Leber先天性黑矇(LCA)Ⅱ型以临床表现多样化与遗传异质性为主要特点。视网膜色素上皮细胞65(RPE65)基因是唯一能进行LCAⅡ型基因治疗临床试验的靶基因,在此基础上开展的临床试验结果已显示出一定的安全性和有效性。经视网膜下腔注射携带有RPE65基因的重组腺病毒载体后,患者均未发生眼部炎症及全身系统性免疫排斥反应等严重不良反应,且其视力、视野、视网膜光敏感度、瞳孔对光反射、眼球震颤、视觉行为等均有改善。但其在如何降低基因治疗本身对视网膜结构和功能的损害等方面仍然面临诸多挑战。
引用本文： 吴艺君, 郑钦象, 李文生. Leber先天性黑矇Ⅱ型基因治疗进展. 中华眼底病杂志, 2014, 30(5): 532-534. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.05.030 复制
Leber先天性黑矇(LCA)是一种导致儿童先天性双眼盲的遗传性眼病[1]。目前已确定了15种LCA的致病基因[2, 3]。由视网膜色素上皮细胞65(RPE65)基因突变导致的LCA称为LCAⅡ型，约占LCA的6%[1]。基因治疗可在一定程度上改善LCAⅡ型患者视功能，但其确切治疗方案目前尚不明确。现就LCAⅡ型基因治疗在患者视功能改善、视网膜结构改变、眼部及全身并发症情况等方面作一综述。
1 LCAⅡ型基因治疗的临床试验概况
RPE65基因编码的蛋白在RPE细胞上特异性表达并具有异构酶活性，RPE65基因突变将导致RPE65失去异构酶活性，阻断视循环导致光感受器细胞不能对光发生反应，随着病程的进展，光感受器细胞最终发生变性。在前期大量动物实验研究的基础上，目前已有较多研究开展了LCAⅡ型基因治疗的临床试验，并取得了初步成果。这些研究均以视功能较差眼作为试验眼，对侧眼作为对照眼。经视网膜下腔注射携带有RPE65基因的重组腺病毒载体(rAAV)，只是注射的位置、浓度、含量、次数、启动子等有所不同。费城儿童医院启动的临床试验(CHOP1研究组)[4-7]和费城儿童医院启动的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(CHOP2研究组)[8]重组子由CBA启动子、rAAV2和人RPE65(hRPE65)组成。宾夕法尼亚大学和美国国家眼科研究所合作的Ⅰ期临床试验(Upenn/UFL研究组)[9-13]和以色列哈桑医学组织启动的Ⅰ期临床试验(HMO研究组)[14]重组子由CBSB启动子、rAAV2和hRPE65组成。英国伦敦大学学院和摩菲尔兹眼科医院合作的临床试验(UCL/MEH研究组)[15]重组子由hRPE65启动子、rAAV2和hRPE65组成。各项临床试验均采用早期糖尿病视网膜病变治疗研究组视力表测量患者视力，之后定期随访视力、视野暗适应1 h蓝光刺激下的全视野视网膜敏感性(FST)、视网膜电图(ERG)及眼部、全身系统性并发症情况。
2 LCAⅡ基因治疗临床试验的主要结果
2.1 视力
