圆形；72 h时，细胞数量减少（图2Q～2T）。
图2
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞正置光学显微镜像（标尺：200 μm） 2A～2D、2E～2H、2I～2L、2M～2P、2Q～2T分别示siACE2组、5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组、30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组细胞假病毒诱导12 、24、48、72 h。siACE2组细胞呈细长纤维状，细胞形态清晰、成簇或平行排列；感染组细胞均出现不同程度皱缩，随假病毒转染浓度、时间增加，细胞皱缩加剧，数量减少 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w细胞转染siACE2后，分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导12、24、48、72h
2.3 661w细胞存活率随假病毒浓度增加、诱导时间延长而降低
与siACE2组比较，感染组低浓度组（5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组）细胞诱导12、24、48、72 h后细胞存活率出现下调，差异无统计学意义（F=0.8395、0.4118、1.498、1.138，P＞0.05），感染组高浓度组（30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组）诱导12、24、48、72 h较siACE2组细胞存活率均降低，差异有统计学意义（F=3.304、4.772、9.629、13.22，P＜0.05、0.01、0.01、0.01），而30 TU/ml假病毒组与50 TU/ml假病毒组诱导12、24、72 h比较，无显著差异（t=3.113、2.030、1.787，P＞0.05），但诱导48 h后，50 TU/ml假病毒组较30 TU/ml假病毒组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=4.733，P＜0.01）（图3），表明SARS-CoV-2假病毒感染可抑制光感受器细胞的增殖能力。
图3
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞存活率比较（n=3） *P＜0.05，** P＜0.01，661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w细胞转染siACE2后，再分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导12、24、48、72 h
2.4 661w细胞凋亡指数随SARS-CoV-2假病毒浓度、诱导时间增加而升高
与siACE2组比较，感染组细胞凋亡指数随假病毒诱导时间延长逐渐升高，差异均有统计学意义（F=2.523、6.716、3.477、3.421，P＜0.05、0.05、0.01、0.01）。与siACE2组比较，5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组细胞诱导12、24、48、72h后，细胞凋亡指数上调，差异无统计学意义（F=9.185、6.352、6.268、8.419，P＞0.05）；与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组细胞凋亡指数显著升高，差异有统计学意义（F=3.169、6.575、12.44、14.87，P＜0.05、0.05、0.01、0.01）；而30 TU/ml假病毒组与50 TU/ml假病毒组诱导12、24、72 h比较，无显著差异（t=0.277、0.9363、2.769，P＞0.05），但诱导48 h后，50 TU/ml假病毒组较30 TU/ml假病毒组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=1.394，P＜0.05）（图4），表明SARS-CoV-2假病毒感染可促进光感受器细胞发生凋亡。
图4
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞凋亡指数比较（n=3） *P＜0.05，****P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w转染siACE2后，再分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导
2.5 假病毒诱导使661w细胞周期阻滞于G1期
