引用本文： 潘学良, 王鲜, 李志敏, 杨主敏, 徐涛. 坎地沙坦对早期糖尿病大鼠视网膜中Akt蛋白及其磷酸化位点表达的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(2): 184-186. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.02.020 复制
Akt作为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的主要下游分子，在PI3K或缺氧微环境的刺激下发生磷酸化，其中Thr308位点和Ser473位点的同时磷酸化为Akt活化所必需[1]。PI3K/Akt信号通路在糖尿病(DM)血管内皮炎症、凋亡、增生调控中起关键作用[2]。PI3K/Akt激活剂坎地沙坦以其具有独立于降低血压以外的保护作用，已广泛应用于心脑血管及肾病的治疗[3, 4]。但坎地沙坦是否可以通过激活PI3K/Akt信号通路进而参与对视网膜细胞的保护作用尚不清楚。为此，我们对一组早期糖尿病大鼠进行消化道灌注坎地沙坦，观察其对大鼠视网膜中Akt蛋白及其磷酸化位点Akt Ser473表达的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，坎地沙坦(重庆圣华曦药业)，罗氏血糖仪(瑞士罗氏公司)，Akt及AktSer473鼠大鼠单克隆抗体(美国Santa公司)。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠78只，鼠龄1～2个月，体重180～220 g，无特定病原体级，重庆腾鑫实验动物中心提供。随机数字表法将大鼠分为空白对照组、实验组, 分别为36、42只大鼠。实验组大鼠按体重40 mg/kg经鼠尾静脉注射1%STZ制作DM模型；建模后72 h取尾静脉血，罗氏血糖仪检测血糖值＞16.7 mmol/L为建模成功。随机数字表法将空白对照组大鼠分为空白对照组、空白对照+干预组，均为18只大鼠。实验组剔除未成模及死亡大鼠6只，随机数字表法将大鼠分为DM组、DM+干预组，均为18只大鼠。建模后3 d，空白对照+干预组、DM+干预组大鼠10 mg/(kg·d)坎地沙坦灌胃, 隔日1次。空白对照组、DM组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。灌胃4、8周处死大鼠，摘除双眼眼球。左眼球行免疫组织化学染色测定，右眼球行视网膜铺片、酶组织化学染色检查。处死前测量大鼠体重及血糖。
制备视网膜石蜡切片，切片厚度5μm。梯度脱蜡和水化后，组织抗原行高温热修复；冷却至常温后冲洗5 min，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶；磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min，共3次；加入非免疫性动物血清阻断非特异性结合，20 min后甩去封闭液加一抗，4℃保湿，过夜；PBS洗5 min，共3次，滴加二抗，室温孵育30 min；PBS洗2 min，共3次，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，冲洗5 min，苏木精复染，逐级脱水，透明，中性树胶封片。每组取18张切片，每张切片取4个视野, 400倍光学显微镜下观察。Akt蛋白、AktSer473阳性表达均为细胞膜呈棕黄色或棕褐色染色。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图片报告分析系统(武汉千屏公司)测定阳性颗粒的阳性单位值。
视网膜剥离步骤参照文献[5]的方法。完整游离视网膜组织后，按照丝氨酸/苏氨酸激酶(ADP)染色方法对视网膜铺片进行染色，甘油明胶封片。光学显微镜下观察。
采用SPSS 18.0统计软件对数据行统计学分析处理。所有数据以均数±标准差(
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，建模后4、8周，空白对照组、空白对照组+干预组大鼠视网膜内核层、节细胞层可见大量Akt蛋白、Akt Ser473阳性表达；DM组大鼠视网膜内核层Akt总蛋白及Akt Ser473阳性表达明显少于空白对照组；与空白对照组比较，DM+干预组大鼠视网膜Akt总蛋白、Akt Ser473阳性表达明显增多，但仍少于空白对照组(图 1, 2)。4组间Akt蛋白、AktSer473阳性单位值比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)(表 1, 2)。
图1
各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。1A.空白对照组; 1B.空白对照+干预组; 1C. DM组; 1D. DM+干预组。各组大鼠视网膜组织均可见Akt蛋白表达(白箭)，主要分布在视网膜内核层、节细胞层。空白对照组和空白对照+干预组表达最强，DM组表达最弱，DM+干预组居中DAB×400 图 2各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。2A.空白对照组; 2B.空白对照+干预组; 2C.DM组; 2D.DM+干预组。各组大鼠视网膜组织均可见Akt Ser473表达(白箭)，主要分布在神经上皮层、内丛状层、外核层和视网膜色素上皮层。空白对照组和空白对照+干预组表达最强，DM组表达最弱，DM+干预组居中DAB×400