CHOP1研究组观察发现，12例患者于治疗后2周主观感觉在微暗环境中注射眼的视力提高[4-7]。低剂量(1.5×1010vg)注射组的3例患者中，1只注射眼治疗后150 d视力提高了0.28个最小分辨角对数(logMAR)视力单位；1只注射眼治疗后80 d视力提高了0.45个logMAR单位，其对照眼视力提高了0.36个logMAR单位；1只注射眼治疗后45 d视力提高了0.34个logMAR单位[4, 5]。治疗后18个月，所有注射眼视力又分别提高了0.21、0.19、0.24个logMAR单位[6]。中剂量(4.8×1010vg)注射组的6例患者中，治疗后2周注射眼视力提高3例，对照眼视力无明显改善；高剂量(1.5×1011vg)注射组的3例患者中，治疗后2周注射眼视力提高1例，对照眼视力无明显改善[5, 6]。
Upenn/UFL研究组最初观察发现，因手术损伤的3只眼在基因注射治疗后，其视力较治疗前的基线水平下降。在视力恢复过程中，1只注射眼在治疗后90 d视力恢复至基线水平，1只注射眼在治疗后90 d较治疗前无明显改变，1只注射眼在治疗后7 d视力恢复至基线水平[9]。1年后3只注射眼的视力与治疗后90 d时比较，并无明显变化[11, 13]。其后续研究发现，15只注射眼的平均logMAR视力由治疗前的1.09 提高至0.97，而对照眼平均logMAR视力由治疗前的0.96 提高至0.91；治疗前后平均logMAR视力比较，差异均有统计学意义[9-13]。关于对侧眼视力提高的现象在动物实验中也有发生。Narfstrm等[16, 17]对RPE65-/-犬进行了单眼基因治疗，未治疗的对侧眼明适应b波在晚期随访过程中也提高至正常值的39%。推测其可能的原因是：(1)基因治疗眼转染细胞分泌的RPE65蛋白后，该蛋白通过视神经运输至大脑组织，再逆行运输至对侧眼视网膜；(2)基因治疗眼持续向外周血中释放11-顺-视黄醛，然后被对侧眼所摄取。UCL/MEH 研究组观察发现，注射眼和对照眼视力在治疗后6、12个月均无明显提高[14]。CHOP2研究组对对照眼行高剂量基因注射治疗，发现基因治疗第二眼同样具有安全性及有效性[8]。
2.2 障碍物绕行试验
CHOP1研究组观察发现，患者仅使用注射眼完成障碍物绕行试验所需时间较治疗前缩短，出错率减少，但对照眼无改善[4-6]。Upenn/UFL研究组比较了接受单眼2次注射的5例患者治疗前后双眼障碍物绕行试验出错差值，发现在光照强度100.0 Lux条件下，注射眼和对照眼在治疗前后均可顺利完成障碍物绕行试验[9-13]。在光照强度0.2～4.0 Lux条件下，2例患者治疗后使用注射眼障碍物绕行试验，表现优于其对照眼；在光照强度0.2 Lux条件下，1例患者治疗后使用注射眼障碍物绕行试验，表现较治疗前也有改善[12]。UCL/MEH研究组观察发现，1例患者在注射后5、6个月完成障碍物绕行试验所用的时间从治疗前77 s缩短为14 s，出错次数从治疗前8次减少为0次[15]。CHOP2研究组观察发现，2例患者治疗前双眼均不能顺利完成障碍物绕行试验，经再次注射治疗后注射眼均可在光照强度10.0 Lux条件下顺利完成试验，其中1例患者还可在光照强度5.0 Lux条件下顺利完成试验，随访6个月情况保持稳定[8]。
2.3 FST
CHOP1研究组观察发现，中剂量组及高剂量组患者的FST较对照眼明显提高，且年龄越小，提高幅度越大[5, 6]。8～11岁年龄组注射眼FST较对照眼平均提高2.20个log单位，12～44岁年龄组注射眼FST较对照眼平均提高1.20 log单位[5, 6]。UPenn/UFL研究组观察发现，15只注射眼FST均在治疗后短期内提高[9-13]。注射眼对蓝光刺激的FST提高了1.59 个log单位，对红光刺激的FST提高了0.45 log单位，分别在随访时间1～3个月和1～3年内保持稳定，对照眼均无明显改善[9-13]。HMO研究组观察发现，1只注射眼治疗后15 d FST显著提高并且保持到治疗后90 d，对照眼无明显改变[14]。CHOP2研究组观察发现，再次注射眼对白光和蓝光的FST均提高，1只首次注射眼对红光的FST提高，另1只首次注射眼对蓝光的FST下降[8]。
