引用本文： 宋虎平, 朱琦, 吴琼, 艾华, 雷哓琴, 朱昭亮, 杨阳. 缺氧诱导因子1α特异性小干扰RNA对髓样细胞表面黏附分子CD18及神经损伤诱导蛋白-1表达的影响. 中华眼底病杂志, 2014, 30(2): 156-160. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.02.010 复制
白细胞与视网膜血管内皮细胞黏附是糖尿病视网膜病变(DR)早期重要事件，其过程与白细胞表面黏附分子CD18表达有关[1, 2]。在早期DR的发展过程中，起关键作用的是髓样细胞的黏附[3, 4]。神经损伤诱导蛋白-1(Ninj-1)是一种新的黏附分子，在中枢神经系统炎症病灶中可特异性表达在髓样细胞表面，有可能成为中枢神经系统炎症疾病治疗的特异性靶点[5, 6]。研究表明，缺氧诱导因子1α(HIF1α)对糖尿病状态下中性粒细胞表面黏附分子CD18的表达及白细胞与血管内皮细胞黏附有调节作用[7, 8]。但目前有关HIF1α对髓样细胞的黏附及其表面黏附分子表达的作用还少有研究。为此，我们通过小干扰(si)RNA技术，观察在早期DR条件下，HIF1α对髓样细胞表面CD18及Ninj-1表达的影响，以期为治疗早期DR寻找合适靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
2012年3~9月在西安市第四医院眼科就诊的10例1期DR患者及年龄、性别与之匹配的8例健康志愿者的血清样本纳入本研究。本研究经医院伦理委员会同意，并获得每一位受试者的知情同意。DR患者纳入标准：(1)确诊为1期DR者[9]；(2)经荧光素眼底血管造影检查证实其眼底只有少量可数的渗漏点，且没有无灌注区存在者。排除DR患者和健康志愿者中合并有全身及局部炎症病灶者。DR患者中，男性6例，女性4例；平均年龄(54.90±6.67)岁，平均空腹血糖(6.38±0.92) mmol/L。健康志愿者中，男女性各4名，平均年龄(55.10±5.33)岁，平均空腹血糖(4.88±0.75) mmol/L。DR患者和健康志愿者年龄间差异无统计学意义(F=0.01，P=0.97)，平均空腹血糖间差异有统计学意义(F=15.85，P=0.01)。
人髓样细胞系白血病细胞系(K562)及恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞系(RF/6A)(中国科学院上海细胞生物所)，pSUPER.retro空载体(美国Oligoengine公司)，LipofectamineTM2000 (美国Invitrogen公司)，鼠HIF1α抗体、藻红蛋白(PE)-标记鼠抗人IgG及CD18(美国Chemicon公司)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体(北京中杉金桥生物技术公司)，电化学发光(ECL)试剂盒(美国Pierce公司)，人Ninj-1抗体(美国Abcam公司)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)，FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.2 实验分组及转染
取对数生长期K562细胞，以无血清无抗菌素Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养24 h后分为健康人血清培养组(A组)、糖尿病血清培养组(B组)、糖尿病血清培养联合pSUPERH1-siHIF1α转染组(C组)及糖尿病血清培养联合pSUPER空载体组(D组)。A组加入10%健康志愿者血清继续培养，B、C、D组加入10%DR患者血清继续培养。C组在加入DR患者血清之前24 h先转染pSUPERH1-siHIF1α，D组在加入DR患者血清之前24 h先转染pSUPER空载体。A、B、C、D组细胞均在37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h，然后收集细胞进行下一步实验。
