引用本文： 曹葭, 孙尉, 邵珺, 谢田华, 殷丽, 吴莹, 王如兴, 姚勇. 糖尿病大鼠视网膜动脉平滑肌细胞大电导钙离子激活钾离子通道开放概率及其亚基蛋白表达. 中华眼底病杂志, 2015, 31(2): 162-164. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.013 复制
糖尿病(DM)发病时视网膜血流动力学异常早于DM视网膜病变(DR)的发生，并且与其病变进展密切相关[1-3]。DR前期视网膜中央动脉及其分支的异常收缩，可导致视网膜血流灌注减少，引起视网膜组织缺血缺氧。而视网膜动脉离子通道的异常是导致血管异常收缩、血流动力学紊乱的主要原因之一，其中视网膜动脉平滑肌细胞(RVSMCs)大电导钙离子激活钾离子(BK)通道的改变尤为重要[4, 5]。为了探寻RVSMCs的BK通道在DR发生发展中的作用，我们观察了DM大鼠RVSMCs的BK通道总开放概率(NP0)及α、β1亚基相对蛋白表达。现将结果报道如下。
1 材料和方法
8~12周龄健康雄性Spraque-Dawley大鼠50只，体重约(200±30)g，江苏省血吸虫病防治研究所动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组、DM模型组，分别为10、40只。DM模型组大鼠以60 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素建模，以最终血糖浓度连续8周大于16.7 mmol/L为建模成功[6]。正常对照组大鼠腹腔注射等剂量0.9%生理盐水作为对照。常规麻醉处死大鼠，摘取保存眼球，四步酶消化法分离RVSMCs[7]。最后将消化的组织用保存液漂洗2～3次后，放入保存液中4℃静置数小时，使用前轻吹打，得到大量RVSMCs。采用倒置显微镜观察RVSMCs形态，轮廓清晰、边缘不毛糙细胞为存活细胞。
采用Axopatch 200B膜片钳放大器和pCLAMP 10.2软件记录BK单通道电流。以膜内向外型模式记录BK单通道电流。输出信号经8极Bessel滤波器滤波，采样频率20 kHz，滤波频率5 kHz，电极电阻5～10 M。电极内液: KCl 140.0 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 10.0 mmol/L、乙二醇双四乙酸(EGTA)1.0 mmol/L、MgCl2 1.0μmol/L、CaCl2 1.0μmol/L，pH7.4；电极外液: KCl 140.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、EGTA 1.0 mmol/L、MgCl2 1.0μmol/L，pH7.35。在刺激电位为0、20、40、60、80、100、120 mV条件下，分别记录正常对照组及DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道NP0，比较其变化。采用公式NP0=∑(Onn)/T计算BK通道NP0[8]。其中，N为通道的开放数量，P0代表开放概率，T代表总记录时间，On代表每个开放水平所需时间。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠RVSMCs中α、β1亚基的相对蛋白表达。分离大鼠视网膜动脉，血管组织经液氮速冻后于－80℃储存备用。取出冻存大鼠视网膜动脉组织加入RIPA裂解液，在冰上充分研磨至无组织块，以13 000×g，4℃条件下离心15 min，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法对提取的蛋白质进行浓度测定。等量蛋白分别行7%(α亚基，相对分子质量约125×103)和12%(β1亚基，相对分子质量约28×103)丙烯酰胺凝胶电泳，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，抗BK通道α亚基和β1亚基抗体4℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h洗膜后再用电化学发光试剂盒发光压片，扫描胶片后吸光度[A, 旧称光密度(OD)]分析法定量。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。
采用SPSS 18.0统计软件行统计学分析。计量资料用均数±标准差(
2 结果
倒置显微镜观察发现，RVSMCs可呈蚯蚓状、短杆状、花生状，形态各异(图 1)。
图1
正常RVSMCs倒置显微镜像。RVSMCs可呈蚯蚓状、短杆状、花生状×200
0~120 mV不同刺激电压下，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道NP0明显增高，差异有统计学意义(t=4.260，P＜0.05)(图 2，3)。
图2
两组大鼠RVSMCs的BK通道电流。O：通道开放；C：通道关闭
图3
两组大鼠RVSMCs的BK通道电压NP0折线图
与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道α亚基蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(t=10.126，P＞0.05)；β1亚基蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(t=5.146，P＜0.05)(图 4，5)。