假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组G1期细胞显著增加，差异有统计学意义（t=3.812，P＜0.05）（图5）。
图5
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h促使661w细胞周期阻滞于G1期（n=3） 5A、5B分别示siACE组、30 TU/ml假病毒组流式细胞仪检测像；5C示siACE2组、30 TU/ml假病毒组细胞周期G1期比较，P＜0.05 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72 h
2.6 SARS-CoV-2上调661w细胞免疫相关因子、诱导调节凋亡相关因子蛋白及mRNA表达水平
qPCR、Western blot检测结果显示，假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bax蛋白和mRNA相对表达量均上调（t=7.601、6.039、3.088、5.193、6.427、7.667），Bcl-2蛋白和mRNA相对表达量下调（t=3.614、6.777），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h促进661w细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达水平（n=3） 6A示电泳图；6B、6C分别示siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax蛋白、mRNA相对表达量比较，*P＜0.05，**P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w细胞转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72h
2.7 SARS-CoV-2假病毒诱导661w细胞NF-kb1、NF-kb2、P65、P100 mRNA的表达水平
qPCR检测结果显示，假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组细胞中NF-kB信号通路相关分子Nf-kb1、Nf-kb2、P65、P100 mRNA相对表达量明显升高，差异均有统计学意义（t=3.550、3.074、3.307、4.218，P＜0.05）（图7）。
图7
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h siACE2组、30 TU/ml假病毒组661w细胞中NF-kB1、NF-kB2、P65、P100 mRNA相对表达量比较（n=3）*P＜0.05，**P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；NF-kB1：核因子激活的B细胞的κ-轻链增强亚基 1；NF-kB2：核因子激活的B细胞的κ-轻链增强亚基 2；P65：NF- kB增强子；P100：NF- kB前体蛋白；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w细胞转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72h
3 讨论
血管系统是AMN的中心部位，血管系统损伤是AMN患者视觉功能障碍的关键[16]。研究报道，AMN患者光感受器椭圆体带发生缺陷，视网膜外核层、光感受器外节变薄，外层视网膜局部出现强反射，并发展为退行性变化[15, 17]。而在COVID-19引起的AMN患者中也发现视网膜光感受器损伤[18]。Menuchin-Lasowski等[19]利用SARS-CoV-2感染视网膜类器官，在其光感受器细胞中优先检测到SARS-COV-2病毒S蛋白，并诱发光感受器细胞炎症；使用SARS-CoV-2假病毒对小鼠人源性ACE2（hACE2）光感受器感染2 、5、7 d后，小鼠视网膜中SARS-CoV-2 Sipke蛋白表达水平随感染时间逐渐升高，且SARS-CoV-2 Sipke蛋白最先出现在视锥、视杆细胞中。
ACE2是SARS-CoV-2进入宿主细胞的重要受体，SARS-CoV-2主要由S蛋白介导，S蛋白与宿主受体ACE2结合进入宿主细胞[3]。因此，为探究SARS-CoV-2病毒感染对光感受器的影响及分子调控机制，本研究建立了可感染SARS-CoV-2假病毒的ACE2过表达小鼠光感受器细胞株，并利用SARS-CoV-2假病毒感染661w细胞。结果显示，不同浓度感染组的细胞形态随时间的增加由细长纤维状的正常形态变为圆形，并出现明显皱缩；不同浓度感染组细胞的增殖能力较siACE2组显著降低。有文献报道，SARS-CoV-2病毒可诱导小胶质细胞及视锥细胞发生凋亡，在视网膜变性进展中发挥重要作用[20]。本研究结果显示，SARS-CoV-2感染661w细胞后，感染组细胞凋亡指数较siACE2组显著增加，这表明SARS-CoV-2病毒感染可促进视网膜光感受器细胞发生凋亡。Western blot及qPCR检测结果证实，30 TU/ml假病毒感染72 h时，661w细胞中促凋亡因子Bax蛋白、mRNA表达水平较siACE2组显著上调，而抑制凋亡因子Bcl-2蛋白、mRNA表达水平较siACE2组显著下调。因此，推测SARS-CoV-2感染诱导光感受器细胞凋亡可能是AMN的潜在发病机制之一。