表1
各组大鼠不同时间视网膜Akt蛋白的阳性单位值(
表2
各组大鼠不同时间视网膜Akt Ser473阳性单位值(视网膜铺片检查结果显示，空白对照组、空白对照+干预组大鼠视网膜血管自视盘发出的大血管向四周呈放射状分布，毛细血管分布均匀。与空白对照组大鼠视网膜比较，4周时，DM组、DM组+干预组大鼠视网膜无明显变化；8周时，DM组、DM组+干预组大鼠视网膜周边均可见毛细血管纡曲，形成扭结或血管袢及血管闭塞，但此改变DM组大鼠较DM组+干预组大鼠明显(图 3)。
图3
8周时大鼠视网膜血管铺片光学显微镜像。3A.空白对照组; 3B.空白对照+干预组; 3C.DM组; 3D.DM+干预组。空白对照组、空白对照+干预组视网膜大血管向四周呈放射状分布，毛细血管分布均匀；DM组、DM组+干预组大鼠视网膜周边均可见毛细血管纡曲、扭结或闭塞，但改变DM组较DM组+干预组大鼠ADP×40
3 讨论
DM患者因为高血糖可导致全身多组织器官微血管病变的发生，其中视网膜病变是其中最为严重的并发症之一。PI3K/Akt信号通路在DM血管内皮炎症、增生调控中起关键作用[2]。Akt作为PI3K信号通路的主要下游分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它在PI3K或缺氧微环境的刺激下发生磷酸化，其中Thr308位点和Ser473位点的同时磷酸化为Akt活化所必需[1]。Akt在DM血管内皮细胞凋亡、增生的调控中起关键作用，并且有研究表明PI3K/Akt途径可参与抑制炎症反应[6]。研究证明高糖条件下产生的活性氧簇(ROS)可使Akt去磷酸化，抑制Akt激活或加速其灭活，进而抑制其下游eNOS的产生而加速内皮细胞凋亡[7]。
坎地沙坦西酯为二苯四咪唑类血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，临床用于治疗高血压、心力衰竭、心肌梗死等[8]。目前有研究者认为坎地沙坦治疗2型DM轻中度视网膜病变，可延缓视网膜病变进程[9]。并且有研究证明对DM合并高血压的患者采取严格的血糖和血压控制，可显著减少DM眼病进展[10]。即使对于血压正常的患者，降压治疗对视网膜病变也有一定的疗效。故本研究进一步探索坎地沙坦作用于糖尿病视网膜病变的机制，以便为坎地沙坦参与对DR的保护作用提供新依据。本研究结果显示，经坎地沙坦治疗后，能明显使Akt磷酸化位点激活从而激活PI3K/Akt信号通路。该通路是抑制细胞凋亡及炎症的重要通路，不仅可以上调各种抗凋亡蛋白，还能通过转录因子抑制细胞凋亡及炎症，以达到对视网膜细胞的保护作用，提示坎地沙坦可以通过激活Akt蛋白从而保护DM大鼠视网膜的细胞。
Akt作为磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)信号通路的主要下游分子，在PI3K或缺氧微环境的刺激下发生磷酸化，其中Thr308位点和Ser473位点的同时磷酸化为Akt活化所必需[1]。PI3K/Akt信号通路在糖尿病(DM)血管内皮炎症、凋亡、增生调控中起关键作用[2]。PI3K/Akt激活剂坎地沙坦以其具有独立于降低血压以外的保护作用，已广泛应用于心脑血管及肾病的治疗[3, 4]。但坎地沙坦是否可以通过激活PI3K/Akt信号通路进而参与对视网膜细胞的保护作用尚不清楚。为此，我们对一组早期糖尿病大鼠进行消化道灌注坎地沙坦，观察其对大鼠视网膜中Akt蛋白及其磷酸化位点Akt Ser473表达的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司)，坎地沙坦(重庆圣华曦药业)，罗氏血糖仪(瑞士罗氏公司)，Akt及AktSer473鼠大鼠单克隆抗体(美国Santa公司)。
健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠78只，鼠龄1～2个月，体重180～220 g，无特定病原体级，重庆腾鑫实验动物中心提供。随机数字表法将大鼠分为空白对照组、实验组, 分别为36、42只大鼠。实验组大鼠按体重40 mg/kg经鼠尾静脉注射1%STZ制作DM模型；建模后72 h取尾静脉血，罗氏血糖仪检测血糖值＞16.7 mmol/L为建模成功。随机数字表法将空白对照组大鼠分为空白对照组、空白对照+干预组，均为18只大鼠。实验组剔除未成模及死亡大鼠6只，随机数字表法将大鼠分为DM组、DM+干预组，均为18只大鼠。建模后3 d，空白对照+干预组、DM+干预组大鼠10 mg/(kg·d)坎地沙坦灌胃, 隔日1次。空白对照组、DM组大鼠腹腔注射等体积柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。灌胃4、8周处死大鼠，摘除双眼眼球。左眼球行免疫组织化学染色测定，右眼球行视网膜铺片、酶组织化学染色检查。处死前测量大鼠体重及血糖。