参照文献[10]的方法构建pSUPERH1-siHIF1α真核表达载体。HIF1α siRNA的靶序列为AAGAGG TGGATATGTCTGG(1214-1232)。化学合成64 nt的HIF 1α小发夹(shHIF1α)RNA寡核苷酸序列：正义链5′-GATCCCCAAGAGGTGGATATGTCTGGT TCAAGAGACCAGACATATCCACCTCTTTTTTT GG-3′，反义链5′-AGCTTTTCCAAAG AGGTGGATATGTCTGGTCTCTTGAACCAGACA TATCCACCTCTTGGG-3′。将shHIF1α正义链和反义链退火形成双链模板。采用Hind Ⅲ和BgⅢ双酶切pSUPER.retro质粒，将线性化pSUPER. retro质粒与退火形成的双链模板体外连接，经转化、筛选，测序并鉴定，均由北京鼎国生物技术公司完成。基因转染方法按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。
1.3 HIF1α、CD18、Ninj-1表达检测及细胞黏附实验
采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组K562细胞HIF1α蛋白表达水平。以pH 7.5的20 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1% Triton X-100、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L NaCl配置细胞裂解缓冲液。取25×106个细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解，离心，取上清液，蛋白定量。上样，凝胶电泳后，转印至聚偏二氟乙烯膜，10%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加鼠HIF1α单克隆抗体(1:500)和β-actin抗体(1 ∶500)，37 ℃孵育1 h，洗3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (1 ∶5000)，37 ℃孵育1 h，洗3次，ECL发光并照相。以β-actin为内参照。实验重复3次。采用软件Bandscan 5.0对感光胶片蛋白条带进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值代表HIF1α蛋白的表达水平。
参照文献[7]的方法，采用FACScan流式细胞仪检测各组K562细胞表面的CD18表达。取1×105个细胞，以含有0.5 μl的0.5 mg/ml鼠抗人IgG抗体的RPMI-5%胎牛血清，冰上孵育5 min，加400 μl的20 mg/ml PE标记的鼠抗人CD18抗体，冰上孵育30 min。以FACScan流式细胞仪统计1×104个细胞的荧光强度。以细胞表面CD18阳性细胞的比例为CD18表达。
参照文献[6]的方法，采用FACScan流式细胞仪检测各组K562细胞表面的Ninj-1表达。取1×105个细胞，以含有0.5 μl的20 μg/ml鼠抗人IgG抗体的RPMI-10%胎牛血清，冰上孵育15 min，加400 μl的20 μg/ml鼠抗人Ninj-1抗体，冰上孵育30 min。以FACScan流式细胞仪统计1×104个细胞的荧光强度。以细胞表面Ninj-1阳性细胞的比例为Ninj-1表达。
参照文献[7]的方法进行细胞黏附实验，检测各组K562细胞与RF/6A细胞黏附率。RF/6A细胞培养在96孔板中至融合，以1×105个/孔的细胞密度分别加入A、B、C、D组K562细胞，孵育1 h，用磷酸盐缓冲液洗去未黏附细胞，加入0.25％虎红，100 μl／孔，室温作用10 min，洗去游离虎红，加磷酸盐缓冲液洗乙醇(1 ∶1)，200 μl／孔，室温作用1 h，酶标仪检测波长570 nm处的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析处理。