2.4 视野及微视野
CHOP1研究组利用Goldmann 视野计测量发现，12只注射眼中，分别有10、11只注射眼于治疗后30.0、112.5 d视野扩大，治疗后142.5 d时所有注射眼视野扩大。低剂量组3只注射眼在治疗后18个月视野无下降 [4-7]。Upenn/UFL研究组观察发现，低剂量组3只注射眼视野均有提高，且治疗后1、3年视野均无下降[9-13]。该组后期入选的12只注射眼视野均有提高，特别在基因注射部位视网膜所对应视觉方向表现为光敏感度增强 [10-13]。UCL/MEH组利用改良式Humphrey视野测量仪检测发现，仅有1只注射眼暗适应条件下视野改善，其余注射眼视野均无明显改善[15]。37个测量位点在治疗后6个月光敏感度增强，颞下和鼻下18个测量位点的光敏感度增强约100倍[15]。其再利用Nidek MP1自动微视野计测量发现，1只注射眼微视野在6个月后较治疗前改善，最小视标的亮度为注射之前的1/25[15]。CHOP2研究组观察发现，2只再次注射眼在治疗后90 d视野有改善。
2.5 ERG
动物实验研究发现，注射眼ERG有明显改善[18]。与之不同，所有临床试验研究发现治疗前后均无法检测到注射眼的ERG反应。CHOP1研究组也只在2只注射眼中检测到多焦ERG反应，而对照眼仍无法被检测[4-6]。这可能与受试眼视功能较差，处于疾病晚期的光感受器大部分已变性有关。
2.6 瞳孔对光反射
CHOP1研究组研究结果显示，3只注射眼在治疗后30.0、82.5、142.5 d有明显改善；其中1只注射眼在光照强度0.04 Lux条件下瞳孔直接对光反射改善，具体表现为对同强度光刺激，注射眼瞳孔收缩幅度均比对照眼大，而对照眼瞳孔对光反射无明显改善[4]。有瞳孔对光反射的注射眼，最短在注射后7 d瞳孔反射开始改善，最长随访至545.0 d仍有改善，且至少提高2个log单位；其中1例8岁患者注射眼瞳孔对光反射水平与同龄人相当[4-7]。Upenn/UFL研究组观察发现，15例患者注射眼暗环境瞳孔对光反射较治疗前改善，瞳孔对绿光反射幅度从-6.6提高至2.3 log单位[9-12]。CHOP2研究组观察发现，3只再次注射眼瞳孔对光反射均有改善，瞳孔收缩幅度增加[8]。
2.7 视网膜结构改变
Upenn/UFL研究组观察发现，治疗后3个月3只注射眼视功能恢复与视网膜结构并不平行，不能改善已经发生变性和丢失光感受器细胞所致的视网膜内层变薄[9]。其后续研究结果显示，15例患者中虽然部分患者视力提高，但黄斑中心凹厚度无明显增加；出现黄斑部视网膜脱离的2只注射眼在治疗后90 d、3年黄斑中心凹厚度仍不明原因的变薄，其余13只注射眼黄斑中心凹厚度无明显变化；15只对照眼黄斑中心凹厚度也无明显变化。虽然基因治疗不能增加视网膜外核层厚度和光感受器细胞数量，但可以有效补充视循环中缺失RPE65蛋白，从而改善视功能。而观察到视网膜厚度变薄可能与注射前存在的视网膜前膜或视网膜水肿有关系[11-13]。Upenn/UFL研究组观察发现，1例患者出现了“伪黄斑”，表现为在低强度光照下，注射部位视网膜局部注视更加稳定，提示基因治疗注射位点视功能恢复的幅度更高[9, 12]。这为基因注射视网膜位置选择提供了一定的参考价值。
