引用本文： 王菁, 蔡萌, 李静, 田蓉, 林少芬, 田景毅, 李佳, 俞德超, 罗燕. 补体受体1对补体激活的氧化应激状态下人视网膜色素上皮单层细胞屏障的保护作用. 中华眼底病杂志, 2014, 30(4): 399-403. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.04.016 复制
视网膜色素上皮(RPE)处于氧化应激状态时易发生补体激活，介导血管内皮生长因子(VEGF)释放增加，导致RPE单层细胞屏障破坏[1]。补体受体1(CR1)是一种补体调节蛋白，对补体激活旁路途径和经典途径有较大抑制作用，可以抑制心肌缺血、心肌坏死以及外周神经损伤中补体激活，从而保护机体避免过度补体激活导致的炎症反应[2]。但目前有关CR1对补体激活的氧化应激状态下人RPE(hRPE)细胞屏障的作用研究较少。为此，我们利用原代培养的hRPE细胞和聚酯膜嵌套(Transwell)培养体系建立体外稳定的hRPE单层细胞屏障模型，从细胞水平角度探讨CR1对补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障的保护作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料与试剂
人CR1(信达生物制药有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，蛋白酶抑制剂(美国Roche公司)，FUT-175 (美国BD公司)，Transwell(美国Corning公司)，叔丁基过氧化氢(t-BHP)、普通人血清(NHS)、二甲基亚矾(DMSO，美国Sigma公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)，RPE65抗体(美国Novus公司)，羊抗鼠荧光二抗Alexa Fluor 555(美国Invitrogen公司)，人VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、人趋化因子配体2(CCL2)ELISA试剂盒(美国R & D公司)，人C3a ELISA试剂盒、人C5a ELISA试剂盒、人膜攻击复合物(MAC)ELISA试剂盒(美国Quidel公司)。
1.2 hRPE细胞的原代培养及鉴定
本实验通过中山大学中山眼科中心伦理委员会审查批准，并按相关规定进行。hRPE细胞取自中山大学中山眼科中心眼库提供的健康尸体眼。用眼科剪从赤道部环形剪除眼前节，去除玻璃体，将神经上皮层从RPE层剥离干净，并在视神经根部剪断。灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗眼杯2次，眼杯内加入0.25%胰酶，置于37℃温箱内孵育消化30 min。用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸管轻轻吹洗眼杯，收集细胞悬液于离心管中，以离心半径10 cm，1000 r/min离心5 min，弃上清液。再加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，接种于60 mm的培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d后第一次换液。以后每2～3天换液1次，采用倒置相差显微镜观察细胞每天的贴壁生长情况。hRPE细胞生长近融合时，胰酶消化细胞，按1 :4传代。
用特异性表达于RPE细胞内的RPE65蛋白抗体进行鉴定原代培养的hRPE细胞。取融合至70%~80%的第3~5代hRPE细胞爬片进行免疫荧光染色。PBS洗涤2次后冷丙酮固定10 min；PBS洗涤3次，5 min/次；0.1%Triton-X-100联合1%牛血清蛋白封闭渗透性处理30 min；RPE65抗体(1 :250)湿盒中4℃孵育过夜；PBS洗涤3次，5 min/次；孵育二抗(1 :400)，室温避光1 h；PBS洗涤3次，5 min/次；孵育二脒基苯基吲哚(DAPI，1 :2000)，室温避光5 min；PBS洗涤3次，5 min/次；抗荧光衰减封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.3 hRPE单层细胞屏障及补体激活的氧化损伤模型建立
