引用本文： 王友, 邓铂林, 黄健, 安刚. 玻璃体腔注射雷珠单抗治疗严重增生型糖尿病视网膜病变后玻璃体细胞因子的变化. 中华眼底病杂志, 2014, 30(5): 484-487. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.05.014 复制
增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的新生血管可发生于视盘(NVD)、视网膜(NVE)、虹膜(NVI)和前房角(NVA)，血管内皮生长因子(VEGF)在其发生发展病理过程中扮演着重要的角色。近年来研究发现,玻璃体腔注射抗VEGF药物联合玻璃体切割手术治疗严重PDR可取得较好疗效[1-5]。然而，玻璃体腔注射抗VEGF药物后，尽管下调了VEGF水平，但可能会引起眼球内其他炎性因子的改变[6]。为了观察玻璃体注射抗VEGF药物后玻璃体内相关炎性因子的具体表达情况，我们对一组行玻璃体腔注射雷珠单抗联合玻璃体切割手术治疗的PDR患者的玻璃体炎性细胞因子VEGF、白介素(IL)-6、IL-8、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和结缔组织生长因子(CTGF)浓度进行了测定，现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为前瞻性、对照、非盲法临床试验。其研究经医院伦理委员会讨论通过；患者均获知情并签署同意书。患者临床诊断、治疗以及标本采集工作在锦州市中心医院眼科完成。标本检测在辽宁医学院基础医学实验室完成。
2012年2月1日至2013年11月1日临床检查确诊的PDR患者80例80只眼纳入研究。其中，男性43例，女性37例；年龄32～78岁，平均年龄(56.13±8.83)岁。均为单眼。所有患者均行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、B型超声、眼压、光相干断层扫描(OCT)、荧光素眼底血管造影(FFA)检查。患者临床表现和检查结果符合PDR国际临床诊断标准[7],严重PDR定义为存在活动性新生血管和纤维增生[8]，满足以下条件之一，存在NVD或范围≥1个视盘直径(DD)的NVE、NVI、NVD，同时伴或不伴有视网膜脱离的纤维增生[9]。纳入标准：(1)2型糖尿病，药物控制空腹血糖≤7.8 mmol/L，时间≥1个月。(2)眼底或眼前节改变满足以下条件之一，累及中心凹的黄斑前出血≥1 DD，中心凹外黄斑区前出血≥2 DD,后极部视网膜前出血≥3 DD；机化膜≥3条合并牵拉性视网膜脱离累及黄斑或范围≥4 DD，时间≤3个月； NVI；NVA。(3)BCVA光感～0.2。(4)计划行玻璃体切割手术治疗者。排除标准：(1)伴有视网膜中央或分支动脉阻塞、高度近视、异状胬肉、青光眼、角膜疾病、葡萄膜炎者。(2)晶状体混浊≥Ⅳ级。(3)6个月内有糖皮质激素治疗史，全视网膜激光光凝(PRP)或玻璃体切割手术治疗史。(4)玻璃体切割手术中发现玻璃体积血非PDR引起者。(5)HbA1c<6.8 %或≥16.0%。(6)高血压及其他心血管疾病或免疫性疾病如系统性红斑狼疮、Behet病、强制性脊柱炎等。(7)全身疾病和身体状态不能耐受手术者。
依照非主动随机方法将80例80只眼分为单纯玻璃体切割手术组(A组)、玻璃体腔注射雷珠单抗联合玻璃体切割手术组(B组)，均为40例40只眼。A组40例中，男性22例，占55.0%；女性18例，占45.0%。年龄32～78岁，平均年龄(56.93±9.77)岁；糖尿病病程8～30年，平均病程(17.43±4.92)年；HbA1c 6.8%～15.2%，平均HbA1c(9.58±1.94)%；6个月前有PRP治疗史12只眼，占30.0%；平均眼压(17.32± 3.50) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。玻璃体积血9例，牵拉性视网膜脱离19例，视网膜前出血12例。B组40例中，男性21例，占52.5%；女性19例，占47.5%。年龄39～69岁，平均年龄(55.50±7.17)岁；糖尿病病程9～28年，平均病程(16.70±4.74)年；HbA1c 7.5%～14.6%，平均HbA1c(9.95±2.05)%；玻璃体腔注射雷珠单抗前平均眼压(17.48±3.05) mmHg,玻璃体切割手术前平均眼压(16.2±3.14) mmHg。玻璃体积血7例，牵拉性视网膜脱离23例，视网膜前出血10例。两组间性别(χ2=0.05)、年龄(t=0.59)、糖尿病病程(t=0.36)、HbA1c(t=0.13)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组间并发症比较，差异无统计学意义(χ2=0.31、1.33、0.25，P>0.05)。两组均无单纯NVI或NVA患者。A组平均眼压，B组注药前、玻璃体切割手术前平均眼压比较，差异无统计学意义(F=0.81，P>0.05)。
