引用本文： 韩冰, 刘苏. 芬戈莫德对视网膜光损伤大鼠光感受器细胞及小胶质细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(2): 169-172. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.015 复制
芬戈莫德(FTY720)是一种新型的免疫抑制剂，在多种自身免疫疾病、器官移植等疾病模型中均显示出良好的免疫抑制效果[1, 2]。除了强大的免疫抑制效应外，FTY720还存在着其他的非免疫抑制效应[3, 4]。有研究发现，FTY720在多发性硬化动物模型中，能够起到抑制小胶质细胞活化的作用，并且减少小胶质细胞产生的炎症因子[5]。而小胶质细胞在视网膜光损伤中大量活化并迁移，在光损伤过程中发挥重要作用[6]。但目前就FTY720在视网膜光损伤中的作用研究还不太多，为了探讨FTY720是否对视网膜光损伤后光感受器细胞具有保护作用及其可能的作用机制，我们观察了FTY720对视网膜光损伤后凋亡细胞的抑制作用及其对小胶质细胞的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠120只，雌雄各半，6~8周龄，体重250~300 g，四川省人民医院实验动物研究所提供。原位末端标记(TUNEL)试剂盒(瑞士Roche公司)，小胶质细胞流式Iba-1-异硫氰酸荧光素(FITC)抗体及同型对照抗体(美国Abcom公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，美国Thermo公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国RG公司)，新生牛血清(美国Gibco公司)。流式细胞仪(美国Beckman公司)。
将大鼠随机分为正常组、模型组、溶媒组和FTY720组，每组30只。正常组大鼠不予处理；模型组、溶媒组和FTY720组大鼠建立光损伤动物模型。模型组大鼠仅接受光照。FTY720组大鼠建模前0.5 h以10 mg/kg的剂量腹腔注射FTY720，溶媒组大鼠注射50%二甲基亚砜。自制大小140 cm×57 cm×119 cm的木箱，侧面留通风孔；顶部安装3根可调节亮度的白色荧光灯管，其余各面贴闪光纸，使木箱中光照均匀；调节光照强度为(2700±100)Lux，温度控制在20~30℃。模型组、溶媒组和FTY720组大鼠出生后即在微弱循环光(5 Lux明适应12 h及暗适应12 h)环境下饲养至6~8周大小。光照前暗适应12 h后放入光损伤箱内接受白光照射6 h，在光照3 h时两侧均互相调换位置。光照结束后放回原饲养环境中喂养。
光照后6 h及1、3、7 d，断颈处死各组大鼠，分离视网膜，剪碎，过200目不锈钢滤网，收集滤液，离心，获得单细胞悬液。将密度分别为1.030、1.072、1.088、1.123 g/ml的Percoll细胞分离液依次添加在细胞悬液上，离心吸取1.072、1.088 g/ml两层细胞悬液，加Iba-1-FITC抗体孵育后应用流式细胞仪检测视网膜中小胶质细胞所占比例。
光照后6 h及1、3、7 d，断颈处死各组大鼠，分离视网膜，制成匀浆，将标本保存在液氮中，待标本采集完成后，按照ELISA试剂盒操作说明书检测大鼠视网膜中白细胞介素(IL)-1β的含量。
光照后1 d，断颈处死各组大鼠，摘取眼球，在12点钟方向结膜连接视盘处做标记。常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，按照TUNEL试剂盒进行染色，以棕黄色染色细胞为凋亡细胞。光学显微镜下采集图片，计数凋亡细胞。
光照后7 d，断颈处死各组大鼠，摘取眼球，在12点钟方向结膜连接视盘处做标记。常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察大鼠视网膜神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(ONL)等各层次形态结构。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差(
