引用本文： 田芳, 东莉洁, 周玉, 王飞, 张晓敏, 李筱荣. 重组腺相关病毒-多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜新生血管形成的抑制作用. 中华眼底病杂志, 2014, 30(5): 504-508. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.05.019 复制
玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是治疗视网膜新生血管性疾病的常用治疗方法。但通常需反复多次注射以维持药物的有效性，因而增加了眼内感染的风险。改变药物剂型以达到并维持眼内有效药物浓度是目前研究热点。我们前期研究已证实多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)可以下调胰岛素样生长因子(IGF)-1刺激后的VEGF表达，并有IGF-1依赖性、即抗VEGF的相对选择性。重组腺相关病毒(rAAV)作为一种基因治疗载体，可整合到人类第19号染色体上并长期表达，使用安全，无致病性和免疫源性[1]。为此，我们采用rAAV载体将PSF转入小鼠视网膜中，观察其对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J小鼠66只，7日龄，雌雄不限，清洁级，中国科学院北京实验动物中心提供；鼠抗PSF单克隆抗体购自美国Sigma公司，鼠抗VEGF 多克隆抗体、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国CST公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce公司，rAAV-PSF载体的构建及病毒的包装、收集、扩增及纯化方法同文献[2]。
采用随机数字表法将18只7日龄小鼠分为正常组、rAAV-PSF注射组、rAAV注射组，每组均为6只。12日龄时，正常组小鼠玻璃体腔注射2 μl生理盐水；rAAV-PSF注射组小鼠玻璃体腔注射病毒滴度为5×1013 pfu/ml的rAAV-PSF 2 μl；rAAV注射组小鼠玻璃体腔注射相同病毒滴度的单纯rAAV载体2 μl。17日龄时处死所有小鼠，摘除眼球提取视网膜组织蛋白，行PSF蛋白表达水平检测。
参照文献[3-5]的方法，依照随机数字表法将48只 7日龄小鼠分为正常组、OIR模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组，每组均为12只。除正常组外，其余7日龄小鼠与哺乳母鼠一同置于氧浓度为(75±2)%的氧箱内。饲养5 d后即小鼠12日龄时取出小鼠转移至正常环境中饲养5 d，建立OIR模型。OIR模型组小鼠出氧箱后不作任何处理；正常组小鼠始终生活在正常氧环境中。12日龄时，OIR rAAV-PSF治疗组小鼠玻璃体腔注射病毒滴度为5×1013 pfu/ml的rAAV-PSF重组载体2 μl；OIR rAAV治疗组小鼠玻璃体腔注射相同病毒滴度的单纯rAAV载体2 μl。17日龄时，各组随机处死6只小鼠，摘除双眼眼球提取视网膜组织蛋白，行VEGF蛋白表达水平检测。
17日龄时正常组、OIR模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组随机处死6只小鼠，摘除双眼眼球，4%多聚甲醛溶液中固定 24 h，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，作6 μm厚度的连续切片，每只眼球取切片10张共计120张行苏木精-伊红(HE)染色。40倍光学显微镜下观察，拍照并保存图像，全视野双盲法计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核,不含玻璃体腔内与内界膜无联系的其他血管内皮细胞核。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠视网膜PSF、VEGF蛋白表达。将各组每只小鼠的视网膜组织分别置于1.5 ml微离心管内，加入100 μl组织裂解液，冰上研磨裂解视网膜组织30 min后，4℃,离心半径13.5 cm，16 000 r/min离心15 min收集上清，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。