参照文献[3]的方法建立hRPE单层细胞屏障模型。取第3~5代hRPE细胞，按细胞密度4×105个/ml接种于24孔Transwell上室，其预先用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液包被2 h。上室、下室分别加0.5、1.5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。接种后第3~4天，细胞贴壁生长至融合形成单层，胎牛血清减至1%继续培养约4周，倒置相差显微镜观察模型建立情况。接种后6、9、12、15、18、21、24、27、30 d，测量跨表皮细胞膜电阻(TER)值。未接种细胞，仅有培养液的实验孔为空白对照。空白对照组及处理组均设5个复孔，取平均值后进行比较。测量前调零EVOMX电阻测量仪(美国World Precision Instruments公司)，并检测其内部电阻稳定性。Transwell板在室温平衡30 min。将STX2筷式电极的短臂与长臂分别置于插入式培养池的内、外室，使电极顶端距离聚脂薄膜约0.5 cm。待读数稳定后记录数值，每个培养池测量3次，取平均值。上皮细胞单层净电阻值=(实际测量值-空白对照值)×上皮细胞单层的有效面积[4]。以hRPE细胞接种3周后的单层细胞屏障，其TER值达55~60 Ω cm2时表明hRPE单层细胞屏障功能形成[5]，用于以下各个实验。
参照文献[6]的方法建立补体激活的氧化损伤模型。模型建立前，hRPE单层细胞改用无血清DMEM/F12培养液培养5~7 d，换液2~3次，以排除胎牛血清中补体成分对hRPE细胞补体激活的影响。Transwell上室中均加入终浓度为500 μmol/L的t-BHP和10% NHS。NHS为hRPE细胞补体反应提供补体成分。建模后1、2、4、6 h，检测TER值以观察补体激活的氧化损伤对hRPE单层细胞屏障的影响，从而确定药物的作用时间。
1.4 TER值及VEGF、CCL2、C3a、C5a、MAC蛋白量检测
将补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障分为模型组和CR1治疗组，未经t-BHP、NHS及药物处理的正常hRPE单层细胞为正常对照组。模型组和CR1治疗组同时加入t-BHP和NHS后，模型组再加入1 μl的PBS，CR1组再加入1 μl的CR1溶液使其终浓度为1 μg/ml。培养4 h后，检测各组TER值。
收集两组细胞培养4 h后上室的培养液，加入蛋白酶抑制剂及FUT-175分别抑制蛋白质裂解和体外补体激活。BCA蛋白定量法检测细胞培养上清液中总蛋白浓度后进行ELISA实验。提前30 min从冰箱中取出人VEGF和CCL2的ELISA试剂盒，平衡至室温。用样本稀释液按1 :50稀释标本，除空白孔外，分别将500 μl分析液与200 μl标本或标准样品加入反应孔中，贴上胶条密封，室温孵育2 h，洗涤3次；以200 μl/孔加入酶结合的生物素化抗体工作液，室温孵育2 h，洗涤3次；以200 μl/孔加入底物液，室温避光孵育20 min；以50 μl/孔加入终止液，混匀后30 min内酶标仪上测量波长450 nm处的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，波长570 nm处A值用于校正。根据标准曲线和总蛋白浓度，计算每毫克总蛋白中VEGF和CCL2的蛋白量。
采用与VEGF和CCL2蛋白量检测的相同方法，计算每毫克总蛋白中C3a、C5a、MAC的蛋白量。开始实验前用洗涤液将反应孔洗涤3次。用样本稀释液按1 :20稀释标本，除空白孔外，分别将100 μl标本或标准样品加入反应孔中，贴上胶条密封，室温孵育1 h，洗涤4次；以100 μl/孔加酶结合的生物素化抗体工作液，室温孵育1 h，洗涤4次；以100 μl/孔加入底物液，室温避光孵育15 min；以100 μl/孔加入终止液。
1.5 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，第4代hRPE细胞接种于培养皿2 d后，可见细胞贴壁生长，细胞呈多角形，部分细胞可见黑色色素颗粒(图 1)。激光共聚焦显微镜观察发现，培养的hRPE细胞浆表达特异性的RPE65，呈红色荧光；细胞核被DAPI标记，呈蓝色荧光(图 2)。倒置相差显微镜观察发现，Transwell中培养第15天，hRPE细胞形成单层细胞屏障，紧密排列生长的细胞呈六角形，部分细胞可见黑色色素颗粒(图 3)。hRPE单层细胞屏障于接种后3周稳定形成。