2.8 其他
部分患者眼球震颤减轻、眼位偏斜改善[4, 6, 8, 15]、视皮质功能性磁共振面积增加[7, 8]。
3 LCAⅡ型基因治疗临床试验的安全性
3.1 视网膜、脉络膜脱离及黄斑裂孔
CHOP1研究组观察发现，12例患者的视网膜脱离于治疗后14 h恢复[4-6]。Upenn/UFL研究组观察发现，3例患者的视网膜下积液于治疗后5～6 h吸收[9]。Upenn/UFL研究组于2011年补充报道了12例患者，发现1例患者的视网膜脱离在治疗后1 d恢复；1例患者在手术后3 d发生脉络膜脱离，给予眼表局部糖皮质激素抗炎、睫状肌麻痹剂和β阻滞剂控制眼压，于治疗后238 d脉络膜恢复正常[12, 13]。UCL/MEH研究组观察发现，3例患者的视网膜脱离于治疗后24 h基本恢复[15]。
CHOP1研究组观察发现，1例患者经低剂量注射治疗后5 d黄斑中心凹处薄层囊泡形成，治疗后14 d黄斑裂孔形成，治疗后18个月黄斑裂孔虽然未扩大，但是裂孔形成并未阻止视力提高[4-6]。分析原因是该患者黄斑裂孔形成与载体毒性无关，可能与注射之前就已经存在视网膜前膜经注射刺激后收缩牵拉所致。治疗后8 d，1例患者经中剂量注射治疗后黄斑中心凹裂孔恢复。
3.2 眼部炎症及系统性免疫排斥反应
CHOP1研究组于治疗后第1天仅在1例经低剂量注射治疗的患者泪液中检测到rAAV2的DNA序列，但其并未引起特异性炎症反应；多数患者只出现一过性与手术相关的炎症反应[4-6]。该研究还发现，1例患者经低剂量注射治疗后外周血抗体滴度升高，但随着时间延长逐渐消失；2例患者早期有轻度抗体滴度升高，但之后逐渐降低，手术后1年降至基线水平[4-6]。Upenn/ UFL研究组观察发现，1例患者治疗后90 d抗体滴度较治疗前提高4.5～7.5倍，外周淋巴细胞反应指数由治疗前1.89提高至2.10[9]。1年后全身检查和血尿检查无异常，抗体滴度以及外周淋巴细胞反应均与治疗前接近[11]。之后该研究组又补充报道了12例患者视网膜下腔注射rAAV2引起的体液免疫反应，1例患者治疗后90 d抗体滴度大于基线的60%，4例患者抗体滴度在一定时间内升高后又恢复至正常水平，外周淋巴细胞反应检测中仅有2例患者较治疗前略有增高[12, 13]。UCL/MEH研究组在治疗后1、30 d对3例患者的泪液、唾液、血清以及精液行聚合酶连反应检测，未见病毒载体播散；其中2例患者出现小量非特异性T细胞增高，这与糖皮质激素停药后的反应一致[15]。CHOP2研究组对3例患者对照眼再次行视网膜下腔注射，发现患者的早期血液和泪液中载体DNA序列低度阳性，但在注射后3 d均恢复至阴性；1例患者在注射6周时对rAAV2和RPE65蛋白有T细胞免疫反应，1例患者在注射5周时对RPE65蛋白有T细胞免疫反应；但以上所有患者血清中均未检测到对RPE65基因表达产物的抗体[8]。表明rAAV2无全身和眼部严重不良反应，但其对目的基因的包装能力较差，这可能会影响基因治疗的效率。
4 LCAⅡ型基因治疗临床试验存在的问题