2 结果
流式细胞仪检测结果显示，大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例于光照后6 h开始升高，光照后3 d达高峰，光照后7 d开始下降。正常组、模型组、溶酶组及FTY720组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例分别为24.40%、80.00%、74.40%、51.30%。光照后6 h及1、3、7 d，FTY720组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例均较模型组、溶酶组降低，较正常组升高，差异均有统计学意义(F=53、134、240、185，P＜0.01)(图 1)。
图1
光照后不同时间点各组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例比较
ELISA检测结果显示，光照后大鼠视网膜中IL-1β含量的变化趋势与小胶质细胞所占比例变化趋势一致。光照后6 h及1、3、7 d，FTY720组大鼠视网膜中IL-1β含量均较模型组、溶酶组降低，较正常组升高，差异均有统计学意义(F=53、275、581、429，P＜0.01)(图 2)。
图2
光照后不同时间点各组大鼠视网膜中IL-1β含量比较
光照后1 d，正常组大鼠视网膜未见凋亡细胞，模型组、溶酶组大鼠视网膜可见大量凋亡细胞，FTY720组大鼠视网膜可见少量凋亡细胞(图 3)。正常组、模型组、溶酶组及FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例分别为0、(87.66±2.50)%、(86.00±2.44)%、(49.66±2.80)%。与正常组比较，模型组、溶酶组、FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组、溶酶组大鼠视网膜凋亡细胞比例比较，差异无统计学意义(P=0.21)。与模型组、溶酶组比较，FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例明显下降，差异均有统计学意义(F=2018，P＜0.01)。
图3
光照后1 d大鼠视网膜TUNEL染色像。3A.正常组，视网膜各层均未见凋亡细胞；3B.模型组，视网膜ONL可见大量凋亡细胞(黑箭)；3C.溶媒组，视网膜ONL可见大量凋亡细胞(黑箭)；3D. FTY720组，视网膜ONL可见少量凋亡细胞(黑箭) TUNEL×400
光照后7 d，光学显微镜观察发现，正常组大鼠视网膜结构清晰，细胞排列整齐；溶酶组、模型组大鼠视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；FTY720组大鼠视网膜结构清晰，ONL厚度较溶酶组、模型组厚，但薄于正常组(图 4)。
图4
光照后7 d大鼠视网膜HE染色像。4A.正常组，视网膜结构清晰，细胞排列整齐；4B.模型组，视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；4C.溶媒组，视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；4D. FTY720组，视网膜结构清晰，ONL厚度较溶酶组、模型组厚，但薄于正常组HE×400
3 讨论
FTY720是由冬虫夏草中提取出来的抗生素成分多球囊菌素经化学修饰而成。作为新型免疫抑制剂，其毒副作用少、效果明显，在多种疾病模型中都显示出强大的免疫抑制效果。新近研究结果表明，FTY720除了强大的免疫抑制效应外，还对丙型肝炎病毒、肠道起搏器细胞及大麻素CB1受体等具有抑制和拮抗作用[7-9]。