制备视网膜石蜡切片，切片厚度5μm。梯度脱蜡和水化后，组织抗原行高温热修复；冷却至常温后冲洗5 min，3%过氧化氢消除内源性过氧化物酶；磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min，共3次；加入非免疫性动物血清阻断非特异性结合，20 min后甩去封闭液加一抗，4℃保湿，过夜；PBS洗5 min，共3次，滴加二抗，室温孵育30 min；PBS洗2 min，共3次，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，冲洗5 min，苏木精复染，逐级脱水，透明，中性树胶封片。每组取18张切片，每张切片取4个视野, 400倍光学显微镜下观察。Akt蛋白、AktSer473阳性表达均为细胞膜呈棕黄色或棕褐色染色。采用HMIAS-2000高清晰彩色病理图片报告分析系统(武汉千屏公司)测定阳性颗粒的阳性单位值。
视网膜剥离步骤参照文献[5]的方法。完整游离视网膜组织后，按照丝氨酸/苏氨酸激酶(ADP)染色方法对视网膜铺片进行染色，甘油明胶封片。光学显微镜下观察。
采用SPSS 18.0统计软件对数据行统计学分析处理。所有数据以均数±标准差(
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，建模后4、8周，空白对照组、空白对照组+干预组大鼠视网膜内核层、节细胞层可见大量Akt蛋白、Akt Ser473阳性表达；DM组大鼠视网膜内核层Akt总蛋白及Akt Ser473阳性表达明显少于空白对照组；与空白对照组比较，DM+干预组大鼠视网膜Akt总蛋白、Akt Ser473阳性表达明显增多，但仍少于空白对照组(图 1, 2)。4组间Akt蛋白、AktSer473阳性单位值比较，差异均有统计学意义(P＜0.01)(表 1, 2)。
图1
各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。1A.空白对照组; 1B.空白对照+干预组; 1C. DM组; 1D. DM+干预组。各组大鼠视网膜组织均可见Akt蛋白表达(白箭)，主要分布在视网膜内核层、节细胞层。空白对照组和空白对照+干预组表达最强，DM组表达最弱，DM+干预组居中DAB×400 图 2各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。2A.空白对照组; 2B.空白对照+干预组; 2C.DM组; 2D.DM+干预组。各组大鼠视网膜组织均可见Akt Ser473表达(白箭)，主要分布在神经上皮层、内丛状层、外核层和视网膜色素上皮层。空白对照组和空白对照+干预组表达最强，DM组表达最弱，DM+干预组居中DAB×400
表1
各组大鼠不同时间视网膜Akt蛋白的阳性单位值(
表2
各组大鼠不同时间视网膜Akt Ser473阳性单位值(视网膜铺片检查结果显示，空白对照组、空白对照+干预组大鼠视网膜血管自视盘发出的大血管向四周呈放射状分布，毛细血管分布均匀。与空白对照组大鼠视网膜比较，4周时，DM组、DM组+干预组大鼠视网膜无明显变化；8周时，DM组、DM组+干预组大鼠视网膜周边均可见毛细血管纡曲，形成扭结或血管袢及血管闭塞，但此改变DM组大鼠较DM组+干预组大鼠明显(图 3)。
图3
8周时大鼠视网膜血管铺片光学显微镜像。3A.空白对照组; 3B.空白对照+干预组; 3C.DM组; 3D.DM+干预组。空白对照组、空白对照+干预组视网膜大血管向四周呈放射状分布，毛细血管分布均匀；DM组、DM组+干预组大鼠视网膜周边均可见毛细血管纡曲、扭结或闭塞，但改变DM组较DM组+干预组大鼠ADP×40
3 讨论
DM患者因为高血糖可导致全身多组织器官微血管病变的发生，其中视网膜病变是其中最为严重的并发症之一。PI3K/Akt信号通路在DM血管内皮炎症、增生调控中起关键作用[2]。Akt作为PI3K信号通路的主要下游分子，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它在PI3K或缺氧微环境的刺激下发生磷酸化，其中Thr308位点和Ser473位点的同时磷酸化为Akt活化所必需[1]。Akt在DM血管内皮细胞凋亡、增生的调控中起关键作用，并且有研究表明PI3K/Akt途径可参与抑制炎症反应[6]。研究证明高糖条件下产生的活性氧簇(ROS)可使Akt去磷酸化，抑制Akt激活或加速其灭活，进而抑制其下游eNOS的产生而加速内皮细胞凋亡[7]。
坎地沙坦西酯为二苯四咪唑类血管紧张素Ⅱ受体拮抗药，临床用于治疗高血压、心力衰竭、心肌梗死等[8]。目前有研究者认为坎地沙坦治疗2型DM轻中度视网膜病变，可延缓视网膜病变进程[9]。并且有研究证明对DM合并高血压的患者采取严格的血糖和血压控制，可显著减少DM眼病进展[10]。即使对于血压正常的患者，降压治疗对视网膜病变也有一定的疗效。故本研究进一步探索坎地沙坦作用于糖尿病视网膜病变的机制，以便为坎地沙坦参与对DR的保护作用提供新依据。本研究结果显示，经坎地沙坦治疗后，能明显使Akt磷酸化位点激活从而激活PI3K/Akt信号通路。该通路是抑制细胞凋亡及炎症的重要通路，不仅可以上调各种抗凋亡蛋白，还能通过转录因子抑制细胞凋亡及炎症，以达到对视网膜细胞的保护作用，提示坎地沙坦可以通过激活Akt蛋白从而保护DM大鼠视网膜的细胞。