A组患眼行玻璃体切割手术前抽取玻璃体液0.4 ml。 B组患眼行玻璃体切割手术前7 d，玻璃体腔注射雷珠单抗0.05 ml (含雷珠单抗0.5 mg)，因伦理原因未抽取玻璃体液或房水；注药后7d行玻璃体切割手术前抽取玻璃体液0.4 ml；存在牵拉性视网膜脱离者行玻璃体切割硅油填充手术。注药及玻璃体切割手术为同一有经验医师完成。
采用双抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定玻璃体VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度。试剂盒均购自北京博凌科为生物公司(进口分装美国R&D公司产品),灵敏度VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF分别为3.70、4.75、2.50、5.75、2.50 pg/L。酶联免疫分析采用Organon Teknia R eader 530分析仪，严格按说明书操作；绘制标准曲线，计算样本VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度。
SPSS17.0统计软件行统计学分析处理。A组手术前，B组注药前、手术前眼压比较行方差分析；两组VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度比较，结果以均数±标准差(
2 结果
A、B组VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度比较，B组VEGF、ICAM-1浓度明显低于A组，差异有统计学意义(t=16.34、12.53,P<0.001)；IL-6、 IL-8浓度高于A组，差异有统计学意义(t=11.97、12.24,P<0.001)；CTGF浓度较A组略升高，差异无统计学意义(t=1.39,P>0.05)(图 1)；CTGF/VEGF较A组升高，差异有统计学意义(t=14.75,P<0.001)。
图1
两组玻璃体各炎症因子浓度比较
相关性分析结果显示，VEGF与IL-6、IL-8成负相关，相关性较高；与ICAM-1成正相关；与CTGF相关性低(表 1)。
表1
玻璃体各炎症因子相关性分析结果
3 讨论
本研究严格按照纳入及排除标准选择纳入观察患者，非主动随机分为两组，两组间患者一般情况无差异。A组在玻璃体手术前，B组在给予玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后玻璃体手术前抽取玻璃体液并测量其VEGF及其它因子浓度，比较两组间差异是否具有统计学意义。实验过程简单，数据可靠。
炎性细胞因子在糖尿病视网膜病变(DR)中的具体作用机制虽然迄今仍然不完全清楚，但其重要性毋庸置疑。VEGF所导致的血管通透性增加与新生血管形成是致DR发展的一个重要原因[10]，而在VEGF的产生以及损害血管内皮细胞、增加通透性的过程中，IL是一个重要的参与因子[11]，且VEGF诱导ICAM-1表达，使DR早期白细胞黏附于血管内皮，启动整个病理过程[12]。本研究中，玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后，B组玻璃体中VEGF浓度明显低于A组，提示PDR患者在注射雷珠单抗7 d后玻璃体中VEGF的浓度明显下降，结果与文献报道一致[6]，这也是抗VEGF药物治疗DR的基础[13]。而随着VEGF浓度下降，新生血管退化，可以降低严重PDR玻璃体切割除手术的难度[14]。