图1
hRPE细胞倒置相差显微镜像。可见细胞贴壁生长，部分细胞可见黑色色素颗粒 标尺：400 μm 图 2 hRPE细胞激光共聚焦显微镜。可见细胞浆中表达特异性RPE65蛋白，呈红色荧光；细胞核被DAPI标记，呈蓝色荧光免疫荧光染色 标尺：200 μm 图 3 单层hRPE细胞屏障倒置相差显微镜像。可见形成单层屏障的hRPE细胞呈六角形，部分细胞可见黑色色素颗粒 标尺：400 μm
hRPE单层细胞屏障建立过程中，TER值随培养时间的延长逐渐增大(图 4)。接种后6 d，TER值为(30.23±0.69) Ωcm2。接种后9、12 d，TER值增加幅度明显；分别与接种后6 d的TER值比较，差异均有统计学意义(t=8.65、21.31，P<0.05)。接种后15、18、21、24、27、30 d，TER值维持在55~60 Ωcm2，较接种后6 d明显增高；分别与接种后6 d的TER值比较，差异均有统计学意义(t=28.92、30.09、 30.17、32.38、30.37、27.32，P<0.05)。
图4
hRPE细胞接种后不同时间TER值变化曲线 图 5 补体激活的氧化损伤建模后不同时间TER值变化曲线 图 6 模型组、CR1治疗组VEGF、CCL2蛋白量比较。*：与模型组比较，P<0.05 图 7 模型组、CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量比较。*：与模型组比较，P<0.05
补体激活的氧化损伤可损伤hRPE单层细胞屏障功能，随着作用时间的延长，TER值逐渐下降(图 5)。建模后1、2、4、6 h，TER值分别为(47.16±3.40)、 (40.82±2.70)、(32.79±1.82)、(35.2±1.58) Ωcm2。与建模后4 h的TER值比较，建模后1、2 h的TER值明显降低，差异有统计学意义(t=14.37、8.02，P<0.05)；建模后6 h的TER值有所升高，但差异无统计学意义(t=2.41，P>0.05)。
模型组补体激活的氧化损伤hRPE细胞TER值为(31.95±3.45)Ωcm2，降至正常hRPE细胞的54.01%；与正常hRPE细胞的TER值比较，差异有统计学意义(t=27.20，P<0.05)。CR1治疗组补体激活的氧化损伤hRPE细胞的TER值为(34.55±2.08) Ωcm2，达正常hRPE细胞的63.48%；与正常hRPE细胞的TER值比较，差异有统计学意义(t=20.60，P<0.05)。与模型组相比，CR1治疗组TER值显著提高，差异有统计学意义(t=6.60，P<0.05)。
模型组、CR1治疗组VEGF蛋白量分别为(83.32±4.51)、(73.40±0.88) pg/mg。CR1治疗组VEGF蛋白量较模型组下降了11.48%，差异有统计学意义(t=3.26，P<0.05)。模型组、CR1治疗组CCL2蛋白量分别为(53.08±7.10)、(43.63±1.79) pg/mg。CR1治疗组CCL2蛋白量较模型组下降了23.47%，差异有统计学意义(t=2.43，P<0.05)(图 6)。
模型组C3a、C5a、MAC蛋白量分别为(92.38±3.40)、(25.48±4.55)、(193.72±10.07) ng/mg。CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量分别为(70.24±1.89)、(18.38±1.05)、(150.25±4.06) ng/mg。CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量较模型组分别下降了24.00%、27.87%、22.44%，差异均有统计学意义(t=9.86、2.63、6.94，P<0.05)(图 7)。
3 讨论
补体激活与氧化损伤在老年性黄斑变性(AMD)的发病机制中关系密切，相互协同[1, 7]。我们通过建立体外稳定的hRPE单层细胞屏障模型，模拟了AMD视网膜RPE外屏障受损的病理环境，以研究补体激活与氧化损伤对视网膜外屏障功能的影响。TER值是hRPE屏障功能的良好反映指标；氧化损伤、补体激活以及多种炎症反应因子分泌增加均可破坏hRPE屏障功能，从而导致TER值下降[1, 3, 8-10]。TER值降至正常hRPE细胞的60%以下，被认为补体激活的氧化损伤模型建立良好[11]。本研究结果显示，模型组TER值下降至正常hRPE细胞的54.01%，证明模型建立成功。