研究表明，SARS-CoV-2诱导的过度炎症反应是患病严重程度和死亡的主要原因。COVID-19住院患者血清炎症因子表达水平，如IL-6、TNF-α、IL-1β显著升高，表达程度与疾病严重程度呈正相关[21]。文献报道，SARS-CoV-2感染k18-hACE2转基因小鼠，发现SARS-CoV-2可破坏血视网膜屏障进而侵入视网膜，并诱导视网膜发生过度炎症反应，影响视网膜免疫应答功能[22]。因此，为进一步探究SARS-CoV-2病毒感染对光感受器细胞免疫应答功能的影响，本研究分析了SARS-CoV-2假病毒感染的小鼠光感受器细胞中免疫相关因子IL-6、TNF-α的表达，结果显示，30 TU/ml假病毒感染72 h时，661w细胞中的IL-6、TNF-α的蛋白及mRNA表达水平较siACE2组显著升高，这提示SARS-CoV-2病毒感染可通过促进光感受器细胞中炎症因子表达参与AMN进展中的免疫应答反应。
NF-kB信号通路是调控细胞凋亡及免疫应答的重要信号通路之一[23]。既往研究发现，SARS-CoV-2病毒感染会导致细胞发生程序性细胞死亡，并调节NF-κB信号通路，使促炎因子表达水平上调，进而导致细胞免疫应答障碍[24-25]。为进一步探究SARS-CoV-2病毒感染影响光感受器的增殖、凋亡及免疫应答反应的分子调控机制，本研究检测了SARS-CoV-2感染的光感受器细胞中NF-kB信号通路相关分子的表达情况。结果显示，30 TU/ml假病毒组感染72 h，661w细胞中NF-kB信号通路相关分子NF-kb1、NF-kb2、P65、P100 mRNA表达水平较siACE2组均显著升高，提示SARS-CoV-2感染的光感受器细胞中NF-kB通路被激活，推测SARS-CoV-2病毒感染可能通过激活光感受器细胞中NF-kB信号通路，进而抑制光感受器细胞增殖、促进细胞凋亡及免疫相关因子表达。此外，有研究发现，与SARS-CoV-2结合的ACE2受体在人类视觉系统和中枢神经系统中表达，而中枢神经系统的功能障碍可对视网膜功能产生影响[26-27]。通过比较SARS-CoV-2感染后患者的脑部组织和视网膜组织中的基因，发现NF-kB通路被激活并诱导细胞凋亡、免疫相关基因富集到视网膜器官组织中，抑制视网膜中T细胞活化，从而导致视网膜结构或功能发生改变[28-29]，这也进一步支持本研究结果。
SARS-CoV-2感染可能通过激活NF-kB信号通路，抑制光感受器细胞增殖、促进细胞凋亡及阻滞细胞周期，导致视网膜光感受器细胞结构和免疫功能异常，进而诱发AMN发生。本研究旨在为SARS-CoV-2病毒感染诱发AMN发生的病理机制提供理论依据，未来拟进一步利用hACE2转基因小鼠，探究SARS-CoV-2病毒感染对小鼠视网膜功能及视网膜光感受器的影响，揭示SARS-CoV-2感染后NF-kB信号通路调控光感受器细胞功能的关键分子机制，为临床预防与治疗SARS-CoV-2感染引起的AMN奠定理论基础。
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的新型冠状病毒感染（COVID-19）是一种严重的疾病[1-2]。SARS-COV-2感染后会促进炎症反应，引起高凝状态，导致多种全身并发症，其入侵视网膜可引起视网膜炎症及其一系列眼部并发症，如结膜炎、视网膜出血、视网膜静脉阻塞、急性黄斑神经视网膜病变（AMN）等[3-6]。AMN是一种多发生于年轻、健康女性的较为罕见的视网膜疾病，其主要症状为患者眼部骤然出现1个或多个旁中心暗点，视力正常或轻度下降，黄斑区损伤较大的患者，可导致视力暂时或永久性下降[7]。AMN诱发因素包括口服避孕药、呼吸系统损伤、流感样疾病和咖啡因摄入等[8-9]。SARS-CoV-2感染和疫苗接种对AMN发生和发展可能具有一定影响[10-12]。SARS-CoV-2通过尖峰（S）蛋白与其受体血管紧张素转化酶2（ACE2）结合的方式侵入眼部[13-14]。AMN患者视网膜敏感度降低的区域内，光感受器结构优先破坏，提示视网膜光感受器损伤与AMN发病机制相关[15]。然而，目前关于SARS-CoV-2在视网膜光感受器的研究鲜见报道。本研究通过体外细胞实验分析SARS-CoV-2在对小鼠光感受器细胞（661w细胞）细胞形态、增殖、凋亡、周期及免疫功能的作用，并初步探讨SARS-CoV-2引发AMN的潜在机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