组间比较采用单因素方差分析；组间平均HIF1α两两比较采用最小显著差法(LSD-t)，以95%可信区间(CI)表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组K562细胞均在相对分子质量120×103处见到HIF1α蛋白表达阳性条带(图 1)。A、B、C、D组平均HIF1α蛋白表达分别为0.21±0.05、0.45±0.07、0.31±0.08、0.44±0.09，4组平均HIF1α蛋白表达比较，差异有统计学意义(F=8.90，P=0.02)。组间平均HIF1α蛋白表达两两比较，B组较A组明显升高(95%CI=-0.3~0.12，P=0.001)；C组较B组明显下降(95%CI=0.02~0.26，P=0.02)；B组与D组之间无明显差异(95%CI=-0.10~0.12，P=0.85)；C组较D组明显下降(95%CI=-0.25~0.01，P=0.03)(图 2)。
图1
各组K562细胞HIF1α蛋白表达Western blot检测像
图2
各组K562细胞中平均HIF1α蛋白表达比较
A、B、C、D组K562细胞表面平均CD18表达分别为19.81±5.02、43.42±2.96、26.19±3.16、36.16±8.84，4组平均CD18表达比较，差异有统计学意义(F=14.33，P=0.01)。组间平均CD18表达两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-32.12~-15.09，P=0.001)；C组明显低于B组(95%CI=8.71~25.74，P=0.001)和D组(95%CI=-18.48~-1.45，P=0.02)；C组与A组之间无明显差异(95%CI=-14.89~2.13，P=0.12)(图 3)。
图3
各组K562细胞表面平均CD18表达比较
A、B、C、D组K562细胞表面平均Ninj-1表达分别为17.32±3.06、48.68±4.05、47.25±5.77、44.91±5.56，4组平均Ninj-1表达比较，差异有统计学意义(F=39.38，P=0.001)。组间平均Ninj-1表达两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-38.67~-24.04，P=0.00)；C组与B组之间无明显差异(95%CI=-5.87~8.75，P=0.06)；C组与D组之间也无明显差异(95%CI=-4.97~-9.65，P=0.49)(图 4)。
图4
各组K562细胞表面平均Ninj-1表达比较
A、B、C、D组平均K562细胞与RF/6A细胞黏附率分别为0.14±0.04、0.44±0.07、0.31±0.06、0.42±0.06，4组平均K562细胞与RF16A细胞黏附率比较，差异有统计学意义(F=20.62，P=0.00)。组间平均K526细胞与RF16A细胞黏附率两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-0.39~-0.20，P=0.000)；C组较B组明显下降(95%CI=0.03~0.22，P=0.01)，较A组明显提高(95%CI=-0.26~-0.07，P=0.002)；B组与D组之间无明显差异(95%CI=-0.075~0.11，P=0.68)(图 5)。
图5
各组平均K562细胞与RF/6A细胞黏附率比较
3 讨论
研究表明，白细胞中的髓样细胞与视网膜血管内皮细胞黏附是早期DR发病中的关键因素[3, 4]。特异性抑制髓样细胞的黏附有可能成为早期DR治疗。人血液中髓样细胞包括中性粒细胞和单核细胞，但中性粒细胞是终末分化细胞，不适于体外培养研究。K562细胞是人髓系白血病细胞系，具有向髓样细胞分化潜能，因此我们选择了K562细胞作为人类循环中髓样细胞模型研究其在糖尿病状态下的黏附分子表达及其与血管内皮细胞黏附的功能。
HIF1α是重要的炎症调节因子，对炎症状态下髓样细胞黏附具有调节作用[11, 12]。但对于糖尿病状态下HIF1α对髓样细胞黏附的调节作用的研究不多。本研究结果显示，在糖尿病状态下，K562细胞中HIF1α水平升高。而HIF1α的表达水平被抑制后，K562细胞与血管内皮细胞黏附水平下降，说明HIF1α也可能参与糖尿病状态下K562细胞与血管内皮细胞的黏附。这种调节作用可能与K562细胞表面CD18表达有关。因为通过siRNA技术抑制K562细胞中的HIF1α表达后，细胞表面黏附分子CD18显著降低，与以往研究结果一致[7]。