VEGF是影响hRPE细胞屏障功能的重要因子，氧化应激状态的hRPE细胞分泌VEGF的水平明显增高[8]。本研究结果显示，CR1治疗组VEGF蛋白量较模型组下降了11.48%。说明CR1可明显抑制补体激活的氧化损伤hRPE细胞分泌VEGF。提示CR1可能通过补体调节的某些机制调控VEGF的表达。
补体C3裂解为C3a和C3b，是补体激活三大途径中的重要过程；C5a和MAC的水平是补体激活终末阶段的重要标志[12, 13]。CR1作为补体调节蛋白，发挥抑制补体激活的作用，与AMD发生发展密切相关。本研究结果显示，与模型组比较，CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量明显下降。提示CR1可抑制氧化损伤hRPE单层细胞的补体激活。
RPE作为血视网膜外屏障的一部分，通过分泌CCL2等促炎性细胞因子而参与眼内炎症反应[14]。研究表明，氧化损伤导致的CCL2表达升高是慢性光损伤诱导AMD的致病因素，通过拮抗CCL2受体，可有效抑制脉络膜组织中巨噬细胞的聚集、VEGF的分泌和脉络膜新生血管(CNV)的形成[15]。Liu等[16]通过建立激光诱导的CNV动物模型，发现MAC在CCL2上游，通过调控RPE分泌CCL2而抑制VEGF的表达。但这一调控机制尚未在细胞实验中证实，仅在hRPE细胞实验中发现MAC可诱导单层hRPE细胞分泌VEGF的水平增高[17]。除了MAC，玻璃体腔注射C3a和C5a也可诱导小鼠CNV形成，其机制是C3a和C5a促进脉络膜组织VEGF生成增多[18]。但C3a、C5a与炎症因子的关系以及其调控的VEGF的关系尚不明确。本研究结果显示，CR1治疗组CCL2蛋白量较模型组下降了23.47%。说明CR1可明显抑制补体激活的氧化损伤hRPE细胞分泌CCL2的水平。据此我们推测，CR1可能通过下调补体成分C3a、C5a、MAC以及CCL2、VEGF的表达以保护补体激活的氧化损伤状态下hRPE单层细胞的屏障功能。
本研究结果表明，CR1对补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障具有保护作用，抑制补体激活、下调CCL2和VEGF表达可能是其机制。但有关CR1如何通过抑制补体激活而调控hRPE细胞分泌CCL2、VEGF表达还需要进一步研究来探讨。
视网膜色素上皮(RPE)处于氧化应激状态时易发生补体激活，介导血管内皮生长因子(VEGF)释放增加，导致RPE单层细胞屏障破坏[1]。补体受体1(CR1)是一种补体调节蛋白，对补体激活旁路途径和经典途径有较大抑制作用，可以抑制心肌缺血、心肌坏死以及外周神经损伤中补体激活，从而保护机体避免过度补体激活导致的炎症反应[2]。但目前有关CR1对补体激活的氧化应激状态下人RPE(hRPE)细胞屏障的作用研究较少。为此，我们利用原代培养的hRPE细胞和聚酯膜嵌套(Transwell)培养体系建立体外稳定的hRPE单层细胞屏障模型，从细胞水平角度探讨CR1对补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障的保护作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料与试剂
人CR1(信达生物制药有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)，Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)/F12培养液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)，蛋白酶抑制剂(美国Roche公司)，FUT-175 (美国BD公司)，Transwell(美国Corning公司)，叔丁基过氧化氢(t-BHP)、普通人血清(NHS)、二甲基亚矾(DMSO，美国Sigma公司)，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(美国Thermo公司)，RPE65抗体(美国Novus公司)，羊抗鼠荧光二抗Alexa Fluor 555(美国Invitrogen公司)，人VEGF酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒、人趋化因子配体2(CCL2)ELISA试剂盒(美国R & D公司)，人C3a ELISA试剂盒、人C5a ELISA试剂盒、人膜攻击复合物(MAC)ELISA试剂盒(美国Quidel公司)。