一般认为视网膜光损伤分为两大类：一种是长时间、中低强度的白光照射产生光感受器细胞的损伤，另一种是短时间、高强度的光照射产生视网膜色素上皮细胞的损伤。本研究主要观察光源照射对光感受器细胞的损伤，因此采用第一种造模方式。尽管目前视网膜光损伤的研究颇多，但仍然没有公认的光损伤动物模型的建立方法。不同研究使用的光照强度及光照时间均有所不同[10, 11]。本研究采用的强度为2700 Lux的白光照射6 h建立视网膜光损伤动物模型的方法在实验研究中被广泛应用，造模成功率高[12]。并且我们前期的预实验结果也证实该建模方法可靠。
有研究表明，光照后1 d光感受器细胞凋亡达到高峰；而小胶质细胞在光照后6 h开始活化，3 d达到高峰，7 d开始下降[13]。因此，本研究选择光照后1 d检测光感受器细胞的凋亡情况，分别在光照后6 h及1、3、7 d对小胶质细胞所占比例和IL-1β含量进行检测。多个研究表明，小胶质细胞在视网膜变性中大量活化，受刺激活化的小胶质细胞一方面会迁移至损伤部位清除坏死物质，一方面会分泌神经毒性细胞因子导致病变的进一步损伤[14, 15]。并且，在光损伤中使用小胶质细胞抑制剂降低其活化，同时也明显降低了光感受器细胞的凋亡，并且在时间点上与其对小胶质细胞活化的抑制相一致[16]。我们通过对凋亡细胞的检测以及组织学的观察，发现FTY720能有效地减少光感受器细胞发生凋亡。鉴于FTY720在多发性硬化中对小胶质细胞的抑制作用以及小胶质细胞在光损伤中的重要作用，我们推测可能是因为FTY720抑制了小胶质细胞的活化，从而减少了光感受器细胞的凋亡。因此我们继续检测了光照后各个时间点小胶质细胞的表达情况。为了证实FTY720是通过抑制小胶质细胞起作用，我们同时也检测了相同时间点炎症因子IL-1β的表达情况。IL-1β是一种胶质源性炎症因子和促凋亡因子。在多种小胶质细胞介导的神经变性疾病中，IL-1β随小胶质细胞的增多而增多[17, 18]。我们发现，在各个时间点伴随着小胶质细胞被抑制，IL-1β含量也发生变化，同样受到抑制。由此我们推测，FTY720在光损伤后抑制了小胶质细胞的活化以及由此而产生的神经毒性因子，从而对小胶质细胞引起的光感受器细胞的继发性损害进行了有效的保护。
本研究结果揭示了FTY720与视网膜光损伤后小胶质细胞的关系。这为我们进一步研究FTY720在眼科疾病中新的药理作用以及小胶质细胞在视网膜光损伤中的更多功能做了铺垫。但值得注意的是，我们未在本实验研究中发现FTY720明显的毒副作用，这是否与观察时间较短有关还有待今后的研究继续关注。
芬戈莫德(FTY720)是一种新型的免疫抑制剂，在多种自身免疫疾病、器官移植等疾病模型中均显示出良好的免疫抑制效果[1, 2]。除了强大的免疫抑制效应外，FTY720还存在着其他的非免疫抑制效应[3, 4]。有研究发现，FTY720在多发性硬化动物模型中，能够起到抑制小胶质细胞活化的作用，并且减少小胶质细胞产生的炎症因子[5]。而小胶质细胞在视网膜光损伤中大量活化并迁移，在光损伤过程中发挥重要作用[6]。但目前就FTY720在视网膜光损伤中的作用研究还不太多，为了探讨FTY720是否对视网膜光损伤后光感受器细胞具有保护作用及其可能的作用机制，我们观察了FTY720对视网膜光损伤后凋亡细胞的抑制作用及其对小胶质细胞的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠120只，雌雄各半，6~8周龄，体重250~300 g，四川省人民医院实验动物研究所提供。原位末端标记(TUNEL)试剂盒(瑞士Roche公司)，小胶质细胞流式Iba-1-异硫氰酸荧光素(FITC)抗体及同型对照抗体(美国Abcom公司)，磷酸盐缓冲液(PBS，美国Thermo公司)，酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(美国RG公司)，新生牛血清(美国Gibco公司)。流式细胞仪(美国Beckman公司)。
