引用本文： 鲁理, 郑志, 李静文, 肖文玮, 李春霞. 高糖诱导的牛视网膜血管内皮细胞中共济失调毛细血管扩张突变基因激酶活性变化及其对细胞氧化应激状态的影响. 中华眼底病杂志, 2014, 30(6): 604-607. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2014.06.016 复制
氧化应激与视网膜组织的炎症反应、神经血管损害、细胞凋亡、线粒体功能紊乱等联系密切，在糖尿病视网膜病变(DR)的病理过程中起重要作用[1-3]。共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)激酶作为一种DNA损伤修复过程中的经典蛋白分子，在氧化应激中被激活并起到调控氧化应激的作用[4]。ATM缺失导致缺氧诱导因子1(HIF-1)大量增加从而加剧细胞氧化应激[5]。但目前有关ATM激酶在DR发病机制中的确切作用还不明确。为此，我们观察高糖培养状态下体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞(BRECs)中ATM激酶的活性和表达变化及其对氧化应激的调节作用，初步探究ATM激酶在DR中的作用机制，为防治DR提供新的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 BRECs培养及实验分组
参照文献[5, 6]的选择性培养方法培养BRECs。取新鲜获得的牛眼球，取出并剪碎视网膜微血管，加入含0.05％的胶原酶和0.025％的牛血清蛋白消化液，37℃消化45 min。应用网孔直径88 μm的不锈钢筛网过滤，D-hank液冲洗滤网上的组织，在离心后的小丸状物中加入含有10％灭活胎牛血清、100 μg/ml肝素、15 μg/ml内皮细胞生长添加物、10 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸的Dulbecco改良Eagle培养基，接种于包被有明胶的培养皿培养。传代后，取第1代细胞，通过vonWillebrand因子抗体，免疫细胞化学方法对内皮细胞进行鉴定。取4～8代的细胞，传代培养24 h后分为正常糖组、高糖组、干预组进行实验。分别采用含5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L ATM激酶特异性抑制剂KU-55933的细胞培养液继续培养48 h进行相关实验。
1.2 实验方法及检测指标
细胞培养后48 h，采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中ATM、磷酸化ATM(P-ATM)、细胞分裂素活化蛋白激酶(P38)、磷酸化P38(P-P38)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)的表达。应用二喹啉甲酸蛋白定量法测定裂解液提取各组细胞总蛋白。按照蛋白定量结果，以4:1的比例混合蛋白样品及5倍上样缓冲液，100℃加热3~5 min，按每孔20 μg蛋白量上样，进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗与二抗，包括单克隆兔抗β微管蛋白抗体、多克隆兔抗P38抗体、多克隆兔抗P-P38抗体、多克隆兔抗ERK1/2抗体、多克隆兔抗P-ERK1/2抗体(美国CST公司)，辣根过氧化物酶羊抗兔IgG二抗(美国Bioworld公司)，单克隆小鼠抗ATM抗体、单克隆小鼠抗P-ATM抗体(英国Abcam公司)及ATM激酶抑制剂KU55933(美国R & D公司)，最后显影定影。采用Image J图像处理软件进行灰度分析，以磷酸化蛋白与其总蛋白的比值表示相应蛋白的活性水平。
细胞培养后48 h，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。收集各组细胞上清液，每孔100 μl，设复孔，按照人VEGF ELISA试剂盒(上海依科赛公司)说明书进行操作。用酶联免疫检测仪在波长450 nm下测量吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，获取细胞上清液中VEGF的含量。
细胞培养后48 h，采用细胞内ROS水平检测试剂盒检测细胞内ROS的水平。细胞培养后48 h，采用碘化丙啶(PI)和赫斯特染料(Hoechst)双染色法检测细胞凋亡情况。收集对数生长期细胞，以细胞密度2×105个细胞/孔接种于24孔培养板中。分别称取10 mg PI或Hoechst溶于10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为1 mg/ml。分装后PI 4℃避光储存，Hoechst 20℃避光储存。配制工作液，PI:Hoechst:PBS体积比为1:1:100。吸去上清液，每孔加入工作液500 μl，置于培养箱避光培养15 min。采用荧光显微镜观察细胞，以PI着红色细胞为坏死及凋亡晚期细胞，Hoechst着蓝色细胞为全部细胞，以每100个细胞中着红色细胞数/着蓝色细胞数之比为细胞凋亡率[5]。