图4
两组大鼠RVSMCs的BK通道α、β1亚基蛋白电泳图。1~4为正常对照组，5~8为DM模型组
图5
两组大鼠RVSMCs的BK通道α、β1亚基蛋白表达比较。*与正常对照组比较，P＜0.05
3 讨论
BK通道广泛存在于兴奋及非兴奋细胞中，参与包括动作电位复极化、神经递质释放、激素分泌以及血管张力调节等生理活动[9]。BK通道是由α亚单位及β亚单位组成的四聚体结构[10]。α亚单位由单基因KCNMAl编码，广泛存在于哺乳动物组织中，并且在种属之间表现出高度同源性，其是形成BK离子通道的部位；β亚单位由KCNMB l～4编码，有4种亚型，在血管平滑肌细胞上主要为β1亚单位；β亚单位通过与α亚单位相互作用，可以改变BK通道的电压依赖性及钙敏感性。正常情况下，BK通道激活后钾离子外流，产生超极化，抑制电压依赖性钙离子通道开放，进而钙离子内流减少，引起血管平滑肌舒张，故BK通道功能主要为参与血管的扩张[11]。有研究发现，DM及DM前期病变时，由BK通道介导的血管扩张功能受损，但其确切分子机制尚不十分清楚，DM时BK通道α亚基及β1亚基蛋白表达是上调亦或是下降尚需进一步研究证实[12-14]。
本研究结果显示，与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的NP0明显升高，与McGahon等[15]报道结果相反。我们分析是以下两方面的原因引起：(1)国外研究多以分离并消化后仍位于视网膜动脉小片段上的平滑肌细胞为研究对象，本研究则采用急性酶消化法分离的单个RVSMCs为研究对象，可能造成其电生理特点不同，进而引起本次实验结果与国外报道结果的不一致。(2)我们在建模后8周便处死了大鼠进行相关实验，研究的是DM早期病变。有研究表明，DR一般在建模24周后才会出现，而本研究并未发现大鼠眼底血管出现明显DR的表现。因此，我们推测在DR发生前期，BK通道NP0增加，可能是作为一种保护性代偿机制，以抵抗DM引起的微血管病变。
本研究结果显示，与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道α亚基蛋白表达无明显变化，而β1亚基蛋白表达明显升高。与McGahon等[15]报道结果一致。该Western blot检测结果与BK通道NP0增加相一致。说明在DR发生前期，RVSMCs的BK通道出现代偿性增加的机制，可能通过BK通道β1亚基蛋白表达上调，导致了NP0升高，代偿性抵抗了DR的早期发生。
本研究结果表明，DM早期RVSMCs的BK通道β1亚基蛋白表达升高，BK通道NP0增加，可能是作为一种保护性代偿机制抵抗DR的早期发生。在国内外研究的基础上，本研究拓展了DR发生机制，提出了更具前瞻性的假设，为寻找可能的药物作用靶点预防及治疗早期DR提供了新思路。
糖尿病(DM)发病时视网膜血流动力学异常早于DM视网膜病变(DR)的发生，并且与其病变进展密切相关[1-3]。DR前期视网膜中央动脉及其分支的异常收缩，可导致视网膜血流灌注减少，引起视网膜组织缺血缺氧。而视网膜动脉离子通道的异常是导致血管异常收缩、血流动力学紊乱的主要原因之一，其中视网膜动脉平滑肌细胞(RVSMCs)大电导钙离子激活钾离子(BK)通道的改变尤为重要[4, 5]。为了探寻RVSMCs的BK通道在DR发生发展中的作用，我们观察了DM大鼠RVSMCs的BK通道总开放概率(NP0)及α、β1亚基相对蛋白表达。现将结果报道如下。
1 材料和方法
8~12周龄健康雄性Spraque-Dawley大鼠50只，体重约(200±30)g，江苏省血吸虫病防治研究所动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组、DM模型组，分别为10、40只。DM模型组大鼠以60 mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素建模，以最终血糖浓度连续8周大于16.7 mmol/L为建模成功[6]。正常对照组大鼠腹腔注射等剂量0.9%生理盐水作为对照。常规麻醉处死大鼠，摘取保存眼球，四步酶消化法分离RVSMCs[7]。最后将消化的组织用保存液漂洗2～3次后，放入保存液中4℃静置数小时，使用前轻吹打，得到大量RVSMCs。采用倒置显微镜观察RVSMCs形态，轮廓清晰、边缘不毛糙细胞为存活细胞。
采用Axopatch 200B膜片钳放大器和pCLAMP 10.2软件记录BK单通道电流。以膜内向外型模式记录BK单通道电流。输出信号经8极Bessel滤波器滤波，采样频率20 kHz，滤波频率5 kHz，电极电阻5～10 M。电极内液: KCl 140.0 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 10.0 mmol/L、乙二醇双四乙酸(EGTA)1.0 mmol/L、MgCl2 1.0μmol/L、CaCl2 1.0μmol/L，pH7.4；电极外液: KCl 140.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、EGTA 1.0 mmol/L、MgCl2 1.0μmol/L，pH7.35。