IL-6是在缺血缺氧的视网膜环境下，由血管内皮细胞或者血管平滑肌细胞合成与分泌的多功能因子[15]，它在机体免疫调制过程和急性反应过程中起重要的作用，而且它也有引导VEGF分泌的作用[16]。IL-8是一种CXC趋化因子，它被认为是一个中性粒细胞和T淋巴细胞的强效趋化因子激活剂[17]，有促进血管生成和肿瘤转移的作用[18]。Jeon和Lee[19]在其研 究中发现，玻璃体腔注射贝伐单抗后第1天，IL-6、IL-8 浓度明显高于治疗前及治疗后第7天，但第1天与第7天IL-8的浓度变化差异并没有统计学意义,他们认为IL-6的急性升高是眼内视网膜缺血缺氧的共同反应途径，视网膜组织低灌注下IL-6及VEGF等相关因子的代偿性升高，可改善眼底供血，是缺血所导致的调节结果而并非缺血所致并发症。而Petrovič等[20]认为玻璃体切割手术后IL-8的升高可能是视网膜缺血及急性反应所致。本研究中，B组IL-6、IL-8较A组明显升高，说明玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后玻璃体液中IL-6、IL-8浓度升高。虽然二者的升高与VEGF值相关度较高，但并不能直接说明是VEGF的降低所导致，也可能是注射时穿刺或药物作用过程中的急性反应，或视网膜缺血缺氧所导致的调节结果，其具体机制仍需要进一步研究。
ICAM-1又名CD54，通常是由内皮细胞或者免疫细胞所释放的细胞表面糖蛋白。DR发展的一个重要初始步骤是白细胞黏附和损伤血管内皮细胞，而最早的损害是由ICAM-1和白细胞整合CD18介导的。ICAM -1通过与不同的细胞因子包括IL-1、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ的相互作用参与免疫激活炎症反应[11, 22]。已有研究证实，PDR患者中ICAM-1通常呈 现高表达，且与血浆HbA1c正相关[23, 24]。Hinton等[25] 认为ICAM-1的浓度与PDR患者黄斑水肿密切相关，是最重要的一个炎性细胞因子。本研究中，B组ICAM-1的浓度明显低于A组，而VEGF的浓度与ICAM-1浓度相关性较高，说明随着玻璃体VEGF浓度的降低，内皮细胞及免疫细胞释放ICAM-1的量明显减少，具体机制尚不清楚。
CTGF在纤维化过程中起着重要作用，它在增生性玻璃体视网膜病变、脉络膜新生血管、PDR中表达均高于正常眼[26]。有研究认为,VEGF会增加CTGF的表达，注射贝伐单抗后可以加速PDR纤维化，引起牵拉性视网膜脱离[27, 28]。Kuiper等[29]的研究也证实VEGF/CTGF在PDR中血管化与纤维化的作用。本研究结果显示，A、B组CTGF浓度差异并无统计学意义,但CTGF/VEGF差异有统计学意义，它的升高可能是导致纤维增生的一个原因。目前文献报道CTGF升高多来自于贝伐单抗，而雷珠单抗治疗PDR的研究资料尚少，本文研究进行了初步探讨，而更精确的资料需要进一步实验。
本研究为前瞻性、对照、非盲法试验。分组为非主动随机，虽然希望能够有一个随机化的过程，但鉴于伦理等原因未采用，可能会产生选择偏倚。我们考虑患者在自主选择治疗方式的时候，经济条件仍然是其主要原因，为尽量减少选择偏倚，所有患者均严格按纳入标准选择，所得结果准确可靠。
增生型糖尿病视网膜病变(PDR)的新生血管可发生于视盘(NVD)、视网膜(NVE)、虹膜(NVI)和前房角(NVA)，血管内皮生长因子(VEGF)在其发生发展病理过程中扮演着重要的角色。近年来研究发现,玻璃体腔注射抗VEGF药物联合玻璃体切割手术治疗严重PDR可取得较好疗效[1-5]。然而，玻璃体腔注射抗VEGF药物后，尽管下调了VEGF水平，但可能会引起眼球内其他炎性因子的改变[6]。为了观察玻璃体注射抗VEGF药物后玻璃体内相关炎性因子的具体表达情况，我们对一组行玻璃体腔注射雷珠单抗联合玻璃体切割手术治疗的PDR患者的玻璃体炎性细胞因子VEGF、白介素(IL)-6、IL-8、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和结缔组织生长因子(CTGF)浓度进行了测定，现将结果报道如下。
1 对象和方法
本研究为前瞻性、对照、非盲法临床试验。其研究经医院伦理委员会讨论通过；患者均获知情并签署同意书。患者临床诊断、治疗以及标本采集工作在锦州市中心医院眼科完成。标本检测在辽宁医学院基础医学实验室完成。
2012年2月1日至2013年11月1日临床检查确诊的PDR患者80例80只眼纳入研究。其中，男性43例，女性37例；年龄32～78岁，平均年龄(56.13±8.83)岁。均为单眼。所有患者均行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、B型超声、眼压、光相干断层扫描(OCT)、荧光素眼底血管造影(FFA)检查。患者临床表现和检查结果符合PDR国际临床诊断标准[7],严重PDR定义为存在活动性新生血管和纤维增生[8]，满足以下条件之一，存在NVD或范围≥1个视盘直径(DD)的NVE、NVI、NVD，同时伴或不伴有视网膜脱离的纤维增生[9]。