目前LCAⅡ型基因治疗的临床试验还有许多问题需要进一步研究解决，如现有试验均以较差眼作为注射眼，缺乏随机化原则；尽管rAAV2无全身和眼部严重不良反应，但其对目的基因的包装能力较差，可能会影响基因治疗的效率；基因治疗改善个体视功能的程度有限，且长期效果需进一步随访观察；视网膜下腔基因注射可对视网膜残留的光感受器造成损伤，有进一步恶化视功能的风险。今后能否设计出转染效率更高、特异性更强的载体，仅通过玻璃体腔注射即可转染到视网膜组织细胞中还有待进一步研究。总之，LCAⅡ型基因治疗在选择合适的患者以及如何尽量降低基因治疗本身对视网膜结构和功能的损害等方面仍然面临诸多挑战。
Leber先天性黑矇(LCA)是一种导致儿童先天性双眼盲的遗传性眼病[1]。目前已确定了15种LCA的致病基因[2, 3]。由视网膜色素上皮细胞65(RPE65)基因突变导致的LCA称为LCAⅡ型，约占LCA的6%[1]。基因治疗可在一定程度上改善LCAⅡ型患者视功能，但其确切治疗方案目前尚不明确。现就LCAⅡ型基因治疗在患者视功能改善、视网膜结构改变、眼部及全身并发症情况等方面作一综述。
1 LCAⅡ型基因治疗的临床试验概况
RPE65基因编码的蛋白在RPE细胞上特异性表达并具有异构酶活性，RPE65基因突变将导致RPE65失去异构酶活性，阻断视循环导致光感受器细胞不能对光发生反应，随着病程的进展，光感受器细胞最终发生变性。在前期大量动物实验研究的基础上，目前已有较多研究开展了LCAⅡ型基因治疗的临床试验，并取得了初步成果。这些研究均以视功能较差眼作为试验眼，对侧眼作为对照眼。经视网膜下腔注射携带有RPE65基因的重组腺病毒载体(rAAV)，只是注射的位置、浓度、含量、次数、启动子等有所不同。费城儿童医院启动的临床试验(CHOP1研究组)[4-7]和费城儿童医院启动的Ⅰ/Ⅱ期临床试验(CHOP2研究组)[8]重组子由CBA启动子、rAAV2和人RPE65(hRPE65)组成。宾夕法尼亚大学和美国国家眼科研究所合作的Ⅰ期临床试验(Upenn/UFL研究组)[9-13]和以色列哈桑医学组织启动的Ⅰ期临床试验(HMO研究组)[14]重组子由CBSB启动子、rAAV2和hRPE65组成。英国伦敦大学学院和摩菲尔兹眼科医院合作的临床试验(UCL/MEH研究组)[15]重组子由hRPE65启动子、rAAV2和hRPE65组成。各项临床试验均采用早期糖尿病视网膜病变治疗研究组视力表测量患者视力，之后定期随访视力、视野暗适应1 h蓝光刺激下的全视野视网膜敏感性(FST)、视网膜电图(ERG)及眼部、全身系统性并发症情况。
2 LCAⅡ基因治疗临床试验的主要结果
2.1 视力
CHOP1研究组观察发现，12例患者于治疗后2周主观感觉在微暗环境中注射眼的视力提高[4-7]。低剂量(1.5×1010vg)注射组的3例患者中，1只注射眼治疗后150 d视力提高了0.28个最小分辨角对数(logMAR)视力单位；1只注射眼治疗后80 d视力提高了0.45个logMAR单位，其对照眼视力提高了0.36个logMAR单位；1只注射眼治疗后45 d视力提高了0.34个logMAR单位[4, 5]。治疗后18个月，所有注射眼视力又分别提高了0.21、0.19、0.24个logMAR单位[6]。中剂量(4.8×1010vg)注射组的6例患者中，治疗后2周注射眼视力提高3例，对照眼视力无明显改善；高剂量(1.5×1011vg)注射组的3例患者中，治疗后2周注射眼视力提高1例，对照眼视力无明显改善[5, 6]。