细胞培养后48 h，终止培养，原位装载探针，采用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖检测内皮细胞屏障的通透性。按照1:1000的比例，用无血清培养液稀释2′, 7′-二氯荧光二乙酸盐(DCFH-DA)，使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，用无血清培养液洗涤1次，加入适当体积无血清培养基稀释好的DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为准。37℃细胞培养箱内孵育25～30 min。PBS洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。应用荧光显微镜观察并拍照。采用Image J图像处理软件进行定量分析。将BRECs接种于Transwell微孔膜上(美国Costar公司)，微孔膜直径24 mm，孔径0.4 μm，参照文献[7]的方法计算处理各组细胞旁通透率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(
2 结果
Western blot检测结果显示，正常糖组、高糖组及干预组P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达比较，差异均有统计学意义(F=436.00、14 010.00、985.10，P＜0.05)。与正常糖组比较，高糖组P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达增高，差异均有统计学意义(t=-9.74、-4.70、-20.33，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组P-ATM蛋白表达降低，差异有统计学意义(t=5.44，P＜0.01)；p-p38、p-ERK1/2蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义(t=-18.37、-12.97，P＜0.01)(图 1)。
图1
各组P-ATM、P-P38及P-ERK1/2蛋白表达比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05；***干预组与高糖组比较，P＜0.05 图 2 各组BRECs中ROS含量比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05 图 3 各组BRECs细胞凋亡率比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05
ELISA检测结果显示，正常糖组、高糖组、干预组细胞上清液中VEGF含量分别为(138.0±4.6)、(210.0±6.5)、(305.0±7.1) pg/ml，3组间差异有统计学意义(F=278.00，P＜0.05)。与正常糖组比较，高糖组细胞上清液中VEGF含量有所增加，差异有统计学意义(t=-13.90，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组细胞上清液中VEGF含量明显增加，差异也有统计学意义(t=-32.79，P＜0.05)。
ROS含量检测结果显示，与正常糖组比较，高糖组ROS含量增高约1.5倍，差异有统计学意义(t=2.89，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组ROS含量增高约3.0倍，差异也有统计学意义(t=10.91，P＜0.05)(图 2)。
PI和Hoechst双染色法检测结果显示，高糖组BRECs细胞凋亡率较正常糖组明显增加，而又明显低于干预组，差异均有统计学意义(t=4.31、11.14，P＜0.05)。3组间BRECs细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=55.51，P＜0.05)(图 3)。
正常糖组、高糖组、干预组细胞旁通透率分别为(1.12±0.13)×10-6、(1.45±0.17)×10-6、(1.66±0.12)×10-6 cm/s。与正常糖组比较，高糖组、干预组细胞旁通透率均升高，以干预组升高更明显。3组间细胞旁通透率比较，差异有统计学意义(F=2 223.00，P＜0.05)。
3 讨论