CD18在各类白细胞表面均有表达，抗CD18治疗对一些炎症性疾病的治疗有效[13]。但其明显的副作用就是限制了抗原呈递细胞对淋巴细胞的激活[14]。以CD18为靶点抑制白细胞黏附治疗早期DR，虽然从机制上讲很吸引人，但是其广泛的白细胞抑制特点给机体自身免疫系统的抗病毒、抗细菌及抗肿瘤免疫监督功能留下很少的空间，因为大部分的免疫细胞都表达高水平的CD18 [15, 16]。本研究结果显示，当用来自DR患者的血清培养后，K562细胞表面CD18蛋白水平显著升高，K562细胞与血管内皮细胞黏附率显著升高；而抑制CD18表达水平后，K562细胞与血管内皮细胞的黏附也显著下降，说明CD18参与DR状态下髓样细胞的黏附，有可能成为治疗早期DR的靶点。
Ninj-1是一种新型黏附分子，在炎症过程中起着重要作用[17]。由于HIF1α是一种重要的转录调节因子，参与调节机体内多种炎症介质及黏附分子的合成，因此我们拟研究其对Ninj-1的调节作用。本研究结果显示，DR患者的血清可以刺激K562细胞表面Ninj-1表达水平升高。说明其有可能参与了DR状态下髓样细胞的黏附，与以往研究结果一致[18]。但HIF1α基因被干扰后，Ninj-1蛋白的表达水平并没有受到影响。说明HIF1α有可能并不参与调节K562细胞表面Ninj-1蛋白的表达。Ninj-1在正常成年大鼠脑组织中表达水平较低，但是过敏性室管膜炎情况下其表达水平显著升高，主要在单核-巨噬细胞、中性粒细胞及血管内皮细胞表面表达升高，而淋巴细胞表面几乎无表达[6]。在进一步的研究中发现，Ninj-1可特异性调节髓样细胞与血管内皮细胞的黏附，调节这些细胞通过血脑屏障进入多发性硬化及实验性过敏性室管膜炎炎症病灶周围，而对CD8+T淋巴细胞功能无显著影响。Ninj-1有可能成为治疗中枢神经系统炎症的特异性靶点[19]。
本研究结果表明，早期DR状态下，以pSUPER为载体的siHIF1α RNA可降低K562细胞表面CD18的表达，但对Ninj-1表达无明显影响。说明HIF1α及CD18有可能成为抑制早期DR髓样细胞黏附的一个非特异性靶点；Ninj-1可能参与早期DR状态下髓样细胞黏附，但其能否成为DR的特异性靶点仍需做深入研究。但由于本研究没有采用人髓样细胞作为研究对象，这可能会影响对实验结果的解释。今后研究应选择更适合的细胞模型进行DR状态下髓样细胞表面特异性黏附分子的研究。
白细胞与视网膜血管内皮细胞黏附是糖尿病视网膜病变(DR)早期重要事件，其过程与白细胞表面黏附分子CD18表达有关[1, 2]。在早期DR的发展过程中，起关键作用的是髓样细胞的黏附[3, 4]。神经损伤诱导蛋白-1(Ninj-1)是一种新的黏附分子，在中枢神经系统炎症病灶中可特异性表达在髓样细胞表面，有可能成为中枢神经系统炎症疾病治疗的特异性靶点[5, 6]。研究表明，缺氧诱导因子1α(HIF1α)对糖尿病状态下中性粒细胞表面黏附分子CD18的表达及白细胞与血管内皮细胞黏附有调节作用[7, 8]。但目前有关HIF1α对髓样细胞的黏附及其表面黏附分子表达的作用还少有研究。为此，我们通过小干扰(si)RNA技术，观察在早期DR条件下，HIF1α对髓样细胞表面CD18及Ninj-1表达的影响，以期为治疗早期DR寻找合适靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
2012年3~9月在西安市第四医院眼科就诊的10例1期DR患者及年龄、性别与之匹配的8例健康志愿者的血清样本纳入本研究。本研究经医院伦理委员会同意，并获得每一位受试者的知情同意。DR患者纳入标准：(1)确诊为1期DR者[9]；(2)经荧光素眼底血管造影检查证实其眼底只有少量可数的渗漏点，且没有无灌注区存在者。排除DR患者和健康志愿者中合并有全身及局部炎症病灶者。DR患者中，男性6例，女性4例；平均年龄(54.90±6.67)岁，平均空腹血糖(6.38±0.92) mmol/L。健康志愿者中，男女性各4名，平均年龄(55.10±5.33)岁，平均空腹血糖(4.88±0.75) mmol/L。DR患者和健康志愿者年龄间差异无统计学意义(F=0.01，P=0.97)，平均空腹血糖间差异有统计学意义(F=15.85，P=0.01)。