Upenn/UFL研究组最初观察发现，因手术损伤的3只眼在基因注射治疗后，其视力较治疗前的基线水平下降。在视力恢复过程中，1只注射眼在治疗后90 d视力恢复至基线水平，1只注射眼在治疗后90 d较治疗前无明显改变，1只注射眼在治疗后7 d视力恢复至基线水平[9]。1年后3只注射眼的视力与治疗后90 d时比较，并无明显变化[11, 13]。其后续研究发现，15只注射眼的平均logMAR视力由治疗前的1.09 提高至0.97，而对照眼平均logMAR视力由治疗前的0.96 提高至0.91；治疗前后平均logMAR视力比较，差异均有统计学意义[9-13]。关于对侧眼视力提高的现象在动物实验中也有发生。Narfstrm等[16, 17]对RPE65-/-犬进行了单眼基因治疗，未治疗的对侧眼明适应b波在晚期随访过程中也提高至正常值的39%。推测其可能的原因是：(1)基因治疗眼转染细胞分泌的RPE65蛋白后，该蛋白通过视神经运输至大脑组织，再逆行运输至对侧眼视网膜；(2)基因治疗眼持续向外周血中释放11-顺-视黄醛，然后被对侧眼所摄取。UCL/MEH 研究组观察发现，注射眼和对照眼视力在治疗后6、12个月均无明显提高[14]。CHOP2研究组对对照眼行高剂量基因注射治疗，发现基因治疗第二眼同样具有安全性及有效性[8]。
2.2 障碍物绕行试验
CHOP1研究组观察发现，患者仅使用注射眼完成障碍物绕行试验所需时间较治疗前缩短，出错率减少，但对照眼无改善[4-6]。Upenn/UFL研究组比较了接受单眼2次注射的5例患者治疗前后双眼障碍物绕行试验出错差值，发现在光照强度100.0 Lux条件下，注射眼和对照眼在治疗前后均可顺利完成障碍物绕行试验[9-13]。在光照强度0.2～4.0 Lux条件下，2例患者治疗后使用注射眼障碍物绕行试验，表现优于其对照眼；在光照强度0.2 Lux条件下，1例患者治疗后使用注射眼障碍物绕行试验，表现较治疗前也有改善[12]。UCL/MEH研究组观察发现，1例患者在注射后5、6个月完成障碍物绕行试验所用的时间从治疗前77 s缩短为14 s，出错次数从治疗前8次减少为0次[15]。CHOP2研究组观察发现，2例患者治疗前双眼均不能顺利完成障碍物绕行试验，经再次注射治疗后注射眼均可在光照强度10.0 Lux条件下顺利完成试验，其中1例患者还可在光照强度5.0 Lux条件下顺利完成试验，随访6个月情况保持稳定[8]。
2.3 FST
CHOP1研究组观察发现，中剂量组及高剂量组患者的FST较对照眼明显提高，且年龄越小，提高幅度越大[5, 6]。8～11岁年龄组注射眼FST较对照眼平均提高2.20个log单位，12～44岁年龄组注射眼FST较对照眼平均提高1.20 log单位[5, 6]。UPenn/UFL研究组观察发现，15只注射眼FST均在治疗后短期内提高[9-13]。注射眼对蓝光刺激的FST提高了1.59 个log单位，对红光刺激的FST提高了0.45 log单位，分别在随访时间1～3个月和1～3年内保持稳定，对照眼均无明显改善[9-13]。HMO研究组观察发现，1只注射眼治疗后15 d FST显著提高并且保持到治疗后90 d，对照眼无明显改变[14]。CHOP2研究组观察发现，再次注射眼对白光和蓝光的FST均提高，1只首次注射眼对红光的FST提高，另1只首次注射眼对蓝光的FST下降[8]。
2.4 视野及微视野