1.2 hRPE细胞的原代培养及鉴定
本实验通过中山大学中山眼科中心伦理委员会审查批准，并按相关规定进行。hRPE细胞取自中山大学中山眼科中心眼库提供的健康尸体眼。用眼科剪从赤道部环形剪除眼前节，去除玻璃体，将神经上皮层从RPE层剥离干净，并在视神经根部剪断。灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗眼杯2次，眼杯内加入0.25%胰酶，置于37℃温箱内孵育消化30 min。用含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液终止消化，吸管轻轻吹洗眼杯，收集细胞悬液于离心管中，以离心半径10 cm，1000 r/min离心5 min，弃上清液。再加入10%胎牛血清的DMEM/F12培养液制成细胞悬液，接种于60 mm的培养皿中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，3 d后第一次换液。以后每2～3天换液1次，采用倒置相差显微镜观察细胞每天的贴壁生长情况。hRPE细胞生长近融合时，胰酶消化细胞，按1 :4传代。
用特异性表达于RPE细胞内的RPE65蛋白抗体进行鉴定原代培养的hRPE细胞。取融合至70%~80%的第3~5代hRPE细胞爬片进行免疫荧光染色。PBS洗涤2次后冷丙酮固定10 min；PBS洗涤3次，5 min/次；0.1%Triton-X-100联合1%牛血清蛋白封闭渗透性处理30 min；RPE65抗体(1 :250)湿盒中4℃孵育过夜；PBS洗涤3次，5 min/次；孵育二抗(1 :400)，室温避光1 h；PBS洗涤3次，5 min/次；孵育二脒基苯基吲哚(DAPI，1 :2000)，室温避光5 min；PBS洗涤3次，5 min/次；抗荧光衰减封片剂封片，激光共聚焦显微镜下观察并拍照。
1.3 hRPE单层细胞屏障及补体激活的氧化损伤模型建立
参照文献[3]的方法建立hRPE单层细胞屏障模型。取第3~5代hRPE细胞，按细胞密度4×105个/ml接种于24孔Transwell上室，其预先用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液包被2 h。上室、下室分别加0.5、1.5 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。接种后第3~4天，细胞贴壁生长至融合形成单层，胎牛血清减至1%继续培养约4周，倒置相差显微镜观察模型建立情况。接种后6、9、12、15、18、21、24、27、30 d，测量跨表皮细胞膜电阻(TER)值。未接种细胞，仅有培养液的实验孔为空白对照。空白对照组及处理组均设5个复孔，取平均值后进行比较。测量前调零EVOMX电阻测量仪(美国World Precision Instruments公司)，并检测其内部电阻稳定性。Transwell板在室温平衡30 min。将STX2筷式电极的短臂与长臂分别置于插入式培养池的内、外室，使电极顶端距离聚脂薄膜约0.5 cm。待读数稳定后记录数值，每个培养池测量3次，取平均值。上皮细胞单层净电阻值=(实际测量值-空白对照值)×上皮细胞单层的有效面积[4]。以hRPE细胞接种3周后的单层细胞屏障，其TER值达55~60 Ω cm2时表明hRPE单层细胞屏障功能形成[5]，用于以下各个实验。
参照文献[6]的方法建立补体激活的氧化损伤模型。模型建立前，hRPE单层细胞改用无血清DMEM/F12培养液培养5~7 d，换液2~3次，以排除胎牛血清中补体成分对hRPE细胞补体激活的影响。Transwell上室中均加入终浓度为500 μmol/L的t-BHP和10% NHS。NHS为hRPE细胞补体反应提供补体成分。建模后1、2、4、6 h，检测TER值以观察补体激活的氧化损伤对hRPE单层细胞屏障的影响，从而确定药物的作用时间。
1.4 TER值及VEGF、CCL2、C3a、C5a、MAC蛋白量检测
将补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障分为模型组和CR1治疗组，未经t-BHP、NHS及药物处理的正常hRPE单层细胞为正常对照组。模型组和CR1治疗组同时加入t-BHP和NHS后，模型组再加入1 μl的PBS，CR1组再加入1 μl的CR1溶液使其终浓度为1 μg/ml。培养4 h后，检测各组TER值。