本研究选取体外培养的BRECs，分别以正常浓度葡萄糖、高浓度葡萄糖以及高浓度葡萄糖联合ATM激酶抑制剂处理细胞，观察在不同葡萄糖浓度环境中ATM激酶的激活和表达情况、细胞内氧化应激水平、细胞凋亡水平以及细胞旁通透率的变化。结果表明，高糖组BRECs的氧化应激水平明显比正常糖组提高，ROS激增，P-ATM激酶表达增加。说明ATM激酶在高糖环境中因为氧化应激而被ROS激活，与国外研究结果相似[4]。而在采用高糖加KU55933的干预组中，我们发现细胞的氧化应激水平与高糖组相比有进一步的提高。表明ATM激酶在氧化应激中可能起到保护作用。我们还发现，高糖组中p-p38、p-ERK1/2表达轻度增高，而干预组中p-p38、p-ERK1/2表达则大大增加。P38和ERK通路是重要的凋亡通路，同时其与细胞内氧化应激状态联系密切。Lu等[8]研究发现，由水银所导致的神经元损伤中氧化应激介导的p38、ERK1/2激活是主要的细胞凋亡途径。Tian等[9]在研究牛蒡根的神经保护作用中也发现，通过降低ROS可以抑制p38、ERK1/2的激活及其所诱导的细胞凋亡。国外亦有相关文献报道，在ATM基因敲除鼠的神经干细胞和星形胶质细胞中P38和ERK通路的激活，通过上调CDK抑制物和凋亡相关基因的表达，抑制了细胞的增生，诱导细胞生长停滞和凋亡[10, 11]。本研究结果同样证实了ATM激酶的抑制导致P38和ERK通路的激活，从而增加了细胞的凋亡。据此我们推测，在BRECs中，ATM激酶缺失后，细胞内氧化应激失控，ROS爆发式产生，进而激活P38和ERK通路造成BRECs凋亡。说明ATM激酶在氧化应激中至关重要，其活性关系到视网膜血管内皮细胞凋亡与否。在DR病理变化中如能保持和提高ATM激酶的活性，控制细胞氧化应激，可能对控制DR发展起到积极作用。
高糖诱导的VEGF增高和由于高水平VEGF所导致的血视网膜屏障破坏、血管渗漏以及后期的新生血管形成都与DR病理过程密切相关。我们在探索ATM与VEGF的关系时发现，高糖组VEGF表达高于正常糖组，而干预组VEGF水平远远高于高糖组。我们分析认为，高糖环境下细胞处于氧化应激的状态并产生大量ROS，其原因则是细胞能量代谢系统功能紊乱，线粒体电子传递链破坏，此时细胞无法正常利用氧进行有氧呼吸，处于一种缺氧的状态[12]。ATM激酶作为一种对于缺氧和氧化应激的应答，起到保护性作用。当ATM激酶被抑制或敲除，细胞缺氧，氧化应激水平将进一步提高，导致VEGF上调。Ousset等[5]在敲除ATM基因的海拉细胞中发现，通过HIF-1高表达，可诱导作为其下游的VEGF表达增高。该结果与我们的推测一致。我们还发现各组细胞旁通透性测定结果与VEGF表达趋势一致。这可能是因为VEGF通过破坏细胞间连接使得血管渗漏组织水肿[13]，ATM激酶缺失则借由诱导VEGF的高表达影响内皮细胞屏障功能。
本研究结果表明，在高糖诱导的BRECs中，ATM激酶被激活，P-ATM表达增高并作为氧化应激中的一种保护性因子发挥作用。对这一因子加以抑制则造成细胞氧化应激状态加剧、细胞凋亡增加、细胞间屏障功能损害。本研究初步探讨了高糖环境中ATM激酶缺失诱导细胞凋亡的可能机制及其和VEGF的关系，为未来其可能作为DR的潜在治疗靶点开展了一些基础性工作。但本研究未从正面对ATM激酶的保护作用机制进行探究，是一不足。下一阶段将尝试构建ATM激酶过表达的细胞模型，同时在糖尿病动物模型中开展在体实验，全面观察ATM激酶在DR中所起的作用。
氧化应激与视网膜组织的炎症反应、神经血管损害、细胞凋亡、线粒体功能紊乱等联系密切，在糖尿病视网膜病变(DR)的病理过程中起重要作用[1-3]。共济失调毛细血管扩张突变基因(ATM)激酶作为一种DNA损伤修复过程中的经典蛋白分子，在氧化应激中被激活并起到调控氧化应激的作用[4]。ATM缺失导致缺氧诱导因子1(HIF-1)大量增加从而加剧细胞氧化应激[5]。但目前有关ATM激酶在DR发病机制中的确切作用还不明确。为此，我们观察高糖培养状态下体外培养的牛视网膜微血管内皮细胞(BRECs)中ATM激酶的活性和表达变化及其对氧化应激的调节作用，初步探究ATM激酶在DR中的作用机制，为防治DR提供新的思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 BRECs培养及实验分组
参照文献[5, 6]的选择性培养方法培养BRECs。取新鲜获得的牛眼球，取出并剪碎视网膜微血管，加入含0.05％的胶原酶和0.025％的牛血清蛋白消化液，37℃消化45 min。应用网孔直径88 μm的不锈钢筛网过滤，D-hank液冲洗滤网上的组织，在离心后的小丸状物中加入含有10％灭活胎牛血清、100 μg/ml肝素、15 μg/ml内皮细胞生长添加物、10 mmol/L羟乙基哌嗪乙磺酸的Dulbecco改良Eagle培养基，接种于包被有明胶的培养皿培养。传代后，取第1代细胞，通过vonWillebrand因子抗体，免疫细胞化学方法对内皮细胞进行鉴定。取4～8代的细胞，传代培养24 h后分为正常糖组、高糖组、干预组进行实验。分别采用含5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖和10 μmol/L ATM激酶特异性抑制剂KU-55933的细胞培养液继续培养48 h进行相关实验。