将大鼠随机分为正常组、模型组、溶媒组和FTY720组，每组30只。正常组大鼠不予处理；模型组、溶媒组和FTY720组大鼠建立光损伤动物模型。模型组大鼠仅接受光照。FTY720组大鼠建模前0.5 h以10 mg/kg的剂量腹腔注射FTY720，溶媒组大鼠注射50%二甲基亚砜。自制大小140 cm×57 cm×119 cm的木箱，侧面留通风孔；顶部安装3根可调节亮度的白色荧光灯管，其余各面贴闪光纸，使木箱中光照均匀；调节光照强度为(2700±100)Lux，温度控制在20~30℃。模型组、溶媒组和FTY720组大鼠出生后即在微弱循环光(5 Lux明适应12 h及暗适应12 h)环境下饲养至6~8周大小。光照前暗适应12 h后放入光损伤箱内接受白光照射6 h，在光照3 h时两侧均互相调换位置。光照结束后放回原饲养环境中喂养。
光照后6 h及1、3、7 d，断颈处死各组大鼠，分离视网膜，剪碎，过200目不锈钢滤网，收集滤液，离心，获得单细胞悬液。将密度分别为1.030、1.072、1.088、1.123 g/ml的Percoll细胞分离液依次添加在细胞悬液上，离心吸取1.072、1.088 g/ml两层细胞悬液，加Iba-1-FITC抗体孵育后应用流式细胞仪检测视网膜中小胶质细胞所占比例。
光照后6 h及1、3、7 d，断颈处死各组大鼠，分离视网膜，制成匀浆，将标本保存在液氮中，待标本采集完成后，按照ELISA试剂盒操作说明书检测大鼠视网膜中白细胞介素(IL)-1β的含量。
光照后1 d，断颈处死各组大鼠，摘取眼球，在12点钟方向结膜连接视盘处做标记。常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，按照TUNEL试剂盒进行染色，以棕黄色染色细胞为凋亡细胞。光学显微镜下采集图片，计数凋亡细胞。
光照后7 d，断颈处死各组大鼠，摘取眼球，在12点钟方向结膜连接视盘处做标记。常规固定、脱水、石蜡包埋、切片，行苏木精-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察大鼠视网膜神经节细胞层(GCL)、内核层(INL)、外核层(ONL)等各层次形态结构。
采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。计量资料均以均数±标准差(
2 结果
流式细胞仪检测结果显示，大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例于光照后6 h开始升高，光照后3 d达高峰，光照后7 d开始下降。正常组、模型组、溶酶组及FTY720组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例分别为24.40%、80.00%、74.40%、51.30%。光照后6 h及1、3、7 d，FTY720组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例均较模型组、溶酶组降低，较正常组升高，差异均有统计学意义(F=53、134、240、185，P＜0.01)(图 1)。
图1
光照后不同时间点各组大鼠视网膜中小胶质细胞所占比例比较
ELISA检测结果显示，光照后大鼠视网膜中IL-1β含量的变化趋势与小胶质细胞所占比例变化趋势一致。光照后6 h及1、3、7 d，FTY720组大鼠视网膜中IL-1β含量均较模型组、溶酶组降低，较正常组升高，差异均有统计学意义(F=53、275、581、429，P＜0.01)(图 2)。
图2
光照后不同时间点各组大鼠视网膜中IL-1β含量比较
光照后1 d，正常组大鼠视网膜未见凋亡细胞，模型组、溶酶组大鼠视网膜可见大量凋亡细胞，FTY720组大鼠视网膜可见少量凋亡细胞(图 3)。正常组、模型组、溶酶组及FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例分别为0、(87.66±2.50)%、(86.00±2.44)%、(49.66±2.80)%。与正常组比较，模型组、溶酶组、FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例明显增加，差异有统计学意义(P＜0.01)。模型组、溶酶组大鼠视网膜凋亡细胞比例比较，差异无统计学意义(P=0.21)。与模型组、溶酶组比较，FTY720组大鼠视网膜凋亡细胞比例明显下降，差异均有统计学意义(F=2018，P＜0.01)。