人髓样细胞系白血病细胞系(K562)及恒河猴视网膜脉络膜血管内皮细胞系(RF/6A)(中国科学院上海细胞生物所)，pSUPER.retro空载体(美国Oligoengine公司)，LipofectamineTM2000 (美国Invitrogen公司)，鼠HIF1α抗体、藻红蛋白(PE)-标记鼠抗人IgG及CD18(美国Chemicon公司)，β-肌动蛋白(β-actin)抗体(北京中杉金桥生物技术公司)，电化学发光(ECL)试剂盒(美国Pierce公司)，人Ninj-1抗体(美国Abcam公司)，酶标仪(美国BIO-RAD公司)，FACScan流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
1.2 实验分组及转染
取对数生长期K562细胞，以无血清无抗菌素Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养24 h后分为健康人血清培养组(A组)、糖尿病血清培养组(B组)、糖尿病血清培养联合pSUPERH1-siHIF1α转染组(C组)及糖尿病血清培养联合pSUPER空载体组(D组)。A组加入10%健康志愿者血清继续培养，B、C、D组加入10%DR患者血清继续培养。C组在加入DR患者血清之前24 h先转染pSUPERH1-siHIF1α，D组在加入DR患者血清之前24 h先转染pSUPER空载体。A、B、C、D组细胞均在37 ℃、5%CO2孵箱中继续培养24 h，然后收集细胞进行下一步实验。
参照文献[10]的方法构建pSUPERH1-siHIF1α真核表达载体。HIF1α siRNA的靶序列为AAGAGG TGGATATGTCTGG(1214-1232)。化学合成64 nt的HIF 1α小发夹(shHIF1α)RNA寡核苷酸序列：正义链5′-GATCCCCAAGAGGTGGATATGTCTGGT TCAAGAGACCAGACATATCCACCTCTTTTTTT GG-3′，反义链5′-AGCTTTTCCAAAG AGGTGGATATGTCTGGTCTCTTGAACCAGACA TATCCACCTCTTGGG-3′。将shHIF1α正义链和反义链退火形成双链模板。采用Hind Ⅲ和BgⅢ双酶切pSUPER.retro质粒，将线性化pSUPER. retro质粒与退火形成的双链模板体外连接，经转化、筛选，测序并鉴定，均由北京鼎国生物技术公司完成。基因转染方法按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行。
1.3 HIF1α、CD18、Ninj-1表达检测及细胞黏附实验
采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测各组K562细胞HIF1α蛋白表达水平。以pH 7.5的20 mmol/L羟乙基哌嗪乙硫磺酸、1% Triton X-100、1 mmol/L乙二胺四乙酸、0.1 mol/L NaCl配置细胞裂解缓冲液。取25×106个细胞，加入细胞裂解缓冲液，冰上裂解，离心，取上清液，蛋白定量。上样，凝胶电泳后，转印至聚偏二氟乙烯膜，10%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，加鼠HIF1α单克隆抗体(1:500)和β-actin抗体(1 ∶500)，37 ℃孵育1 h，洗3次，加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG (1 ∶5000)，37 ℃孵育1 h，洗3次，ECL发光并照相。以β-actin为内参照。实验重复3次。采用软件Bandscan 5.0对感光胶片蛋白条带进行灰度值分析，以目的条带与内参照条带的比值代表HIF1α蛋白的表达水平。