取变性的蛋白40 μg/孔，10聚丙烯酰氨凝胶电泳，恒压下将蛋白转至聚偏氟乙烯膜后，5% 牛血清白蛋白封闭1 h，分别加入稀释的抗PSF一抗(1 ∶1000)，抗VEGF一抗(1 ∶1000)，抗GAPDH一抗(1 ∶1000)，4℃过夜。洗膜缓冲液(TBST) 洗膜，10 min，共3次，加入1 ∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记IgG(二抗)，孵育1 h。TBST洗膜，10 min，共3次，暗室内ECL发光法检测目的条带，Kodak X光胶片曝光，显影及定影。胶片扫描后，采用Eagle eyeⅡ图像分析仪进行灰度分析，以GAPDH做内对照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。计算方法:目的蛋白质相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析处理。 实验数据以均数±标准差(
2 结果
Western blot检测结果显示，正常组小鼠视网膜组织中存在PSF蛋白内源性表达，玻璃体腔注射rAAV-PSF后可明显提高小鼠视网膜组织中PSF蛋白表达，单纯注射rAAV不影响小鼠视网膜组织中PSF蛋白的表达(图 1A)。正常组小鼠视网膜PSF蛋白表达与rAAV-PSF注射组比较，差异有统计学意义(F=16.05，P=0.001)，与rAAV注射组比较，差异无统计学意义(F=16.05，P=0.890)(图 1B)。玻璃体腔注射rAAV-PSF后，rAAV可以成功介导PSF蛋白在视网膜组织中的高表达。
图1
Western blot检测各组小鼠视网膜PSF蛋白表达及定量分析。1A.各组小鼠视网膜PSF蛋白表达；1B.各组小鼠视网膜PSF蛋白表达定量分析，*:P<0.05。N：正常组；N+E：rAAV注射组；N+P：rAAV-PSF注射组
光学显微镜观察，正常组小鼠仅在极少数切片中可见突破视网膜内界膜到达玻璃体腔的血管内皮细胞核；OIR组小鼠可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核,单独或成簇出现；OIR rAAV治疗组小鼠可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；OIR rAAV-PSF治疗组小鼠视网膜新生血管数量显著减少(图 2)。各组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数比较，正常组与OIR模型组差异有统计学意义(F=101.00，P=0.007)；rAAV-PSF治疗组与OIR模型组差异有统计学意义(F=101.00，P=0.002)；OIR rAAV治疗组与OIR模型组差异无统计学意义(F=101.00，P=0.550)(表 1)。
图2
各组小鼠视网膜组织病理像。2A.正常组，视网膜组织未见新生血管；2B.OIR模型组，血管内皮细胞突破内界膜，形成新生血管；2C.OIR rAAV治疗组，可见新生血管形成；2D.OIR rAAV-PSF治疗组，视网膜组织新生血管数量显著减少 HE ×100
表1
各组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数[(Western blot检测结果显示，正常组小鼠视网膜存在生理源性VEGF蛋白表达；OIR模型组、OIR rAAV组小鼠视网膜VEGF蛋白表达显著升高；OIR rAAV-PSF组小鼠视网膜VEGF蛋白表达显著降低(图 3A)。各组视网膜VEGF蛋白表达比较，正常组与OIR模型组差异有统计学意义(F=13.20，P=0.005)；OIR模型组与OIR rAAV-PSF治疗组差异有统计学意义(F=13.20，P=0.001)；OIR模型组与OIR rAAV组差异无统计学意义(F=13.20，P=0.071)(图 3B)。
图3
Western blot检测各组视网膜VEGF蛋白表达及定量分析。3A.各组小鼠视网膜VEGF蛋白表达；3B.各组小鼠视网膜VEGF蛋白表达定量分析，*:P<0.05。N：正常组；OIR：OIR模型组；OIR+E: OIR rAAV治疗组；OIR+P：OIR rAAV-PSF治疗组
3 讨论
