蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子-蛋白激酶C信号通路的影响_《中华眼底病杂志》

作者：

武志鹏 ,  蔡善君 , 吕建平 , 李海辉 , 宫鑫 , 宿罡 , 汪利敏 , 王丽丽

563003 遵义医学院附属医院眼科;

关键词：

眼损伤/病理生理学视网膜色素上皮细胞凋亡光刺激

DOI：

10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.03.014

视频：

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摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

目的观察蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子(Ca²⁺)-蛋白激酶C(PKC)信号通路的影响。方法体外培养并鉴定人视网膜色素上皮(RPE)细胞,取第4代人RPE细胞随机分组进行实验。采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达,检测佛波酯(PMA)和钙磷酸结合蛋白(calphostin C)对PKC活性的影响,确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。采用20 W,波长450~500 nm医用蓝光灯作为光源,光照强度(2000±500) Lux,照射6 h,24 h后终止培养,以此制造体外培养人RPE细胞光损伤。将培养细胞随机分成5个组,即无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA组。其中,无光照组不接受光照;单纯光照组仅接受光照;光照联合硝苯地平组接受光照和0.1 mmol/L的硝苯地平;光照联合calphostin C组接受光照和100.0 nmol/L的calphostin C;光照联合PMA组接受光照和100.0 nmol/L的PMA。用乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针标记各组培养细胞,激光扫描共焦显微镜测定各组细胞内Ca²⁺浓度。比较各组细胞内Ca²⁺浓度差异。结果经鉴定,体外培养人RPE细胞成功。100.0、200.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量高于0.1、1.0、10.0、50.0 nmol/L PMA处理的RPE细胞,差异有统计学意义(F=217.537,P<0.05),但100.0、200.0 nmol/L PMA处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P=0.072)。100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞中PKC蛋白相对表达量低于5.0、25.0、50.0、75.0 nmol/L calphostin C处理的RPE细胞,差异有统计学意义(F=164.543,P<0.05),但100.0、200.0 nmol/L calphostin C处理组间PKC蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P=0.385)。蓝光照射处理后,RPE细胞的PKC活性显著升高,与未接受蓝光照射处理的RPE细胞的PKC活性比较,差异有统计学意义(t=-9.869,P<0.05)。单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合Calphostin C、光照联合PMA组的RPE细胞内Ca²⁺浓度均高于无光照组,差异有统计学意义(F=26 764.92,P<0.05);光照联合PMA组RPE细胞内Ca²⁺浓度高于单纯光照、光照联合硝苯地平及光照联合calphostin C组(P<0.05),单纯光照组高于光照联合硝苯地平和光照联合calphostin C组(P<0.05)。结论蓝光照射后人RPE细胞内PKC活性增高,Ca²⁺浓度增高。硝苯地平和calphostin C均能降低蓝光照射后人RPE细胞内Ca²⁺浓度,PMA增加细胞内Ca²⁺浓度。

引用本文： 武志鹏, 蔡善君, 吕建平, 李海辉, 宫鑫, 宿罡, 汪利敏, 王丽丽. 蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子-蛋白激酶C信号通路的影响. 中华眼底病杂志, 2014, 30(3): 284-288. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.03.014 复制

视网膜光损伤是多种玻璃体视网膜病变发生与发展的基础^[1]。近年来研究证实，视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡是视网膜光损伤的最重要机制^{[2, 3]}。蓝光诱导的RPE细胞光损伤即是通过细胞凋亡的机制发生的^[2]。钙离子(Ca²⁺)作为细胞内最重要的第二信使之一，可以激活细胞内的多种酶类，消耗碱性磷酸酶，产生氧自由基从而诱发细胞凋亡^[4]。蛋白激酶C(PKC)是细胞信号转导过程中的重要调节酶，它可以通过对氨基酸的磷酸化作用来介导细胞的增生或凋亡过程。项目组前期研究发现，蓝光照射体外培养的人RPE细胞后，出现典型细胞凋亡形态变化，线粒体肿胀，内膜嵴消失，照射早期出现线粒体膜电位降低，细胞色素C释放^{[2, 3]}；蓝光照射诱导人RPE细胞凋亡与细胞内游离Ca²⁺浓度增加有关^[5]。但在此过程中PKC活性是否发生变化，这种变化与Ca²⁺浓度增加之间的关系，目前仍不清楚。因此，我们观察了蓝光照射后RPE细胞内PKC活性和Ca²⁺浓度变化，旨在探讨Ca²⁺-PKC信号通路在RPE细胞光损伤过程中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