参照文献[7]的方法，采用FACScan流式细胞仪检测各组K562细胞表面的CD18表达。取1×105个细胞，以含有0.5 μl的0.5 mg/ml鼠抗人IgG抗体的RPMI-5%胎牛血清，冰上孵育5 min，加400 μl的20 mg/ml PE标记的鼠抗人CD18抗体，冰上孵育30 min。以FACScan流式细胞仪统计1×104个细胞的荧光强度。以细胞表面CD18阳性细胞的比例为CD18表达。
参照文献[6]的方法，采用FACScan流式细胞仪检测各组K562细胞表面的Ninj-1表达。取1×105个细胞，以含有0.5 μl的20 μg/ml鼠抗人IgG抗体的RPMI-10%胎牛血清，冰上孵育15 min，加400 μl的20 μg/ml鼠抗人Ninj-1抗体，冰上孵育30 min。以FACScan流式细胞仪统计1×104个细胞的荧光强度。以细胞表面Ninj-1阳性细胞的比例为Ninj-1表达。
参照文献[7]的方法进行细胞黏附实验，检测各组K562细胞与RF/6A细胞黏附率。RF/6A细胞培养在96孔板中至融合，以1×105个/孔的细胞密度分别加入A、B、C、D组K562细胞，孵育1 h，用磷酸盐缓冲液洗去未黏附细胞，加入0.25％虎红，100 μl／孔，室温作用10 min，洗去游离虎红，加磷酸盐缓冲液洗乙醇(1 ∶1)，200 μl／孔，室温作用1 h，酶标仪检测波长570 nm处的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。
1.4 统计学方法
采用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析处理。组间比较采用单因素方差分析；组间平均HIF1α两两比较采用最小显著差法(LSD-t)，以95%可信区间(CI)表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
各组K562细胞均在相对分子质量120×103处见到HIF1α蛋白表达阳性条带(图 1)。A、B、C、D组平均HIF1α蛋白表达分别为0.21±0.05、0.45±0.07、0.31±0.08、0.44±0.09，4组平均HIF1α蛋白表达比较，差异有统计学意义(F=8.90，P=0.02)。组间平均HIF1α蛋白表达两两比较，B组较A组明显升高(95%CI=-0.3~0.12，P=0.001)；C组较B组明显下降(95%CI=0.02~0.26，P=0.02)；B组与D组之间无明显差异(95%CI=-0.10~0.12，P=0.85)；C组较D组明显下降(95%CI=-0.25~0.01，P=0.03)(图 2)。
图1
各组K562细胞HIF1α蛋白表达Western blot检测像
图2
各组K562细胞中平均HIF1α蛋白表达比较
A、B、C、D组K562细胞表面平均CD18表达分别为19.81±5.02、43.42±2.96、26.19±3.16、36.16±8.84，4组平均CD18表达比较，差异有统计学意义(F=14.33，P=0.01)。组间平均CD18表达两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-32.12~-15.09，P=0.001)；C组明显低于B组(95%CI=8.71~25.74，P=0.001)和D组(95%CI=-18.48~-1.45，P=0.02)；C组与A组之间无明显差异(95%CI=-14.89~2.13，P=0.12)(图 3)。
图3
各组K562细胞表面平均CD18表达比较
A、B、C、D组K562细胞表面平均Ninj-1表达分别为17.32±3.06、48.68±4.05、47.25±5.77、44.91±5.56，4组平均Ninj-1表达比较，差异有统计学意义(F=39.38，P=0.001)。组间平均Ninj-1表达两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-38.67~-24.04，P=0.00)；C组与B组之间无明显差异(95%CI=-5.87~8.75，P=0.06)；C组与D组之间也无明显差异(95%CI=-4.97~-9.65，P=0.49)(图 4)。
图4
各组K562细胞表面平均Ninj-1表达比较