小鼠光感受器细胞细胞株（661w细胞，上海通派生物科技有限公司）；Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，L540KJ）、4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，C0065）（美国Gibco公司）；兔抗小鼠肿瘤坏死因子（TNF）-α多克隆抗体（ab307164）、兔抗小鼠Bcl-2相关X蛋白（Bax）单克隆抗体（ab32503）（英国Abcam公司）；兔抗小鼠白细胞介素（IL）-6多克隆抗体、小鼠抗小鼠B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）单克隆抗体、兔抗小鼠β-肌动蛋白（actin）、山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G二抗、山羊抗小鼠IgG二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；Alexa Fluor 594山羊抗兔IgG二抗、异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鬼笔环肽（40735ES75）、细胞凋亡及周期试剂盒（40302E）（上海翌圣生物科技股份有限公司）；兔抗小鼠ACE2单克隆抗体（PA5-47488，美国Thermo Fisher公司）；Triton X-100（上海生工生物工程股份有限公司）；ACE2 siRNA过表达慢病毒（siACE2）（上海吉凯公司）；SARS-CoV-2假病毒（PSV005，北京依翘神州生物技术公司）；细胞计数试剂盒8（CCK-8，美国Selleck公司）；磷酸盐缓冲液（PBS）（北京兰杰柯科技有限公司）；DMEM高糖完全培养基、胰蛋白酶、20倍洗膜缓冲液（TBST）（北京索莱宝科技有限公司）；酶联免疫检测仪（ELX800，美国Bio-Teck公司）。正置光学显微镜（日本Olympus公司）；iQ5实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）仪、细胞流式检测仪（美国Thermo Fisher公司）；FV3000型激光扫描共聚焦显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 方法
细胞培养和分组。661w细胞株置于含10%胎牛血清和1%双抗（青霉素/链霉素）的DMEM培养基，37℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养至贴壁，取对数生长期细胞用于实验。将661w细胞分为三组，分别为正常组（未经任何处理）、siACE2组（过表达ACE2且未感染假病毒）及感染组（过表达ACE2并感染假病毒），其中感染组分为5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组、30 TU/ml 假病毒组、50 TU/ml假病毒组分别诱导12、24、48、72 h。
构建siACE2过表达光感受器细胞。应用DMEM高糖完全培养基培养661w细胞，在37℃且含5% CO2的细胞培养箱中培养至贴壁。以1×104个/ml细胞密度接种于24孔板中，细胞贴壁后，加入1×108 TU/ml siACE2转染8 h，更换完全培养基，继续培养48～72 h，细胞密度达到70%～80%时，0.25%不含乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化细胞，1 200 r/min离心5 min，完全培养基重悬细胞，以1×105个661w细胞的密度接种于12孔板中，培养至贴壁后，更换含有3 μg/ml Puromycin的DMED完全培养基继续培养48 h，将ACE2过表达的661w细胞进行扩增及冻存保种。
激光共聚焦显微镜检测ACE2转染效率。将siACE2转染后的细胞5×103个/ml密度接种于共聚焦细胞培养皿中培养；细胞培养至50%后，4%多聚甲醛固定30 min，PBS漂洗3次，10 min/次；0.5% Triton X-100中孵育30 min，2%牛血清白蛋白封闭，室温静置1 h。加入兔抗小鼠ACE2一抗（1:500），4 ℃过夜孵育，PBS漂洗3次；加入羊抗小鼠IgG抗体（1:1 000），室温孵育2 h，PBS漂洗3次，DAPI封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察拍照。
光学显微镜拍照观察各组细胞形态变化。细胞以1×105个/ml的密度接种于6孔板中，培养至细胞贴壁后，分别于假病毒诱导12、24、48、72 h，光学显微镜下观察细胞形态并采集图像。