人RPE细胞来源于意外死亡的2名健康成年男性，年龄分别为25、35岁，死亡12 h内取材。实验程序符合我院人体试验委员会制定的伦理道德标准，并通过伦理委员会审查。

蓝光光源采用天津英泽科技有限公司生产的20 W医用蓝光灯管，光照度仪采用台湾泰仕光学仪器股份有限公司TES1330A型，Gel-pro凝胶电泳分析系统购自美国Media Cybernetics公司，激光扫描共焦显微镜(LSCM)采用德国Leica公司TCS-SP5型。Dulbecco改良Eagle培养基／F12培养基购自美国Hyclone公司，非放射性PKC活性检测试剂盒购自美国Promega公司，乙酰氧基甲基酯Ca²⁺荧光探针(Fluo 3-AM)购自碧云天生物技术公司，佛波酯(PMA)和钙磷酸结合蛋白(calphostin C)购自德国Sigma公司。

1.2 细胞培养和鉴定

RPE细胞原代培养、传代参照蔡善君等^[2]的方法，第4代细胞用于实验。每组平行对照实验均在同一个体同一代细胞中进行，用于实验的RPE细胞，以锥虫蓝染色进行活力测定，RPE细胞的活力均在90%以上。参照文献[3]的方法，对培养细胞行角蛋白免疫组织化学染色鉴定。

1.3 实验方法

参照文献[6, 7]的方法，采用蛋白免疫印迹法测定培养细胞PKC蛋白表达，检测PMA和calphostin C对PKC活性的影响；确定PMA与calphostin C影响PKC活性的最适宜浓度。将PMA及calphostin C溶于二甲基亚砜(DMSO)制成不同浓度稀释液。其中，PMA组终浓度分别为0.1、1.0、10.0、50.0、100.0、200.0 nmol/L；calphostin C组终浓度分别为5.0、25.0、50.0、75.0、100.0、200.0 nmol/L。将人RPE细胞传至第4代，加入含不同浓度PMA及calphostin C的培养基制作细胞标本，将不同浓度组细胞标本置于37 ℃培养箱中避光孵育12 h。采用0.25%胰蛋白酶消化并收集细胞，加入放射免疫沉淀测定强效裂解液充分裂解，提取各组RPE细胞总蛋白。按双金鸡宁酸法蛋白定量试剂盒说明操作，测定各组RPE细胞蛋白浓度，以20 μg／10 μl进行分装，依次上样、电泳、转膜、封闭、加一抗及二抗孵育后上机检测。计算PKC条带与甘油醛-3-磷酸脱氢酶条带积分吸光度(IA)值的比值并记为细胞膜PKC蛋白相对表达量，以此作为衡量PKC蛋白表达的依据。

采用非放射性核素法测定蓝光照射处理对培养细胞PKC活性的影响。将培养细胞随机分成光照组与对照组。将细胞培养于6孔板中，当细胞近铺满时，在37 ℃、5% CO₂培养箱中进行蓝光照射。参照文献[2, 8]的方法，采用20 W医用蓝光灯作为光源，波长为450～500 nm，光照强度为(2000±500) Lux，照射6 h。24 h后终止培养，采用非放射性PKC活性检测试剂盒测定2组细胞PKC活性变化。按试剂盒说明操作，将所得PKC琼脂糖凝胶条带放入Gel-pro凝胶光密度分析仪进行分析，以试剂盒自带的阳性对照(PC)及阴性对照(NC)组作为参考，以磷酸化PKC与非磷酸化PKC的IA值的比值反映PKC活性，即PKC活化度。所有测量均重复3次，取平均值。