1.2 实验方法及检测指标
细胞培养后48 h，采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞中ATM、磷酸化ATM(P-ATM)、细胞分裂素活化蛋白激酶(P38)、磷酸化P38(P-P38)、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、磷酸化ERK1/2(P-ERK1/2)的表达。应用二喹啉甲酸蛋白定量法测定裂解液提取各组细胞总蛋白。按照蛋白定量结果，以4:1的比例混合蛋白样品及5倍上样缓冲液，100℃加热3~5 min，按每孔20 μg蛋白量上样，进行电泳、转膜、封闭、孵育一抗与二抗，包括单克隆兔抗β微管蛋白抗体、多克隆兔抗P38抗体、多克隆兔抗P-P38抗体、多克隆兔抗ERK1/2抗体、多克隆兔抗P-ERK1/2抗体(美国CST公司)，辣根过氧化物酶羊抗兔IgG二抗(美国Bioworld公司)，单克隆小鼠抗ATM抗体、单克隆小鼠抗P-ATM抗体(英国Abcam公司)及ATM激酶抑制剂KU55933(美国R & D公司)，最后显影定影。采用Image J图像处理软件进行灰度分析，以磷酸化蛋白与其总蛋白的比值表示相应蛋白的活性水平。
细胞培养后48 h，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的含量。收集各组细胞上清液，每孔100 μl，设复孔，按照人VEGF ELISA试剂盒(上海依科赛公司)说明书进行操作。用酶联免疫检测仪在波长450 nm下测量吸光度[A，旧称光密度(OD)]值，获取细胞上清液中VEGF的含量。
细胞培养后48 h，采用细胞内ROS水平检测试剂盒检测细胞内ROS的水平。细胞培养后48 h，采用碘化丙啶(PI)和赫斯特染料(Hoechst)双染色法检测细胞凋亡情况。收集对数生长期细胞，以细胞密度2×105个细胞/孔接种于24孔培养板中。分别称取10 mg PI或Hoechst溶于10 ml磷酸盐缓冲液(PBS)中，终浓度为1 mg/ml。分装后PI 4℃避光储存，Hoechst 20℃避光储存。配制工作液，PI:Hoechst:PBS体积比为1:1:100。吸去上清液，每孔加入工作液500 μl，置于培养箱避光培养15 min。采用荧光显微镜观察细胞，以PI着红色细胞为坏死及凋亡晚期细胞，Hoechst着蓝色细胞为全部细胞，以每100个细胞中着红色细胞数/着蓝色细胞数之比为细胞凋亡率[5]。
细胞培养后48 h，终止培养，原位装载探针，采用异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖检测内皮细胞屏障的通透性。按照1:1000的比例，用无血清培养液稀释2′, 7′-二氯荧光二乙酸盐(DCFH-DA)，使终浓度为10 μmol/L。去除细胞培养液，用无血清培养液洗涤1次，加入适当体积无血清培养基稀释好的DCFH-DA，加入的体积以能充分盖住细胞为准。37℃细胞培养箱内孵育25～30 min。PBS洗涤细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。应用荧光显微镜观察并拍照。采用Image J图像处理软件进行定量分析。将BRECs接种于Transwell微孔膜上(美国Costar公司)，微孔膜直径24 mm，孔径0.4 μm，参照文献[7]的方法计算处理各组细胞旁通透率。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。计量资料数据以均数±标准差(
2 结果
Western blot检测结果显示，正常糖组、高糖组及干预组P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达比较，差异均有统计学意义(F=436.00、14 010.00、985.10，P＜0.05)。与正常糖组比较，高糖组P-ATM、P-P38、P-ERK1/2蛋白表达增高，差异均有统计学意义(t=-9.74、-4.70、-20.33，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组P-ATM蛋白表达降低，差异有统计学意义(t=5.44，P＜0.01)；p-p38、p-ERK1/2蛋白表达明显增加，差异均有统计学意义(t=-18.37、-12.97，P＜0.01)(图 1)。
图1
各组P-ATM、P-P38及P-ERK1/2蛋白表达比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05；***干预组与高糖组比较，P＜0.05 图 2 各组BRECs中ROS含量比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05 图 3 各组BRECs细胞凋亡率比较。*高糖组与正常糖组比较，P＜0.05；**干预组与高糖组比较，P＜0.05