CCK-8法检测siACE组及感染组细胞活性。各组细胞以1×104个/ml密度接种于96孔板中，分别于假病毒诱导12、24、48、72 h，每孔滴加10 μl CCK-8试剂孵育1 h，酶链免疫检测仪测量波长450 nm处吸光度［A，旧称光密度（OD）］值，每组设3个复孔，实验重复3次。计算不同病毒感染浓度及不同感染时间的细胞存活率，统计细胞增殖情况。细胞存活率=[A（感染）－A（空白）/A（对照）－A（空白）)]×100%。
流式细胞仪检测siACE组及感染细胞凋亡情况。各组细胞以5×104个/ml的密度接种于24孔板中，细胞贴壁后对各组细胞进行处理。假病毒诱导12、24、48、72 h。0.25%无EDTA胰蛋白酶消化细胞，300 g离心5 min，加入膜联蛋白（Annexin） V-FITC探针混匀，室温避光孵育20min，加入碘化丙啶（PI）染色液混匀，冰浴避光孵育15 min。流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并使用 BDFACSuite软件进行分析。凋亡指数=（早期凋亡细胞数量+晚期凋亡细胞数量）/总细胞数量。
流式细胞仪检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞周期。siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞以1×105个/ml的密度接种于24孔板中，假病毒诱导72 h，0.25%胰蛋白酶消化，加入预冷70%乙醇重悬细胞，4 ℃甲醛固定过夜，加入10 μl RNase A、10 μl PI，37°C下避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞周期。
蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞内白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）蛋白相对表达量。siACE组、30 TU/ml假病毒组以1×105个/ml细胞密度接种于6孔板中，假病毒诱导72 h，提取各组细胞总蛋白，调整蛋白浓度。每个样孔加入30～50 μg待测样品，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中上样电泳；80 V恒压0.5 h，样品进入分离胶后100 V恒压2 h，300 mA转膜2 h，5%脱脂牛奶常温封闭2 h，一抗IL-6、TNF-α、Bax、Bcl-2、ACE2、β-actin（1∶1 000） 4℃过夜孵育（β-actin作为阳性对照），TBST洗膜10 min，重复3次；加入辣根过氧化物偶联的二抗（1∶5 000），37℃孵育2 h，TBST洗膜10 min，重复5次；加入化学发光剂，暗室显影成像。采用Image J Program软件分析蛋白条带灰度值，以目的条带与β-actin 条带的比值代表蛋白的相对表达水平。
qPCR检测siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax、核因子（NF）激活的B细胞κ-轻链增强亚基（NF-kb）1、NF-kb2以及NF- kB增强子（P65）、前体蛋白（P100）mRNA相对表达量。siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞假病毒感染72 h，加入Trizol溶液裂解细胞；加入1/5总体积氯仿，充分混合并离心；将上层水相移至新管并加入等体积的异丙醇溶液，12000r/min低温离心10 min，移除上清液后加入无水乙醇再次低温离心，倒出上清液，室温放置干燥30 min，加入20 μl RNAse-free水，吹打溶解，提取各组细胞RNA，酶标仪检测RNA浓度及纯度；384孔板中依此加入2.5 µl cDNA、1 µl正向引物、1 µl反向引物和4 µl SYBR混合，加样全程在冰上避光操作。以离心半径7 cm、12 000 r/min离心10 min。引物序列由擎科生物公司提供（表1）。反应条件：50℃反应2 min，95℃变性10 min（1个循环）；95℃变性15 s（40个循环）；55℃扩增30 s；95℃反应15 s；60℃反应15 s，95℃ 反应15 s。置于qPCR仪中进行扩增并输出循环阈值（Ct值），以β-actin为阳性对照，依照公式2-ΔΔCt计算mRNA相对表达量。
表1
引物序列
采用GraphPad Prism v9.1.0.221软件进行统计学分析。计量数据以均数±标准差（x±s）表示。多组间比较采用单因素方差分析；两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义
2 结果
2.1 siACE2成功转染至661w细胞