视网膜新生血管性疾病是一组严重致盲性眼病,目前尚无有效药物疗法。大量研究显示，VEGF是视网膜新生血管生成中必不可少的重要诱导因子,视网膜新生血管的发生和消退与VEGF水平密切相关[6, 7]，因此抗VEGF治疗成为基因治疗研究的重点。
PSF为相对分子质量76×103的多功能蛋白[8]，可在多种信号通路中发挥转录抑制因子的作用，如白细胞介素4刺激后，PSF可与信号转导子和转录激活子6 (STAT6)结合形成复合物，进而抑制 IL-4/ STAT6信号通路的转录激活[9]。Lukong等[10]发现，表皮生长因子刺激后，PSF通过与BReast肿瘤激酶(BRK)相结合，参与细胞周期调控。Urban等[11-13]发现PSF可抑制IGF-1诱导的猪粒膜细胞中细胞色素P-450胆固醇侧链分解酶的表达，在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制因子的作用。本研究首次将PSF引入视网膜新生血管性疾病中，并在体外细胞中发现PSF高表达可以抑制IGF-1刺激后的VEGF表达，以及随之产生的血管内皮细胞增生，而我们前期的体外研究证实PSF可以通过抑制视网膜血管内皮细胞中IGF-1/丝裂原活化蛋白激酶通路来下调VEGF的表达，从而抑制视网膜血管内皮细胞的增生。结果还显示，高表达的PSF仅能抑制IGF-1刺激后的猴脉络膜-视网膜内皮细胞增生，并下调VEGF表达，即在IGF-1刺激的前提下，PSF才能发挥上述作用。PSF的IGF-1配体依赖性对于临床的意义较为重大，目前医疗市场上应用的VEGF抑制剂，大多为VEGF单克隆抗体或者VEGF-trap,它们与VEGF的结合不具有时相选择性，无法感应病理水平和生理水平VEGF的差异，而生理水平的VEGF可以维持血管的正常结构和功能，一旦过度抑制，必将对正常血管的功能有所影响，引起一系列的远期并发症。PSF蛋白则与之不同，它可通过感知眼部微环境中IGF-1水平的改变，准确的识别VEGF病理性升高及其生理水平，从而既能有效抑制病理性升高的VEGF，又不影响其生理水平的维持。 因此，PSF有望成为特异性抑制VEGF表达及视网膜新生血管的基因治疗药物新靶点。
为进一步探讨PSF在体内对VEGF的调控，本研究建立OIR模型并进行rAAV-PSF玻璃体腔注射，观察其治疗效果。本研究结果显示，OIR小鼠经玻璃体腔注射rAAV-PSF后，视网膜新生血管形成减少，并下调视网膜组织中VEGF的表达，从而证明PSF可以通过下调VEGF表达抑制视网膜新生血管形成，可能成为预防和治疗视网膜新生血管的一个新靶点。
抗VEGF药物玻璃体腔注射是视网膜新生血管性疾病的常用治疗方法。目前临床应用的VEGF抑制剂大多为VEGF单克隆抗体或者VEGF-trap[14-17],可与VEGF结合并阻断其生物活性，从而抑制新生血管的生成。但通常需反复多次注射以维持药物的有效性，因而增加了眼内感染的风险。缓释药物的开发研究显得迫在眉睫。另外，基因治疗的关键问题之一是选择一种安全、有效、适合于产业化的载体。本研究选择无害病毒rAAV，rAAV在基因治疗的应用上有其它病毒载体或基因导入方法所不具备的优点：(1)无致病性。至今尚无报道质疑rAAV为载体感染哺乳动物细胞的安全性，无论从野生型到重组病毒载体，均没有确定的致病性报道。(2)可以和人的19号染色体整合，从而能够持续表达。(3)可以高效率地感染人的大多数细胞，没有组织特异性。(4)既可以感染分裂细胞，也可以感染静止细胞，不引起明显的炎症和免疫反应；可以耐受pH值的变化以及外界环境中湿度、温度等的变化[2, 18-21]。因此rAAV-PSF将有可能使眼内持续产生PSF，从而长久的发挥抗新生血管作用，以减少临床注射的次数，本研究的时间尚短，仍需后续研究探讨其潜在的缓释前景。
鉴于离体视网膜铺片可以帮助我们客观、完整、形象地观察小鼠视网膜血管形态和分布情况，我们在实验初期曾尝试应用荧光素钠进行实验观察，但由于该化合物分子量低，在行视网膜固定铺片过程中就已大量渗透过血管壁，使整个视网膜组织呈现弥散的绿色荧光，从而不能清楚显示出正常和异常血管，且重复性差。其后又尝试左心室灌注异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)，但其渗透异常血管壁的速度慢，在完成造影及随后的视网膜固定铺片时可清晰地显示正常和异常视网膜血管完整的走行、形态。但该方法动物死亡率极高，且FITC-dextran 的用量大，实验成本较高。通过再次查阅文献，有学者报道球后注射FITC-dextran可较好观察视网膜新生血管，且FITC-dextran用量极低，耗时短，成功率较高[22]。因此，我们将在后续研究中利用该方法行视网膜血管铺片，进一步丰富完善实验数据，明确PSF对于视网膜新生血管的治疗作用。
玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子(VEGF)药物是治疗视网膜新生血管性疾病的常用治疗方法。但通常需反复多次注射以维持药物的有效性，因而增加了眼内感染的风险。改变药物剂型以达到并维持眼内有效药物浓度是目前研究热点。我们前期研究已证实多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子(PSF)可以下调胰岛素样生长因子(IGF)-1刺激后的VEGF表达，并有IGF-1依赖性、即抗VEGF的相对选择性。重组腺相关病毒(rAAV)作为一种基因治疗载体，可整合到人类第19号染色体上并长期表达，使用安全，无致病性和免疫源性[1]。为此，我们采用rAAV载体将PSF转入小鼠视网膜中，观察其对氧诱导视网膜新生血管的抑制作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
C57BL/6J小鼠66只，7日龄，雌雄不限，清洁级，中国科学院北京实验动物中心提供；鼠抗PSF单克隆抗体购自美国Sigma公司，鼠抗VEGF 多克隆抗体、小鼠抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体购自美国CST公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒购自美国Pierce公司，rAAV-PSF载体的构建及病毒的包装、收集、扩增及纯化方法同文献[2]。
采用随机数字表法将18只7日龄小鼠分为正常组、rAAV-PSF注射组、rAAV注射组，每组均为6只。12日龄时，正常组小鼠玻璃体腔注射2 μl生理盐水；rAAV-PSF注射组小鼠玻璃体腔注射病毒滴度为5×1013 pfu/ml的rAAV-PSF 2 μl；rAAV注射组小鼠玻璃体腔注射相同病毒滴度的单纯rAAV载体2 μl。17日龄时处死所有小鼠，摘除眼球提取视网膜组织蛋白，行PSF蛋白表达水平检测。
参照文献[3-5]的方法，依照随机数字表法将48只 7日龄小鼠分为正常组、OIR模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组，每组均为12只。除正常组外，其余7日龄小鼠与哺乳母鼠一同置于氧浓度为(75±2)%的氧箱内。饲养5 d后即小鼠12日龄时取出小鼠转移至正常环境中饲养5 d，建立OIR模型。OIR模型组小鼠出氧箱后不作任何处理；正常组小鼠始终生活在正常氧环境中。12日龄时，OIR rAAV-PSF治疗组小鼠玻璃体腔注射病毒滴度为5×1013 pfu/ml的rAAV-PSF重组载体2 μl；OIR rAAV治疗组小鼠玻璃体腔注射相同病毒滴度的单纯rAAV载体2 μl。17日龄时，各组随机处死6只小鼠，摘除双眼眼球提取视网膜组织蛋白，行VEGF蛋白表达水平检测。
17日龄时正常组、OIR模型组、OIR rAAV-PSF治疗组、OIR rAAV治疗组随机处死6只小鼠，摘除双眼眼球，4%多聚甲醛溶液中固定 24 h，常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，作6 μm厚度的连续切片，每只眼球取切片10张共计120张行苏木精-伊红(HE)染色。40倍光学显微镜下观察，拍照并保存图像，全视野双盲法计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数。计数血管内皮细胞核时仅计数与内界膜有紧密联系的细胞核,不含玻璃体腔内与内界膜无联系的其他血管内皮细胞核。