ELISA检测结果显示，正常糖组、高糖组、干预组细胞上清液中VEGF含量分别为(138.0±4.6)、(210.0±6.5)、(305.0±7.1) pg/ml，3组间差异有统计学意义(F=278.00，P＜0.05)。与正常糖组比较，高糖组细胞上清液中VEGF含量有所增加，差异有统计学意义(t=-13.90，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组细胞上清液中VEGF含量明显增加，差异也有统计学意义(t=-32.79，P＜0.05)。
ROS含量检测结果显示，与正常糖组比较，高糖组ROS含量增高约1.5倍，差异有统计学意义(t=2.89，P＜0.05)。与高糖组比较，干预组ROS含量增高约3.0倍，差异也有统计学意义(t=10.91，P＜0.05)(图 2)。
PI和Hoechst双染色法检测结果显示，高糖组BRECs细胞凋亡率较正常糖组明显增加，而又明显低于干预组，差异均有统计学意义(t=4.31、11.14，P＜0.05)。3组间BRECs细胞凋亡率比较，差异有统计学意义(F=55.51，P＜0.05)(图 3)。
正常糖组、高糖组、干预组细胞旁通透率分别为(1.12±0.13)×10-6、(1.45±0.17)×10-6、(1.66±0.12)×10-6 cm/s。与正常糖组比较，高糖组、干预组细胞旁通透率均升高，以干预组升高更明显。3组间细胞旁通透率比较，差异有统计学意义(F=2 223.00，P＜0.05)。
3 讨论
本研究选取体外培养的BRECs，分别以正常浓度葡萄糖、高浓度葡萄糖以及高浓度葡萄糖联合ATM激酶抑制剂处理细胞，观察在不同葡萄糖浓度环境中ATM激酶的激活和表达情况、细胞内氧化应激水平、细胞凋亡水平以及细胞旁通透率的变化。结果表明，高糖组BRECs的氧化应激水平明显比正常糖组提高，ROS激增，P-ATM激酶表达增加。说明ATM激酶在高糖环境中因为氧化应激而被ROS激活，与国外研究结果相似[4]。而在采用高糖加KU55933的干预组中，我们发现细胞的氧化应激水平与高糖组相比有进一步的提高。表明ATM激酶在氧化应激中可能起到保护作用。我们还发现，高糖组中p-p38、p-ERK1/2表达轻度增高，而干预组中p-p38、p-ERK1/2表达则大大增加。P38和ERK通路是重要的凋亡通路，同时其与细胞内氧化应激状态联系密切。Lu等[8]研究发现，由水银所导致的神经元损伤中氧化应激介导的p38、ERK1/2激活是主要的细胞凋亡途径。Tian等[9]在研究牛蒡根的神经保护作用中也发现，通过降低ROS可以抑制p38、ERK1/2的激活及其所诱导的细胞凋亡。国外亦有相关文献报道，在ATM基因敲除鼠的神经干细胞和星形胶质细胞中P38和ERK通路的激活，通过上调CDK抑制物和凋亡相关基因的表达，抑制了细胞的增生，诱导细胞生长停滞和凋亡[10, 11]。本研究结果同样证实了ATM激酶的抑制导致P38和ERK通路的激活，从而增加了细胞的凋亡。据此我们推测，在BRECs中，ATM激酶缺失后，细胞内氧化应激失控，ROS爆发式产生，进而激活P38和ERK通路造成BRECs凋亡。说明ATM激酶在氧化应激中至关重要，其活性关系到视网膜血管内皮细胞凋亡与否。在DR病理变化中如能保持和提高ATM激酶的活性，控制细胞氧化应激，可能对控制DR发展起到积极作用。
高糖诱导的VEGF增高和由于高水平VEGF所导致的血视网膜屏障破坏、血管渗漏以及后期的新生血管形成都与DR病理过程密切相关。我们在探索ATM与VEGF的关系时发现，高糖组VEGF表达高于正常糖组，而干预组VEGF水平远远高于高糖组。我们分析认为，高糖环境下细胞处于氧化应激的状态并产生大量ROS，其原因则是细胞能量代谢系统功能紊乱，线粒体电子传递链破坏，此时细胞无法正常利用氧进行有氧呼吸，处于一种缺氧的状态[12]。ATM激酶作为一种对于缺氧和氧化应激的应答，起到保护性作用。当ATM激酶被抑制或敲除，细胞缺氧，氧化应激水平将进一步提高，导致VEGF上调。Ousset等[5]在敲除ATM基因的海拉细胞中发现，通过HIF-1高表达，可诱导作为其下游的VEGF表达增高。该结果与我们的推测一致。我们还发现各组细胞旁通透性测定结果与VEGF表达趋势一致。这可能是因为VEGF通过破坏细胞间连接使得血管渗漏组织水肿[13]，ATM激酶缺失则借由诱导VEGF的高表达影响内皮细胞屏障功能。
本研究结果表明，在高糖诱导的BRECs中，ATM激酶被激活，P-ATM表达增高并作为氧化应激中的一种保护性因子发挥作用。对这一因子加以抑制则造成细胞氧化应激状态加剧、细胞凋亡增加、细胞间屏障功能损害。本研究初步探讨了高糖环境中ATM激酶缺失诱导细胞凋亡的可能机制及其和VEGF的关系，为未来其可能作为DR的潜在治疗靶点开展了一些基础性工作。但本研究未从正面对ATM激酶的保护作用机制进行探究，是一不足。下一阶段将尝试构建ATM激酶过表达的细胞模型，同时在糖尿病动物模型中开展在体实验，全面观察ATM激酶在DR中所起的作用。