荧光显微镜观察结果显示，转染siACE2 48 h后，661w细胞中ACE2转染效率＞90%（图1A）。Western blot检测结果显示，与正常组比较，siACE组细胞中ACE2蛋白相对表达量显著增加，差异有统计学意义（t=18.55，P＜0.01）（图1B，1C）。
图1
siACE2转染效率验证（n=3） 1A示661w细胞荧光显微镜像（DAPI，标尺：100 μm ），转染siACE2 48 h后，ACE2转染效率＞90%；1B示电泳图；1C示正常组、siACE组细胞中ACE2蛋白相对表达量比较（n=3） ****P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；actin：肌动蛋白；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2过表达慢病毒；DAPI：4'，6-二脒基-2-苯基吲哚；正常组：661w细胞常规培养；siACE组：661w细胞转染siACE2
2.2 siACE组及感染组假病毒不同感染时间细胞形态
SiACE2组细胞呈细长纤维状，细胞形态清晰、成簇或平行排列（图2A～2D）；感染组细胞均出现不同程度皱缩（图2E～2T）。与siACE组比较，5 TU/ml 假病毒组、15 TU/ml假病毒组细胞随假病毒感染时间增加，细胞形态无明显改变（图2E～2L）；72 h时，15 TU/ml 假病毒组细胞数量无明显改变（图2I～2L），部分细胞形态趋于圆形（图2L）。30 TU/ml 假病毒组细胞形态随假病毒诱导时间延长发生明显改变；12h、24h时，细胞形态无明显改变，48 h时，部分细胞形态出现皱缩，72 h时，细胞严重皱缩，形态趋于圆形（图2M～2P）。50 TU/ml 假病毒组细胞假病毒诱导24 h时出现皱缩，随时间延长逐渐严重，形态趋于圆形；72 h时，细胞数量减少（图2Q～2T）。
图2
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞正置光学显微镜像（标尺：200 μm） 2A～2D、2E～2H、2I～2L、2M～2P、2Q～2T分别示siACE2组、5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组、30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组细胞假病毒诱导12 、24、48、72 h。siACE2组细胞呈细长纤维状，细胞形态清晰、成簇或平行排列；感染组细胞均出现不同程度皱缩，随假病毒转染浓度、时间增加，细胞皱缩加剧，数量减少 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w细胞转染siACE2后，分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导12、24、48、72h
2.3 661w细胞存活率随假病毒浓度增加、诱导时间延长而降低
与siACE2组比较，感染组低浓度组（5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组）细胞诱导12、24、48、72 h后细胞存活率出现下调，差异无统计学意义（F=0.8395、0.4118、1.498、1.138，P＞0.05），感染组高浓度组（30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组）诱导12、24、48、72 h较siACE2组细胞存活率均降低，差异有统计学意义（F=3.304、4.772、9.629、13.22，P＜0.05、0.01、0.01、0.01），而30 TU/ml假病毒组与50 TU/ml假病毒组诱导12、24、72 h比较，无显著差异（t=3.113、2.030、1.787，P＞0.05），但诱导48 h后，50 TU/ml假病毒组较30 TU/ml假病毒组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=4.733，P＜0.01）（图3），表明SARS-CoV-2假病毒感染可抑制光感受器细胞的增殖能力。
图3
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞存活率比较（n=3） *P＜0.05，** P＜0.01，661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w细胞转染siACE2后，再分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导12、24、48、72 h
2.4 661w细胞凋亡指数随SARS-CoV-2假病毒浓度、诱导时间增加而升高