蛋白免疫印迹法(Western blot)检测小鼠视网膜PSF、VEGF蛋白表达。将各组每只小鼠的视网膜组织分别置于1.5 ml微离心管内，加入100 μl组织裂解液，冰上研磨裂解视网膜组织30 min后，4℃,离心半径13.5 cm，16 000 r/min离心15 min收集上清，BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。取变性的蛋白40 μg/孔，10聚丙烯酰氨凝胶电泳，恒压下将蛋白转至聚偏氟乙烯膜后，5% 牛血清白蛋白封闭1 h，分别加入稀释的抗PSF一抗(1 ∶1000)，抗VEGF一抗(1 ∶1000)，抗GAPDH一抗(1 ∶1000)，4℃过夜。洗膜缓冲液(TBST) 洗膜，10 min，共3次，加入1 ∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记IgG(二抗)，孵育1 h。TBST洗膜，10 min，共3次，暗室内ECL发光法检测目的条带，Kodak X光胶片曝光，显影及定影。胶片扫描后，采用Eagle eyeⅡ图像分析仪进行灰度分析，以GAPDH做内对照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。计算方法:目的蛋白质相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
采用SPSS 18.0统计软件包进行统计学分析处理。 实验数据以均数±标准差(
2 结果
Western blot检测结果显示，正常组小鼠视网膜组织中存在PSF蛋白内源性表达，玻璃体腔注射rAAV-PSF后可明显提高小鼠视网膜组织中PSF蛋白表达，单纯注射rAAV不影响小鼠视网膜组织中PSF蛋白的表达(图 1A)。正常组小鼠视网膜PSF蛋白表达与rAAV-PSF注射组比较，差异有统计学意义(F=16.05，P=0.001)，与rAAV注射组比较，差异无统计学意义(F=16.05，P=0.890)(图 1B)。玻璃体腔注射rAAV-PSF后，rAAV可以成功介导PSF蛋白在视网膜组织中的高表达。
图1
Western blot检测各组小鼠视网膜PSF蛋白表达及定量分析。1A.各组小鼠视网膜PSF蛋白表达；1B.各组小鼠视网膜PSF蛋白表达定量分析，*:P<0.05。N：正常组；N+E：rAAV注射组；N+P：rAAV-PSF注射组
光学显微镜观察，正常组小鼠仅在极少数切片中可见突破视网膜内界膜到达玻璃体腔的血管内皮细胞核；OIR组小鼠可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核,单独或成簇出现；OIR rAAV治疗组小鼠可见较多突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核；OIR rAAV-PSF治疗组小鼠视网膜新生血管数量显著减少(图 2)。各组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数比较，正常组与OIR模型组差异有统计学意义(F=101.00，P=0.007)；rAAV-PSF治疗组与OIR模型组差异有统计学意义(F=101.00，P=0.002)；OIR rAAV治疗组与OIR模型组差异无统计学意义(F=101.00，P=0.550)(表 1)。
图2
各组小鼠视网膜组织病理像。2A.正常组，视网膜组织未见新生血管；2B.OIR模型组，血管内皮细胞突破内界膜，形成新生血管；2C.OIR rAAV治疗组，可见新生血管形成；2D.OIR rAAV-PSF治疗组，视网膜组织新生血管数量显著减少 HE ×100
表1
各组突破内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数[(Western blot检测结果显示，正常组小鼠视网膜存在生理源性VEGF蛋白表达；OIR模型组、OIR rAAV组小鼠视网膜VEGF蛋白表达显著升高；OIR rAAV-PSF组小鼠视网膜VEGF蛋白表达显著降低(图 3A)。各组视网膜VEGF蛋白表达比较，正常组与OIR模型组差异有统计学意义(F=13.20，P=0.005)；OIR模型组与OIR rAAV-PSF治疗组差异有统计学意义(F=13.20，P=0.001)；OIR模型组与OIR rAAV组差异无统计学意义(F=13.20，P=0.071)(图 3B)。
图3
Western blot检测各组视网膜VEGF蛋白表达及定量分析。3A.各组小鼠视网膜VEGF蛋白表达；3B.各组小鼠视网膜VEGF蛋白表达定量分析，*:P<0.05。N：正常组；OIR：OIR模型组；OIR+E: OIR rAAV治疗组；OIR+P：OIR rAAV-PSF治疗组
3 讨论
视网膜新生血管性疾病是一组严重致盲性眼病,目前尚无有效药物疗法。大量研究显示，VEGF是视网膜新生血管生成中必不可少的重要诱导因子,视网膜新生血管的发生和消退与VEGF水平密切相关[6, 7]，因此抗VEGF治疗成为基因治疗研究的重点。