纳入标准：(1)2型糖尿病，药物控制空腹血糖≤7.8 mmol/L，时间≥1个月。(2)眼底或眼前节改变满足以下条件之一，累及中心凹的黄斑前出血≥1 DD，中心凹外黄斑区前出血≥2 DD,后极部视网膜前出血≥3 DD；机化膜≥3条合并牵拉性视网膜脱离累及黄斑或范围≥4 DD，时间≤3个月； NVI；NVA。(3)BCVA光感～0.2。(4)计划行玻璃体切割手术治疗者。排除标准：(1)伴有视网膜中央或分支动脉阻塞、高度近视、异状胬肉、青光眼、角膜疾病、葡萄膜炎者。(2)晶状体混浊≥Ⅳ级。(3)6个月内有糖皮质激素治疗史，全视网膜激光光凝(PRP)或玻璃体切割手术治疗史。(4)玻璃体切割手术中发现玻璃体积血非PDR引起者。(5)HbA1c<6.8 %或≥16.0%。(6)高血压及其他心血管疾病或免疫性疾病如系统性红斑狼疮、Behet病、强制性脊柱炎等。(7)全身疾病和身体状态不能耐受手术者。
依照非主动随机方法将80例80只眼分为单纯玻璃体切割手术组(A组)、玻璃体腔注射雷珠单抗联合玻璃体切割手术组(B组)，均为40例40只眼。A组40例中，男性22例，占55.0%；女性18例，占45.0%。年龄32～78岁，平均年龄(56.93±9.77)岁；糖尿病病程8～30年，平均病程(17.43±4.92)年；HbA1c 6.8%～15.2%，平均HbA1c(9.58±1.94)%；6个月前有PRP治疗史12只眼，占30.0%；平均眼压(17.32± 3.50) mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。玻璃体积血9例，牵拉性视网膜脱离19例，视网膜前出血12例。B组40例中，男性21例，占52.5%；女性19例，占47.5%。年龄39～69岁，平均年龄(55.50±7.17)岁；糖尿病病程9～28年，平均病程(16.70±4.74)年；HbA1c 7.5%～14.6%，平均HbA1c(9.95±2.05)%；玻璃体腔注射雷珠单抗前平均眼压(17.48±3.05) mmHg,玻璃体切割手术前平均眼压(16.2±3.14) mmHg。玻璃体积血7例，牵拉性视网膜脱离23例，视网膜前出血10例。两组间性别(χ2=0.05)、年龄(t=0.59)、糖尿病病程(t=0.36)、HbA1c(t=0.13)比较，差异无统计学意义(P>0.05)。两组间并发症比较，差异无统计学意义(χ2=0.31、1.33、0.25，P>0.05)。两组均无单纯NVI或NVA患者。A组平均眼压，B组注药前、玻璃体切割手术前平均眼压比较，差异无统计学意义(F=0.81，P>0.05)。
A组患眼行玻璃体切割手术前抽取玻璃体液0.4 ml。 B组患眼行玻璃体切割手术前7 d，玻璃体腔注射雷珠单抗0.05 ml (含雷珠单抗0.5 mg)，因伦理原因未抽取玻璃体液或房水；注药后7d行玻璃体切割手术前抽取玻璃体液0.4 ml；存在牵拉性视网膜脱离者行玻璃体切割硅油填充手术。注药及玻璃体切割手术为同一有经验医师完成。
采用双抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定玻璃体VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度。试剂盒均购自北京博凌科为生物公司(进口分装美国R&D公司产品),灵敏度VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF分别为3.70、4.75、2.50、5.75、2.50 pg/L。酶联免疫分析采用Organon Teknia R eader 530分析仪，严格按说明书操作；绘制标准曲线，计算样本VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度。
SPSS17.0统计软件行统计学分析处理。A组手术前，B组注药前、手术前眼压比较行方差分析；两组VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度比较，结果以均数±标准差(
2 结果
A、B组VEGF、IL-6、IL-8、ICAM-1、CTGF浓度比较，B组VEGF、ICAM-1浓度明显低于A组，差异有统计学意义(t=16.34、12.53,P<0.001)；IL-6、 IL-8浓度高于A组，差异有统计学意义(t=11.97、12.24,P<0.001)；CTGF浓度较A组略升高，差异无统计学意义(t=1.39,P>0.05)(图 1)；CTGF/VEGF较A组升高，差异有统计学意义(t=14.75,P<0.001)。
图1