与siACE2组比较，感染组细胞凋亡指数随假病毒诱导时间延长逐渐升高，差异均有统计学意义（F=2.523、6.716、3.477、3.421，P＜0.05、0.05、0.01、0.01）。与siACE2组比较，5 TU/ml假病毒组、15 TU/ml假病毒组细胞诱导12、24、48、72h后，细胞凋亡指数上调，差异无统计学意义（F=9.185、6.352、6.268、8.419，P＞0.05）；与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组、50 TU/ml假病毒组细胞凋亡指数显著升高，差异有统计学意义（F=3.169、6.575、12.44、14.87，P＜0.05、0.05、0.01、0.01）；而30 TU/ml假病毒组与50 TU/ml假病毒组诱导12、24、72 h比较，无显著差异（t=0.277、0.9363、2.769，P＞0.05），但诱导48 h后，50 TU/ml假病毒组较30 TU/ml假病毒组细胞存活率明显降低，差异有统计学意义（t=1.394，P＜0.05）（图4），表明SARS-CoV-2假病毒感染可促进光感受器细胞发生凋亡。
图4
SARS-CoV-2假病毒不同诱导时间siACE2组与感染组细胞凋亡指数比较（n=3） *P＜0.05，****P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；感染组：661w转染siACE2后，再分别加入5、15、30、50 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导
2.5 假病毒诱导使661w细胞周期阻滞于G1期
假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组G1期细胞显著增加，差异有统计学意义（t=3.812，P＜0.05）（图5）。
图5
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h促使661w细胞周期阻滞于G1期（n=3） 5A、5B分别示siACE组、30 TU/ml假病毒组流式细胞仪检测像；5C示siACE2组、30 TU/ml假病毒组细胞周期G1期比较，P＜0.05 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72 h
2.6 SARS-CoV-2上调661w细胞免疫相关因子、诱导调节凋亡相关因子蛋白及mRNA表达水平
qPCR、Western blot检测结果显示，假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bax蛋白和mRNA相对表达量均上调（t=7.601、6.039、3.088、5.193、6.427、7.667），Bcl-2蛋白和mRNA相对表达量下调（t=3.614、6.777），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h促进661w细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax蛋白和mRNA表达水平（n=3） 6A示电泳图；6B、6C分别示siACE组、30 TU/ml假病毒组细胞中IL-6、TNF-α、Bcl-2、Bax蛋白、mRNA相对表达量比较，*P＜0.05，**P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w细胞转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72h
2.7 SARS-CoV-2假病毒诱导661w细胞NF-kb1、NF-kb2、P65、P100 mRNA的表达水平
qPCR检测结果显示，假病毒诱导72 h时，与siACE2组比较，30 TU/ml假病毒组细胞中NF-kB信号通路相关分子Nf-kb1、Nf-kb2、P65、P100 mRNA相对表达量明显升高，差异均有统计学意义（t=3.550、3.074、3.307、4.218，P＜0.05）（图7）。
图7
SARS-CoV-2假病毒诱导72 h siACE2组、30 TU/ml假病毒组661w细胞中NF-kB1、NF-kB2、P65、P100 mRNA相对表达量比较（n=3）*P＜0.05，**P＜0.01 661w细胞：小鼠光感受器细胞；SARS-CoV-2：急性呼吸综合征冠状病毒2型；NF-kB1：核因子激活的B细胞的κ-轻链增强亚基 1；NF-kB2：核因子激活的B细胞的κ-轻链增强亚基 2；P65：NF- kB增强子；P100：NF- kB前体蛋白；ACE2：血管紧张素转化酶2；siACE2：ACE2 siRNA过表达慢病毒；siACE2组：661w细胞转染siACE2；30 TU/ml假病毒组：661w细胞转染siACE2后，加入30 TU/ml SARS-CoV-2假病毒诱导72h
3 讨论