在刺激电位为0、20、40、60、80、100、120 mV条件下，分别记录正常对照组及DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道NP0，比较其变化。采用公式NP0=∑(Onn)/T计算BK通道NP0[8]。其中，N为通道的开放数量，P0代表开放概率，T代表总记录时间，On代表每个开放水平所需时间。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测大鼠RVSMCs中α、β1亚基的相对蛋白表达。分离大鼠视网膜动脉，血管组织经液氮速冻后于－80℃储存备用。取出冻存大鼠视网膜动脉组织加入RIPA裂解液，在冰上充分研磨至无组织块，以13 000×g，4℃条件下离心15 min，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法对提取的蛋白质进行浓度测定。等量蛋白分别行7%(α亚基，相对分子质量约125×103)和12%(β1亚基，相对分子质量约28×103)丙烯酰胺凝胶电泳，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，抗BK通道α亚基和β1亚基抗体4℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h洗膜后再用电化学发光试剂盒发光压片，扫描胶片后吸光度[A, 旧称光密度(OD)]分析法定量。磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参。
采用SPSS 18.0统计软件行统计学分析。计量资料用均数±标准差(
2 结果
倒置显微镜观察发现，RVSMCs可呈蚯蚓状、短杆状、花生状，形态各异(图 1)。
图1
正常RVSMCs倒置显微镜像。RVSMCs可呈蚯蚓状、短杆状、花生状×200
0~120 mV不同刺激电压下，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道NP0明显增高，差异有统计学意义(t=4.260，P＜0.05)(图 2，3)。
图2
两组大鼠RVSMCs的BK通道电流。O：通道开放；C：通道关闭
图3
两组大鼠RVSMCs的BK通道电压NP0折线图
与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道α亚基蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义(t=10.126，P＞0.05)；β1亚基蛋白表达明显升高，差异有统计学意义(t=5.146，P＜0.05)(图 4，5)。
图4
两组大鼠RVSMCs的BK通道α、β1亚基蛋白电泳图。1~4为正常对照组，5~8为DM模型组
图5
两组大鼠RVSMCs的BK通道α、β1亚基蛋白表达比较。*与正常对照组比较，P＜0.05
3 讨论
BK通道广泛存在于兴奋及非兴奋细胞中，参与包括动作电位复极化、神经递质释放、激素分泌以及血管张力调节等生理活动[9]。BK通道是由α亚单位及β亚单位组成的四聚体结构[10]。α亚单位由单基因KCNMAl编码，广泛存在于哺乳动物组织中，并且在种属之间表现出高度同源性，其是形成BK离子通道的部位；β亚单位由KCNMB l～4编码，有4种亚型，在血管平滑肌细胞上主要为β1亚单位；β亚单位通过与α亚单位相互作用，可以改变BK通道的电压依赖性及钙敏感性。正常情况下，BK通道激活后钾离子外流，产生超极化，抑制电压依赖性钙离子通道开放，进而钙离子内流减少，引起血管平滑肌舒张，故BK通道功能主要为参与血管的扩张[11]。有研究发现，DM及DM前期病变时，由BK通道介导的血管扩张功能受损，但其确切分子机制尚不十分清楚，DM时BK通道α亚基及β1亚基蛋白表达是上调亦或是下降尚需进一步研究证实[12-14]。
本研究结果显示，与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的NP0明显升高，与McGahon等[15]报道结果相反。我们分析是以下两方面的原因引起：(1)国外研究多以分离并消化后仍位于视网膜动脉小片段上的平滑肌细胞为研究对象，本研究则采用急性酶消化法分离的单个RVSMCs为研究对象，可能造成其电生理特点不同，进而引起本次实验结果与国外报道结果的不一致。(2)我们在建模后8周便处死了大鼠进行相关实验，研究的是DM早期病变。有研究表明，DR一般在建模24周后才会出现，而本研究并未发现大鼠眼底血管出现明显DR的表现。因此，我们推测在DR发生前期，BK通道NP0增加，可能是作为一种保护性代偿机制，以抵抗DM引起的微血管病变。
本研究结果显示，与正常对照组比较，DM模型组大鼠RVSMCs的BK通道α亚基蛋白表达无明显变化，而β1亚基蛋白表达明显升高。与McGahon等[15]报道结果一致。该Western blot检测结果与BK通道NP0增加相一致。说明在DR发生前期，RVSMCs的BK通道出现代偿性增加的机制，可能通过BK通道β1亚基蛋白表达上调，导致了NP0升高，代偿性抵抗了DR的早期发生。
本研究结果表明，DM早期RVSMCs的BK通道β1亚基蛋白表达升高，BK通道NP0增加，可能是作为一种保护性代偿机制抵抗DR的早期发生。在国内外研究的基础上，本研究拓展了DR发生机制，提出了更具前瞻性的假设，为寻找可能的药物作用靶点预防及治疗早期DR提供了新思路。