两组玻璃体各炎症因子浓度比较
相关性分析结果显示，VEGF与IL-6、IL-8成负相关，相关性较高；与ICAM-1成正相关；与CTGF相关性低(表 1)。
表1
玻璃体各炎症因子相关性分析结果
3 讨论
本研究严格按照纳入及排除标准选择纳入观察患者，非主动随机分为两组，两组间患者一般情况无差异。A组在玻璃体手术前，B组在给予玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后玻璃体手术前抽取玻璃体液并测量其VEGF及其它因子浓度，比较两组间差异是否具有统计学意义。实验过程简单，数据可靠。
炎性细胞因子在糖尿病视网膜病变(DR)中的具体作用机制虽然迄今仍然不完全清楚，但其重要性毋庸置疑。VEGF所导致的血管通透性增加与新生血管形成是致DR发展的一个重要原因[10]，而在VEGF的产生以及损害血管内皮细胞、增加通透性的过程中，IL是一个重要的参与因子[11]，且VEGF诱导ICAM-1表达，使DR早期白细胞黏附于血管内皮，启动整个病理过程[12]。本研究中，玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后，B组玻璃体中VEGF浓度明显低于A组，提示PDR患者在注射雷珠单抗7 d后玻璃体中VEGF的浓度明显下降，结果与文献报道一致[6]，这也是抗VEGF药物治疗DR的基础[13]。而随着VEGF浓度下降，新生血管退化，可以降低严重PDR玻璃体切割除手术的难度[14]。
IL-6是在缺血缺氧的视网膜环境下，由血管内皮细胞或者血管平滑肌细胞合成与分泌的多功能因子[15]，它在机体免疫调制过程和急性反应过程中起重要的作用，而且它也有引导VEGF分泌的作用[16]。IL-8是一种CXC趋化因子，它被认为是一个中性粒细胞和T淋巴细胞的强效趋化因子激活剂[17]，有促进血管生成和肿瘤转移的作用[18]。Jeon和Lee[19]在其研 究中发现，玻璃体腔注射贝伐单抗后第1天，IL-6、IL-8 浓度明显高于治疗前及治疗后第7天，但第1天与第7天IL-8的浓度变化差异并没有统计学意义,他们认为IL-6的急性升高是眼内视网膜缺血缺氧的共同反应途径，视网膜组织低灌注下IL-6及VEGF等相关因子的代偿性升高，可改善眼底供血，是缺血所导致的调节结果而并非缺血所致并发症。而Petrovič等[20]认为玻璃体切割手术后IL-8的升高可能是视网膜缺血及急性反应所致。本研究中，B组IL-6、IL-8较A组明显升高，说明玻璃体腔注射雷珠单抗7 d后玻璃体液中IL-6、IL-8浓度升高。虽然二者的升高与VEGF值相关度较高，但并不能直接说明是VEGF的降低所导致，也可能是注射时穿刺或药物作用过程中的急性反应，或视网膜缺血缺氧所导致的调节结果，其具体机制仍需要进一步研究。
ICAM-1又名CD54，通常是由内皮细胞或者免疫细胞所释放的细胞表面糖蛋白。DR发展的一个重要初始步骤是白细胞黏附和损伤血管内皮细胞，而最早的损害是由ICAM-1和白细胞整合CD18介导的。ICAM -1通过与不同的细胞因子包括IL-1、肿瘤坏死因子-α、干扰素-γ的相互作用参与免疫激活炎症反应[11, 22]。已有研究证实，PDR患者中ICAM-1通常呈 现高表达，且与血浆HbA1c正相关[23, 24]。Hinton等[25] 认为ICAM-1的浓度与PDR患者黄斑水肿密切相关，是最重要的一个炎性细胞因子。本研究中，B组ICAM-1的浓度明显低于A组，而VEGF的浓度与ICAM-1浓度相关性较高，说明随着玻璃体VEGF浓度的降低，内皮细胞及免疫细胞释放ICAM-1的量明显减少，具体机制尚不清楚。
CTGF在纤维化过程中起着重要作用，它在增生性玻璃体视网膜病变、脉络膜新生血管、PDR中表达均高于正常眼[26]。有研究认为,VEGF会增加CTGF的表达，注射贝伐单抗后可以加速PDR纤维化，引起牵拉性视网膜脱离[27, 28]。Kuiper等[29]的研究也证实VEGF/CTGF在PDR中血管化与纤维化的作用。本研究结果显示，A、B组CTGF浓度差异并无统计学意义,但CTGF/VEGF差异有统计学意义，它的升高可能是导致纤维增生的一个原因。目前文献报道CTGF升高多来自于贝伐单抗，而雷珠单抗治疗PDR的研究资料尚少，本文研究进行了初步探讨，而更精确的资料需要进一步实验。
本研究为前瞻性、对照、非盲法试验。分组为非主动随机，虽然希望能够有一个随机化的过程，但鉴于伦理等原因未采用，可能会产生选择偏倚。我们考虑患者在自主选择治疗方式的时候，经济条件仍然是其主要原因，为尽量减少选择偏倚，所有患者均严格按纳入标准选择，所得结果准确可靠。