血管系统是AMN的中心部位，血管系统损伤是AMN患者视觉功能障碍的关键[16]。研究报道，AMN患者光感受器椭圆体带发生缺陷，视网膜外核层、光感受器外节变薄，外层视网膜局部出现强反射，并发展为退行性变化[15, 17]。而在COVID-19引起的AMN患者中也发现视网膜光感受器损伤[18]。Menuchin-Lasowski等[19]利用SARS-CoV-2感染视网膜类器官，在其光感受器细胞中优先检测到SARS-COV-2病毒S蛋白，并诱发光感受器细胞炎症；使用SARS-CoV-2假病毒对小鼠人源性ACE2（hACE2）光感受器感染2 、5、7 d后，小鼠视网膜中SARS-CoV-2 Sipke蛋白表达水平随感染时间逐渐升高，且SARS-CoV-2 Sipke蛋白最先出现在视锥、视杆细胞中。
ACE2是SARS-CoV-2进入宿主细胞的重要受体，SARS-CoV-2主要由S蛋白介导，S蛋白与宿主受体ACE2结合进入宿主细胞[3]。因此，为探究SARS-CoV-2病毒感染对光感受器的影响及分子调控机制，本研究建立了可感染SARS-CoV-2假病毒的ACE2过表达小鼠光感受器细胞株，并利用SARS-CoV-2假病毒感染661w细胞。结果显示，不同浓度感染组的细胞形态随时间的增加由细长纤维状的正常形态变为圆形，并出现明显皱缩；不同浓度感染组细胞的增殖能力较siACE2组显著降低。有文献报道，SARS-CoV-2病毒可诱导小胶质细胞及视锥细胞发生凋亡，在视网膜变性进展中发挥重要作用[20]。本研究结果显示，SARS-CoV-2感染661w细胞后，感染组细胞凋亡指数较siACE2组显著增加，这表明SARS-CoV-2病毒感染可促进视网膜光感受器细胞发生凋亡。Western blot及qPCR检测结果证实，30 TU/ml假病毒感染72 h时，661w细胞中促凋亡因子Bax蛋白、mRNA表达水平较siACE2组显著上调，而抑制凋亡因子Bcl-2蛋白、mRNA表达水平较siACE2组显著下调。因此，推测SARS-CoV-2感染诱导光感受器细胞凋亡可能是AMN的潜在发病机制之一。
研究表明，SARS-CoV-2诱导的过度炎症反应是患病严重程度和死亡的主要原因。COVID-19住院患者血清炎症因子表达水平，如IL-6、TNF-α、IL-1β显著升高，表达程度与疾病严重程度呈正相关[21]。文献报道，SARS-CoV-2感染k18-hACE2转基因小鼠，发现SARS-CoV-2可破坏血视网膜屏障进而侵入视网膜，并诱导视网膜发生过度炎症反应，影响视网膜免疫应答功能[22]。因此，为进一步探究SARS-CoV-2病毒感染对光感受器细胞免疫应答功能的影响，本研究分析了SARS-CoV-2假病毒感染的小鼠光感受器细胞中免疫相关因子IL-6、TNF-α的表达，结果显示，30 TU/ml假病毒感染72 h时，661w细胞中的IL-6、TNF-α的蛋白及mRNA表达水平较siACE2组显著升高，这提示SARS-CoV-2病毒感染可通过促进光感受器细胞中炎症因子表达参与AMN进展中的免疫应答反应。
NF-kB信号通路是调控细胞凋亡及免疫应答的重要信号通路之一[23]。既往研究发现，SARS-CoV-2病毒感染会导致细胞发生程序性细胞死亡，并调节NF-κB信号通路，使促炎因子表达水平上调，进而导致细胞免疫应答障碍[24-25]。为进一步探究SARS-CoV-2病毒感染影响光感受器的增殖、凋亡及免疫应答反应的分子调控机制，本研究检测了SARS-CoV-2感染的光感受器细胞中NF-kB信号通路相关分子的表达情况。结果显示，30 TU/ml假病毒组感染72 h，661w细胞中NF-kB信号通路相关分子NF-kb1、NF-kb2、P65、P100 mRNA表达水平较siACE2组均显著升高，提示SARS-CoV-2感染的光感受器细胞中NF-kB通路被激活，推测SARS-CoV-2病毒感染可能通过激活光感受器细胞中NF-kB信号通路，进而抑制光感受器细胞增殖、促进细胞凋亡及免疫相关因子表达。此外，有研究发现，与SARS-CoV-2结合的ACE2受体在人类视觉系统和中枢神经系统中表达，而中枢神经系统的功能障碍可对视网膜功能产生影响[26-27]。通过比较SARS-CoV-2感染后患者的脑部组织和视网膜组织中的基因，发现NF-kB通路被激活并诱导细胞凋亡、免疫相关基因富集到视网膜器官组织中，抑制视网膜中T细胞活化，从而导致视网膜结构或功能发生改变[28-29]，这也进一步支持本研究结果。
SARS-CoV-2感染可能通过激活NF-kB信号通路，抑制光感受器细胞增殖、促进细胞凋亡及阻滞细胞周期，导致视网膜光感受器细胞结构和免疫功能异常，进而诱发AMN发生。本研究旨在为SARS-CoV-2病毒感染诱发AMN发生的病理机制提供理论依据，未来拟进一步利用hACE2转基因小鼠，探究SARS-CoV-2病毒感染对小鼠视网膜功能及视网膜光感受器的影响，揭示SARS-CoV-2感染后NF-kB信号通路调控光感受器细胞功能的关键分子机制，为临床预防与治疗SARS-CoV-2感染引起的AMN奠定理论基础。