参照文献[5]的方法，采用Fluo 3-AM Ca²⁺荧光探针检测不同干预状态下培养细胞内Ca²⁺浓度，以荧光强度反映Ca²⁺浓度。将培养细胞随机分成无光照、单纯光照、光照联合硝苯地平、光照联合calphostin C、光照联合PMA 5个组。其中，无光照组不接受光照，细胞培养瓶用锡箔纸完全包裹；单纯光照组仅接受光照；光照联合硝苯地平组，在光照前1 h加入浓度为0.1 mmol/L的硝苯地平；光照联合calphostin C组，在光照前12 h加入浓度为100.0 nmol/L的calphostin C；光照联合PMA组，在光照前12 h加入浓度为100.0 nmol/L的PMA。采用20 W医用蓝光灯作为光源，波长为450～500 nm，光照强度为(2000±500) Lux，照射6 h，24 h终止培养，检测各组培养细胞内Ca²⁺浓度。所有测量均重复3次，取平均值。

1.4 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件进行统计学处理。计数资料以均数±标准差(x±s)表示。光照组与对照组PKC活性比较采用独立样本t检验。不同浓度PMA、calphostin C处理后培养细胞PKC蛋白相对表达量比较及各组细胞内Ca²⁺浓度比较，经方差齐性检验方差齐，采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差异法，行双侧检验，检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

体外培养的细胞经角蛋白免疫组织化学染色后，其细胞质呈棕褐色的阳性反应，证明培养细胞为人RPE细胞(图 1)。

图1 体外培养细胞光学显微镜像。细胞质呈棕褐色的阳性反应苏木素 ×200

图选项

1.	Organisciak DT, Darrow RM, Barsalou L, et al. Light history and age-related changes in retinal light damage[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci,1998,39:1107-1116.
2.	蔡善君,严密,张军军.蓝光诱导体外培养的人视网膜色素上皮细胞凋亡[J].中华眼底病志,2005,21:384-387.
3.	蔡善君,严密,毛咏秋.蓝光致人视网膜色素上皮细胞凋亡与线立体膜电位和细胞色素C的关系[J].中华眼科杂志,2006,42:1095-1102.
4.	Parekh AB, Putney JW Jr. Store-operated calcium channels[J]. Physiol Rev,2005,85:757-810.
5.	宿罡,宫鑫,蔡善君,等.蓝光所致人视网膜色素上皮细胞损伤与细胞内钙离子含量变化的关系[J].中华实验眼科杂志,2013,31:734-738.
6.	毛俊峰,刘双珍,秦文娟,等.蛋白激酶C活性调节剂对豚鼠近视眼视网膜Müller细胞的作用及意义[J].眼科研究,2009,27:5-9.
7.	王中群,李丽华,赵卫星,等.蛋白激酶C活性变化影响内皮-单核细胞黏附[J].中华老年心脑血管病杂志,2008,10:529-532.
8.	宫鑫,蔡善君,李海辉,等.蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞L-型钙通道mRNA表达的影响[J].中华眼底病杂志,2013,29:411-415.
9.	Lucas M, Sánchez-Margalet V. Protein kinase C involvement in apoptosis[J]. Gen Pharmacol,1995,26:881-887.
10.	Westlund BS, Cai BL, Zhou JL, et al. Involvement of c-Abl, p53 and the MAP kinase JNK in the cell death program initiated in A2E-laden ARPE-19 cells by exposure to blue light[J]. Apoptosis,2009,14:31-41.
11.	Kumar S, Kain V, Sitasawad SL. High glucose-induced Ca²⁺ overload and oxidative stress contribute to apoptosis of cardiac cells through mitochondrial dependent and independent pathways[J]. Biochim Biophys Acta,2012,1820:907-920.
12.	Pang DB, Hong J.[Ca²⁺]i homeostasis and caspase-3 gene expression in verapamil-induced retinal pigment epithelium cells apoptosis in vitro[J]. Int J Ophthalmol,2010,3:288-290.

《中华眼底病杂志》

蓝光照射对人视网膜色素上皮细胞钙离子-蛋白激酶C信号通路的影响

摘要 全文 图表 视频 参考文献 施引文献 补充材料

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 细胞培养和鉴定

1.3 实验方法

1.4 统计学方法

2 结果

3 讨论

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 细胞培养和鉴定

1.3 实验方法

1.4 统计学方法

2 结果

3 讨论

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