CHOP1研究组利用Goldmann 视野计测量发现，12只注射眼中，分别有10、11只注射眼于治疗后30.0、112.5 d视野扩大，治疗后142.5 d时所有注射眼视野扩大。低剂量组3只注射眼在治疗后18个月视野无下降 [4-7]。Upenn/UFL研究组观察发现，低剂量组3只注射眼视野均有提高，且治疗后1、3年视野均无下降[9-13]。该组后期入选的12只注射眼视野均有提高，特别在基因注射部位视网膜所对应视觉方向表现为光敏感度增强 [10-13]。UCL/MEH组利用改良式Humphrey视野测量仪检测发现，仅有1只注射眼暗适应条件下视野改善，其余注射眼视野均无明显改善[15]。37个测量位点在治疗后6个月光敏感度增强，颞下和鼻下18个测量位点的光敏感度增强约100倍[15]。其再利用Nidek MP1自动微视野计测量发现，1只注射眼微视野在6个月后较治疗前改善，最小视标的亮度为注射之前的1/25[15]。CHOP2研究组观察发现，2只再次注射眼在治疗后90 d视野有改善。
2.5 ERG
动物实验研究发现，注射眼ERG有明显改善[18]。与之不同，所有临床试验研究发现治疗前后均无法检测到注射眼的ERG反应。CHOP1研究组也只在2只注射眼中检测到多焦ERG反应，而对照眼仍无法被检测[4-6]。这可能与受试眼视功能较差，处于疾病晚期的光感受器大部分已变性有关。
2.6 瞳孔对光反射
CHOP1研究组研究结果显示，3只注射眼在治疗后30.0、82.5、142.5 d有明显改善；其中1只注射眼在光照强度0.04 Lux条件下瞳孔直接对光反射改善，具体表现为对同强度光刺激，注射眼瞳孔收缩幅度均比对照眼大，而对照眼瞳孔对光反射无明显改善[4]。有瞳孔对光反射的注射眼，最短在注射后7 d瞳孔反射开始改善，最长随访至545.0 d仍有改善，且至少提高2个log单位；其中1例8岁患者注射眼瞳孔对光反射水平与同龄人相当[4-7]。Upenn/UFL研究组观察发现，15例患者注射眼暗环境瞳孔对光反射较治疗前改善，瞳孔对绿光反射幅度从-6.6提高至2.3 log单位[9-12]。CHOP2研究组观察发现，3只再次注射眼瞳孔对光反射均有改善，瞳孔收缩幅度增加[8]。
2.7 视网膜结构改变
Upenn/UFL研究组观察发现，治疗后3个月3只注射眼视功能恢复与视网膜结构并不平行，不能改善已经发生变性和丢失光感受器细胞所致的视网膜内层变薄[9]。其后续研究结果显示，15例患者中虽然部分患者视力提高，但黄斑中心凹厚度无明显增加；出现黄斑部视网膜脱离的2只注射眼在治疗后90 d、3年黄斑中心凹厚度仍不明原因的变薄，其余13只注射眼黄斑中心凹厚度无明显变化；15只对照眼黄斑中心凹厚度也无明显变化。虽然基因治疗不能增加视网膜外核层厚度和光感受器细胞数量，但可以有效补充视循环中缺失RPE65蛋白，从而改善视功能。而观察到视网膜厚度变薄可能与注射前存在的视网膜前膜或视网膜水肿有关系[11-13]。Upenn/UFL研究组观察发现，1例患者出现了“伪黄斑”，表现为在低强度光照下，注射部位视网膜局部注视更加稳定，提示基因治疗注射位点视功能恢复的幅度更高[9, 12]。这为基因注射视网膜位置选择提供了一定的参考价值。
2.8 其他
部分患者眼球震颤减轻、眼位偏斜改善[4, 6, 8, 15]、视皮质功能性磁共振面积增加[7, 8]。
3 LCAⅡ型基因治疗临床试验的安全性
3.1 视网膜、脉络膜脱离及黄斑裂孔