PSF为相对分子质量76×103的多功能蛋白[8]，可在多种信号通路中发挥转录抑制因子的作用，如白细胞介素4刺激后，PSF可与信号转导子和转录激活子6 (STAT6)结合形成复合物，进而抑制 IL-4/ STAT6信号通路的转录激活[9]。Lukong等[10]发现，表皮生长因子刺激后，PSF通过与BReast肿瘤激酶(BRK)相结合，参与细胞周期调控。Urban等[11-13]发现PSF可抑制IGF-1诱导的猪粒膜细胞中细胞色素P-450胆固醇侧链分解酶的表达，在IGF-1信号转导的过程中发挥转录抑制因子的作用。本研究首次将PSF引入视网膜新生血管性疾病中，并在体外细胞中发现PSF高表达可以抑制IGF-1刺激后的VEGF表达，以及随之产生的血管内皮细胞增生，而我们前期的体外研究证实PSF可以通过抑制视网膜血管内皮细胞中IGF-1/丝裂原活化蛋白激酶通路来下调VEGF的表达，从而抑制视网膜血管内皮细胞的增生。结果还显示，高表达的PSF仅能抑制IGF-1刺激后的猴脉络膜-视网膜内皮细胞增生，并下调VEGF表达，即在IGF-1刺激的前提下，PSF才能发挥上述作用。PSF的IGF-1配体依赖性对于临床的意义较为重大，目前医疗市场上应用的VEGF抑制剂，大多为VEGF单克隆抗体或者VEGF-trap,它们与VEGF的结合不具有时相选择性，无法感应病理水平和生理水平VEGF的差异，而生理水平的VEGF可以维持血管的正常结构和功能，一旦过度抑制，必将对正常血管的功能有所影响，引起一系列的远期并发症。PSF蛋白则与之不同，它可通过感知眼部微环境中IGF-1水平的改变，准确的识别VEGF病理性升高及其生理水平，从而既能有效抑制病理性升高的VEGF，又不影响其生理水平的维持。 因此，PSF有望成为特异性抑制VEGF表达及视网膜新生血管的基因治疗药物新靶点。
为进一步探讨PSF在体内对VEGF的调控，本研究建立OIR模型并进行rAAV-PSF玻璃体腔注射，观察其治疗效果。本研究结果显示，OIR小鼠经玻璃体腔注射rAAV-PSF后，视网膜新生血管形成减少，并下调视网膜组织中VEGF的表达，从而证明PSF可以通过下调VEGF表达抑制视网膜新生血管形成，可能成为预防和治疗视网膜新生血管的一个新靶点。
抗VEGF药物玻璃体腔注射是视网膜新生血管性疾病的常用治疗方法。目前临床应用的VEGF抑制剂大多为VEGF单克隆抗体或者VEGF-trap[14-17],可与VEGF结合并阻断其生物活性，从而抑制新生血管的生成。但通常需反复多次注射以维持药物的有效性，因而增加了眼内感染的风险。缓释药物的开发研究显得迫在眉睫。另外，基因治疗的关键问题之一是选择一种安全、有效、适合于产业化的载体。本研究选择无害病毒rAAV，rAAV在基因治疗的应用上有其它病毒载体或基因导入方法所不具备的优点：(1)无致病性。至今尚无报道质疑rAAV为载体感染哺乳动物细胞的安全性，无论从野生型到重组病毒载体，均没有确定的致病性报道。(2)可以和人的19号染色体整合，从而能够持续表达。(3)可以高效率地感染人的大多数细胞，没有组织特异性。(4)既可以感染分裂细胞，也可以感染静止细胞，不引起明显的炎症和免疫反应；可以耐受pH值的变化以及外界环境中湿度、温度等的变化[2, 18-21]。因此rAAV-PSF将有可能使眼内持续产生PSF，从而长久的发挥抗新生血管作用，以减少临床注射的次数，本研究的时间尚短，仍需后续研究探讨其潜在的缓释前景。
鉴于离体视网膜铺片可以帮助我们客观、完整、形象地观察小鼠视网膜血管形态和分布情况，我们在实验初期曾尝试应用荧光素钠进行实验观察，但由于该化合物分子量低，在行视网膜固定铺片过程中就已大量渗透过血管壁，使整个视网膜组织呈现弥散的绿色荧光，从而不能清楚显示出正常和异常血管，且重复性差。其后又尝试左心室灌注异硫氰酸荧光素葡聚糖(FITC-dextran)，但其渗透异常血管壁的速度慢，在完成造影及随后的视网膜固定铺片时可清晰地显示正常和异常视网膜血管完整的走行、形态。但该方法动物死亡率极高，且FITC-dextran 的用量大，实验成本较高。通过再次查阅文献，有学者报道球后注射FITC-dextran可较好观察视网膜新生血管，且FITC-dextran用量极低，耗时短，成功率较高[22]。因此，我们将在后续研究中利用该方法行视网膜血管铺片，进一步丰富完善实验数据，明确PSF对于视网膜新生血管的治疗作用。