收集两组细胞培养4 h后上室的培养液，加入蛋白酶抑制剂及FUT-175分别抑制蛋白质裂解和体外补体激活。BCA蛋白定量法检测细胞培养上清液中总蛋白浓度后进行ELISA实验。提前30 min从冰箱中取出人VEGF和CCL2的ELISA试剂盒，平衡至室温。用样本稀释液按1 :50稀释标本，除空白孔外，分别将500 μl分析液与200 μl标本或标准样品加入反应孔中，贴上胶条密封，室温孵育2 h，洗涤3次；以200 μl/孔加入酶结合的生物素化抗体工作液，室温孵育2 h，洗涤3次；以200 μl/孔加入底物液，室温避光孵育20 min；以50 μl/孔加入终止液，混匀后30 min内酶标仪上测量波长450 nm处的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，波长570 nm处A值用于校正。根据标准曲线和总蛋白浓度，计算每毫克总蛋白中VEGF和CCL2的蛋白量。
采用与VEGF和CCL2蛋白量检测的相同方法，计算每毫克总蛋白中C3a、C5a、MAC的蛋白量。开始实验前用洗涤液将反应孔洗涤3次。用样本稀释液按1 :20稀释标本，除空白孔外，分别将100 μl标本或标准样品加入反应孔中，贴上胶条密封，室温孵育1 h，洗涤4次；以100 μl/孔加酶结合的生物素化抗体工作液，室温孵育1 h，洗涤4次；以100 μl/孔加入底物液，室温避光孵育15 min；以100 μl/孔加入终止液。
1.5 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差(
2 结果
倒置相差显微镜观察发现，第4代hRPE细胞接种于培养皿2 d后，可见细胞贴壁生长，细胞呈多角形，部分细胞可见黑色色素颗粒(图 1)。激光共聚焦显微镜观察发现，培养的hRPE细胞浆表达特异性的RPE65，呈红色荧光；细胞核被DAPI标记，呈蓝色荧光(图 2)。倒置相差显微镜观察发现，Transwell中培养第15天，hRPE细胞形成单层细胞屏障，紧密排列生长的细胞呈六角形，部分细胞可见黑色色素颗粒(图 3)。hRPE单层细胞屏障于接种后3周稳定形成。
图1
hRPE细胞倒置相差显微镜像。可见细胞贴壁生长，部分细胞可见黑色色素颗粒 标尺：400 μm 图 2 hRPE细胞激光共聚焦显微镜。可见细胞浆中表达特异性RPE65蛋白，呈红色荧光；细胞核被DAPI标记，呈蓝色荧光免疫荧光染色 标尺：200 μm 图 3 单层hRPE细胞屏障倒置相差显微镜像。可见形成单层屏障的hRPE细胞呈六角形，部分细胞可见黑色色素颗粒 标尺：400 μm
hRPE单层细胞屏障建立过程中，TER值随培养时间的延长逐渐增大(图 4)。接种后6 d，TER值为(30.23±0.69) Ωcm2。接种后9、12 d，TER值增加幅度明显；分别与接种后6 d的TER值比较，差异均有统计学意义(t=8.65、21.31，P<0.05)。接种后15、18、21、24、27、30 d，TER值维持在55~60 Ωcm2，较接种后6 d明显增高；分别与接种后6 d的TER值比较，差异均有统计学意义(t=28.92、30.09、 30.17、32.38、30.37、27.32，P<0.05)。
图4
hRPE细胞接种后不同时间TER值变化曲线 图 5 补体激活的氧化损伤建模后不同时间TER值变化曲线 图 6 模型组、CR1治疗组VEGF、CCL2蛋白量比较。*：与模型组比较，P<0.05 图 7 模型组、CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量比较。*：与模型组比较，P<0.05
补体激活的氧化损伤可损伤hRPE单层细胞屏障功能，随着作用时间的延长，TER值逐渐下降(图 5)。建模后1、2、4、6 h，TER值分别为(47.16±3.40)、 (40.82±2.70)、(32.79±1.82)、(35.2±1.58) Ωcm2。与建模后4 h的TER值比较，建模后1、2 h的TER值明显降低，差异有统计学意义(t=14.37、8.02，P<0.05)；建模后6 h的TER值有所升高，但差异无统计学意义(t=2.41，P>0.05)。