CHOP1研究组观察发现，12例患者的视网膜脱离于治疗后14 h恢复[4-6]。Upenn/UFL研究组观察发现，3例患者的视网膜下积液于治疗后5～6 h吸收[9]。Upenn/UFL研究组于2011年补充报道了12例患者，发现1例患者的视网膜脱离在治疗后1 d恢复；1例患者在手术后3 d发生脉络膜脱离，给予眼表局部糖皮质激素抗炎、睫状肌麻痹剂和β阻滞剂控制眼压，于治疗后238 d脉络膜恢复正常[12, 13]。UCL/MEH研究组观察发现，3例患者的视网膜脱离于治疗后24 h基本恢复[15]。
CHOP1研究组观察发现，1例患者经低剂量注射治疗后5 d黄斑中心凹处薄层囊泡形成，治疗后14 d黄斑裂孔形成，治疗后18个月黄斑裂孔虽然未扩大，但是裂孔形成并未阻止视力提高[4-6]。分析原因是该患者黄斑裂孔形成与载体毒性无关，可能与注射之前就已经存在视网膜前膜经注射刺激后收缩牵拉所致。治疗后8 d，1例患者经中剂量注射治疗后黄斑中心凹裂孔恢复。
3.2 眼部炎症及系统性免疫排斥反应
CHOP1研究组于治疗后第1天仅在1例经低剂量注射治疗的患者泪液中检测到rAAV2的DNA序列，但其并未引起特异性炎症反应；多数患者只出现一过性与手术相关的炎症反应[4-6]。该研究还发现，1例患者经低剂量注射治疗后外周血抗体滴度升高，但随着时间延长逐渐消失；2例患者早期有轻度抗体滴度升高，但之后逐渐降低，手术后1年降至基线水平[4-6]。Upenn/ UFL研究组观察发现，1例患者治疗后90 d抗体滴度较治疗前提高4.5～7.5倍，外周淋巴细胞反应指数由治疗前1.89提高至2.10[9]。1年后全身检查和血尿检查无异常，抗体滴度以及外周淋巴细胞反应均与治疗前接近[11]。之后该研究组又补充报道了12例患者视网膜下腔注射rAAV2引起的体液免疫反应，1例患者治疗后90 d抗体滴度大于基线的60%，4例患者抗体滴度在一定时间内升高后又恢复至正常水平，外周淋巴细胞反应检测中仅有2例患者较治疗前略有增高[12, 13]。UCL/MEH研究组在治疗后1、30 d对3例患者的泪液、唾液、血清以及精液行聚合酶连反应检测，未见病毒载体播散；其中2例患者出现小量非特异性T细胞增高，这与糖皮质激素停药后的反应一致[15]。CHOP2研究组对3例患者对照眼再次行视网膜下腔注射，发现患者的早期血液和泪液中载体DNA序列低度阳性，但在注射后3 d均恢复至阴性；1例患者在注射6周时对rAAV2和RPE65蛋白有T细胞免疫反应，1例患者在注射5周时对RPE65蛋白有T细胞免疫反应；但以上所有患者血清中均未检测到对RPE65基因表达产物的抗体[8]。表明rAAV2无全身和眼部严重不良反应，但其对目的基因的包装能力较差，这可能会影响基因治疗的效率。
4 LCAⅡ型基因治疗临床试验存在的问题
目前LCAⅡ型基因治疗的临床试验还有许多问题需要进一步研究解决，如现有试验均以较差眼作为注射眼，缺乏随机化原则；尽管rAAV2无全身和眼部严重不良反应，但其对目的基因的包装能力较差，可能会影响基因治疗的效率；基因治疗改善个体视功能的程度有限，且长期效果需进一步随访观察；视网膜下腔基因注射可对视网膜残留的光感受器造成损伤，有进一步恶化视功能的风险。今后能否设计出转染效率更高、特异性更强的载体，仅通过玻璃体腔注射即可转染到视网膜组织细胞中还有待进一步研究。总之，LCAⅡ型基因治疗在选择合适的患者以及如何尽量降低基因治疗本身对视网膜结构和功能的损害等方面仍然面临诸多挑战。