A、B、C、D组平均K562细胞与RF/6A细胞黏附率分别为0.14±0.04、0.44±0.07、0.31±0.06、0.42±0.06，4组平均K562细胞与RF16A细胞黏附率比较，差异有统计学意义(F=20.62，P=0.00)。组间平均K526细胞与RF16A细胞黏附率两两比较，B组明显高于A组(95%CI=-0.39~-0.20，P=0.000)；C组较B组明显下降(95%CI=0.03~0.22，P=0.01)，较A组明显提高(95%CI=-0.26~-0.07，P=0.002)；B组与D组之间无明显差异(95%CI=-0.075~0.11，P=0.68)(图 5)。
图5
各组平均K562细胞与RF/6A细胞黏附率比较
3 讨论
研究表明，白细胞中的髓样细胞与视网膜血管内皮细胞黏附是早期DR发病中的关键因素[3, 4]。特异性抑制髓样细胞的黏附有可能成为早期DR治疗。人血液中髓样细胞包括中性粒细胞和单核细胞，但中性粒细胞是终末分化细胞，不适于体外培养研究。K562细胞是人髓系白血病细胞系，具有向髓样细胞分化潜能，因此我们选择了K562细胞作为人类循环中髓样细胞模型研究其在糖尿病状态下的黏附分子表达及其与血管内皮细胞黏附的功能。
HIF1α是重要的炎症调节因子，对炎症状态下髓样细胞黏附具有调节作用[11, 12]。但对于糖尿病状态下HIF1α对髓样细胞黏附的调节作用的研究不多。本研究结果显示，在糖尿病状态下，K562细胞中HIF1α水平升高。而HIF1α的表达水平被抑制后，K562细胞与血管内皮细胞黏附水平下降，说明HIF1α也可能参与糖尿病状态下K562细胞与血管内皮细胞的黏附。这种调节作用可能与K562细胞表面CD18表达有关。因为通过siRNA技术抑制K562细胞中的HIF1α表达后，细胞表面黏附分子CD18显著降低，与以往研究结果一致[7]。
CD18在各类白细胞表面均有表达，抗CD18治疗对一些炎症性疾病的治疗有效[13]。但其明显的副作用就是限制了抗原呈递细胞对淋巴细胞的激活[14]。以CD18为靶点抑制白细胞黏附治疗早期DR，虽然从机制上讲很吸引人，但是其广泛的白细胞抑制特点给机体自身免疫系统的抗病毒、抗细菌及抗肿瘤免疫监督功能留下很少的空间，因为大部分的免疫细胞都表达高水平的CD18 [15, 16]。本研究结果显示，当用来自DR患者的血清培养后，K562细胞表面CD18蛋白水平显著升高，K562细胞与血管内皮细胞黏附率显著升高；而抑制CD18表达水平后，K562细胞与血管内皮细胞的黏附也显著下降，说明CD18参与DR状态下髓样细胞的黏附，有可能成为治疗早期DR的靶点。
Ninj-1是一种新型黏附分子，在炎症过程中起着重要作用[17]。由于HIF1α是一种重要的转录调节因子，参与调节机体内多种炎症介质及黏附分子的合成，因此我们拟研究其对Ninj-1的调节作用。本研究结果显示，DR患者的血清可以刺激K562细胞表面Ninj-1表达水平升高。说明其有可能参与了DR状态下髓样细胞的黏附，与以往研究结果一致[18]。但HIF1α基因被干扰后，Ninj-1蛋白的表达水平并没有受到影响。说明HIF1α有可能并不参与调节K562细胞表面Ninj-1蛋白的表达。Ninj-1在正常成年大鼠脑组织中表达水平较低，但是过敏性室管膜炎情况下其表达水平显著升高，主要在单核-巨噬细胞、中性粒细胞及血管内皮细胞表面表达升高，而淋巴细胞表面几乎无表达[6]。在进一步的研究中发现，Ninj-1可特异性调节髓样细胞与血管内皮细胞的黏附，调节这些细胞通过血脑屏障进入多发性硬化及实验性过敏性室管膜炎炎症病灶周围，而对CD8+T淋巴细胞功能无显著影响。Ninj-1有可能成为治疗中枢神经系统炎症的特异性靶点[19]。
本研究结果表明，早期DR状态下，以pSUPER为载体的siHIF1α RNA可降低K562细胞表面CD18的表达，但对Ninj-1表达无明显影响。说明HIF1α及CD18有可能成为抑制早期DR髓样细胞黏附的一个非特异性靶点；Ninj-1可能参与早期DR状态下髓样细胞黏附，但其能否成为DR的特异性靶点仍需做深入研究。但由于本研究没有采用人髓样细胞作为研究对象，这可能会影响对实验结果的解释。今后研究应选择更适合的细胞模型进行DR状态下髓样细胞表面特异性黏附分子的研究。