图3
光照后1 d大鼠视网膜TUNEL染色像。3A.正常组，视网膜各层均未见凋亡细胞；3B.模型组，视网膜ONL可见大量凋亡细胞(黑箭)；3C.溶媒组，视网膜ONL可见大量凋亡细胞(黑箭)；3D. FTY720组，视网膜ONL可见少量凋亡细胞(黑箭) TUNEL×400
光照后7 d，光学显微镜观察发现，正常组大鼠视网膜结构清晰，细胞排列整齐；溶酶组、模型组大鼠视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；FTY720组大鼠视网膜结构清晰，ONL厚度较溶酶组、模型组厚，但薄于正常组(图 4)。
图4
光照后7 d大鼠视网膜HE染色像。4A.正常组，视网膜结构清晰，细胞排列整齐；4B.模型组，视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；4C.溶媒组，视网膜结构不清楚，细胞排列紊乱，ONL明显变薄；4D. FTY720组，视网膜结构清晰，ONL厚度较溶酶组、模型组厚，但薄于正常组HE×400
3 讨论
FTY720是由冬虫夏草中提取出来的抗生素成分多球囊菌素经化学修饰而成。作为新型免疫抑制剂，其毒副作用少、效果明显，在多种疾病模型中都显示出强大的免疫抑制效果。新近研究结果表明，FTY720除了强大的免疫抑制效应外，还对丙型肝炎病毒、肠道起搏器细胞及大麻素CB1受体等具有抑制和拮抗作用[7-9]。
一般认为视网膜光损伤分为两大类：一种是长时间、中低强度的白光照射产生光感受器细胞的损伤，另一种是短时间、高强度的光照射产生视网膜色素上皮细胞的损伤。本研究主要观察光源照射对光感受器细胞的损伤，因此采用第一种造模方式。尽管目前视网膜光损伤的研究颇多，但仍然没有公认的光损伤动物模型的建立方法。不同研究使用的光照强度及光照时间均有所不同[10, 11]。本研究采用的强度为2700 Lux的白光照射6 h建立视网膜光损伤动物模型的方法在实验研究中被广泛应用，造模成功率高[12]。并且我们前期的预实验结果也证实该建模方法可靠。
有研究表明，光照后1 d光感受器细胞凋亡达到高峰；而小胶质细胞在光照后6 h开始活化，3 d达到高峰，7 d开始下降[13]。因此，本研究选择光照后1 d检测光感受器细胞的凋亡情况，分别在光照后6 h及1、3、7 d对小胶质细胞所占比例和IL-1β含量进行检测。多个研究表明，小胶质细胞在视网膜变性中大量活化，受刺激活化的小胶质细胞一方面会迁移至损伤部位清除坏死物质，一方面会分泌神经毒性细胞因子导致病变的进一步损伤[14, 15]。并且，在光损伤中使用小胶质细胞抑制剂降低其活化，同时也明显降低了光感受器细胞的凋亡，并且在时间点上与其对小胶质细胞活化的抑制相一致[16]。我们通过对凋亡细胞的检测以及组织学的观察，发现FTY720能有效地减少光感受器细胞发生凋亡。鉴于FTY720在多发性硬化中对小胶质细胞的抑制作用以及小胶质细胞在光损伤中的重要作用，我们推测可能是因为FTY720抑制了小胶质细胞的活化，从而减少了光感受器细胞的凋亡。因此我们继续检测了光照后各个时间点小胶质细胞的表达情况。为了证实FTY720是通过抑制小胶质细胞起作用，我们同时也检测了相同时间点炎症因子IL-1β的表达情况。IL-1β是一种胶质源性炎症因子和促凋亡因子。在多种小胶质细胞介导的神经变性疾病中，IL-1β随小胶质细胞的增多而增多[17, 18]。我们发现，在各个时间点伴随着小胶质细胞被抑制，IL-1β含量也发生变化，同样受到抑制。由此我们推测，FTY720在光损伤后抑制了小胶质细胞的活化以及由此而产生的神经毒性因子，从而对小胶质细胞引起的光感受器细胞的继发性损害进行了有效的保护。
本研究结果揭示了FTY720与视网膜光损伤后小胶质细胞的关系。这为我们进一步研究FTY720在眼科疾病中新的药理作用以及小胶质细胞在视网膜光损伤中的更多功能做了铺垫。但值得注意的是，我们未在本实验研究中发现FTY720明显的毒副作用，这是否与观察时间较短有关还有待今后的研究继续关注。