模型组补体激活的氧化损伤hRPE细胞TER值为(31.95±3.45)Ωcm2，降至正常hRPE细胞的54.01%；与正常hRPE细胞的TER值比较，差异有统计学意义(t=27.20，P<0.05)。CR1治疗组补体激活的氧化损伤hRPE细胞的TER值为(34.55±2.08) Ωcm2，达正常hRPE细胞的63.48%；与正常hRPE细胞的TER值比较，差异有统计学意义(t=20.60，P<0.05)。与模型组相比，CR1治疗组TER值显著提高，差异有统计学意义(t=6.60，P<0.05)。
模型组、CR1治疗组VEGF蛋白量分别为(83.32±4.51)、(73.40±0.88) pg/mg。CR1治疗组VEGF蛋白量较模型组下降了11.48%，差异有统计学意义(t=3.26，P<0.05)。模型组、CR1治疗组CCL2蛋白量分别为(53.08±7.10)、(43.63±1.79) pg/mg。CR1治疗组CCL2蛋白量较模型组下降了23.47%，差异有统计学意义(t=2.43，P<0.05)(图 6)。
模型组C3a、C5a、MAC蛋白量分别为(92.38±3.40)、(25.48±4.55)、(193.72±10.07) ng/mg。CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量分别为(70.24±1.89)、(18.38±1.05)、(150.25±4.06) ng/mg。CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量较模型组分别下降了24.00%、27.87%、22.44%，差异均有统计学意义(t=9.86、2.63、6.94，P<0.05)(图 7)。
3 讨论
补体激活与氧化损伤在老年性黄斑变性(AMD)的发病机制中关系密切，相互协同[1, 7]。我们通过建立体外稳定的hRPE单层细胞屏障模型，模拟了AMD视网膜RPE外屏障受损的病理环境，以研究补体激活与氧化损伤对视网膜外屏障功能的影响。TER值是hRPE屏障功能的良好反映指标；氧化损伤、补体激活以及多种炎症反应因子分泌增加均可破坏hRPE屏障功能，从而导致TER值下降[1, 3, 8-10]。TER值降至正常hRPE细胞的60%以下，被认为补体激活的氧化损伤模型建立良好[11]。本研究结果显示，模型组TER值下降至正常hRPE细胞的54.01%，证明模型建立成功。
VEGF是影响hRPE细胞屏障功能的重要因子，氧化应激状态的hRPE细胞分泌VEGF的水平明显增高[8]。本研究结果显示，CR1治疗组VEGF蛋白量较模型组下降了11.48%。说明CR1可明显抑制补体激活的氧化损伤hRPE细胞分泌VEGF。提示CR1可能通过补体调节的某些机制调控VEGF的表达。
补体C3裂解为C3a和C3b，是补体激活三大途径中的重要过程；C5a和MAC的水平是补体激活终末阶段的重要标志[12, 13]。CR1作为补体调节蛋白，发挥抑制补体激活的作用，与AMD发生发展密切相关。本研究结果显示，与模型组比较，CR1治疗组C3a、C5a、MAC蛋白量明显下降。提示CR1可抑制氧化损伤hRPE单层细胞的补体激活。
RPE作为血视网膜外屏障的一部分，通过分泌CCL2等促炎性细胞因子而参与眼内炎症反应[14]。研究表明，氧化损伤导致的CCL2表达升高是慢性光损伤诱导AMD的致病因素，通过拮抗CCL2受体，可有效抑制脉络膜组织中巨噬细胞的聚集、VEGF的分泌和脉络膜新生血管(CNV)的形成[15]。Liu等[16]通过建立激光诱导的CNV动物模型，发现MAC在CCL2上游，通过调控RPE分泌CCL2而抑制VEGF的表达。但这一调控机制尚未在细胞实验中证实，仅在hRPE细胞实验中发现MAC可诱导单层hRPE细胞分泌VEGF的水平增高[17]。除了MAC，玻璃体腔注射C3a和C5a也可诱导小鼠CNV形成，其机制是C3a和C5a促进脉络膜组织VEGF生成增多[18]。但C3a、C5a与炎症因子的关系以及其调控的VEGF的关系尚不明确。本研究结果显示，CR1治疗组CCL2蛋白量较模型组下降了23.47%。说明CR1可明显抑制补体激活的氧化损伤hRPE细胞分泌CCL2的水平。据此我们推测，CR1可能通过下调补体成分C3a、C5a、MAC以及CCL2、VEGF的表达以保护补体激活的氧化损伤状态下hRPE单层细胞的屏障功能。
本研究结果表明，CR1对补体激活的氧化应激状态下hRPE单层细胞屏障具有保护作用，抑制补体激活、下调CCL2和VEGF表达可能是其机制。但有关CR1如何通过抑制补体激活而调控hRPE细胞分泌CCL2、VEGF表达还需要进一步研究来探讨。
