引用本文： 田润, 梅妍, 陈臻, 方林, 李小芹. 血小板反应蛋白1活性片段VR-10合成多肽对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞增生及迁移的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(3): 274-278. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.03.015 复制
我们的前期研究发现，缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞中血小板反应蛋白-1(TSP-1)的表达随时间延长而减少，其可能作为血管生成的负向作用因子参与血管新生性疾病的发生发展[1]。近年来TSP-1在眼部的作用研究越来越多[2-5]，但有关TSP-1在眼部新生血管生成中的具体作用还不明确。研究表明，TSP-1是结构复杂的大分子糖蛋白，其中Ⅰ型重复序列(TSRs)被认为是抑制内皮细胞增生、诱导内皮细胞凋亡和抑制血管新生等作用的结构基础[6, 7]。而内皮细胞是血管生成的关键因素，抗血管生成治疗也多针对内皮细胞的增生及移行能力进行。为此，我们针对TSRs设计合成了活性片段VR-10合成多肽，观察其对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞(RF/6A)增生、迁移及凋亡相关基因的作用，以期为抗新生血管性疾病的防治提供新思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料、细胞培养及分组
RF/6A细胞株由陈伟博士惠赠。传代3~10代细胞用于实验。VR-10合成多肽由百奥泰生物科技(广州)公司合成，纯化及分析，肽序缬氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-异亮氨酸-精氨酸，分子量1 117.3，纯度97.85%。重组人TSP-1蛋白(美国R&D公司)，兔抗人凋亡相关因子配体(FAS)多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗人半胱天冬酶(caspase)-3多克隆抗体、羊抗兔IgG/异硫氰酸荧光素(FITC)、兔抗羊IgG/FITC(美国Santa Cruz公司)。
采用含10%牛血清蛋白(BSA)的最低必需培养液(MEM)，将RF/6A细胞株置于5% CO2、95%空气、90%湿度、37℃细胞培养箱中培养，次日更换培养液。
实验分为对照组、干预组进行。干预组包括0.1、1.0、10.0μg/ml VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组。各组细胞均采用含10%胎牛血清(FBS)的完全培养基培养，干预组在此基础上采用与其分组相对应的浓度、药物干预细胞。
1.2 实验方法
采用噻唑蓝(MTT)法检测干预组RF/6A细胞存活率。以100μl/孔接种细胞，细胞密度约为1×104个/ml，在5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中分别孵育6、12、24、48 h，每孔加入1倍MTT 50μl，在37℃孵育4 h。酶标仪在570 nm波长处检测每孔的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。实验重复3次。细胞存活率=(加药细胞A值/对照细胞A值)×100％。
细胞培养24 h后，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，换无血清MEM培养基饥饿培养6 h。0.25%胰酶消化后，含0.05%BSA无血清MEM培养基终止消化，调整细胞数为5×104个/ml。在24孔板、滤膜为8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜Transwell小室上室中加入细胞悬液200μl，下室加入含10%FBS的MEM培养基500μl。37℃培养24 h。上室经PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定迁移至上室外表面上的细胞，苏木精-伊红染色，显微镜下计算迁移细胞数。取5个视野计数穿膜细胞数并取均值。迁移抑制率=(对照组迁移细胞数-干预组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数×100％。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞中caspase-3、FAS的蛋白表达。提取细胞内总蛋白，配胶后蛋白上样，每个电泳道加样20μl，电压调至200 V，电泳。转膜后加一抗(FAS：1：200；caspase-3：1：400)，4℃过夜，加二抗羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(1：40 000)，37℃，1 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜4次。暗室内采用增强化学发光法检测目的条带，胶片曝光，定影并显影，将背景较高的底片放入X线片背景去除液中，观察到理想的结果时终止反应，用水清洗去除不需要的背景。阳性条带以Gel Pro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测量其A值。以目的条带与磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内参照条带的比值代表蛋白的表达水平。
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、FAS配体(FASL)及β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA表达。细胞消化后，将细胞密度为5×104个/ml的细胞悬液接种于6孔板，在37℃、5%CO2孵箱中培养24 h。待细胞近融合状态时，换含0.2%BSA的MEM培养基培养24 h后，加入含10.0μg/ml VR-10合成多肽的MEM完全培养基进行干预，不含合成多肽的MEM完全培养基为对照组，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后进行RT-PCR检测。每并列3孔为一组，实验重复3次。Trizol提取总RNA，经RT-PCR合成cDNA第1链，引物由上海生工公司合成。FASL：上游引物5′-ATG CAGCAGCCCTTCAATTA-3′，下游引物5′-ATCCT ACCAAGGCAACCAG-3′，扩增片段引物长度273碱基对(bp)；bcl-2：上游引物5′-CTGGGAGAACAGG GTACGA-3′，下游引物5′-ATGACCCCACCGAACT CAA-3′，扩增片段引物长度460 bp。FASL反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共30个循环，最终72℃延伸5 min；bcl-2反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共37个循环，最终72℃延伸5 min。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件行统计分析，数据以均数±标准差(
2 结果
MTT法检测结果显示，随作用时间延长，干预组RF/6A细胞存活率越低；随VR-10合成多肽浓度增加，RF/6A细胞存活率也越低。以作用48 h时10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率最低，为78%(图 1)。10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率与其他干预组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图1
不同作用时间干预组RF/6A细胞存活率比较
细胞培养24 h后，对照组，0.1、1.0、10.0μg/ml VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率分别为0.0%、11.8%、15.6%、56.8%、51.0%。以10.0μg/ml VR-10合成多肽组最高，1.0μg/ml TSP-1全肽组次之。与对照组比较，不同浓度VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。0.1μg/ml VR-10合成多肽组与1.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞迁移抑制率比较，差异无统计学意义(P=0.114)(图 2)。
图2
细胞培养24 h后各组RF/6A细胞迁移抑制率比较
Western blot检测结果显示，在相对分子质量32×103、20×103处可见caspase-3蛋白条带，在相对分子质量48×103处可见FAS蛋白条带(图 3)。10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RF/6A细胞中caspase-3(t=-66.240、138.813)、FAS(t=163.114)蛋白表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 4)。
图3
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组Western blot检测像。M.标记物；1、3、5分别为10.0μg/ml VR-10合成多肽组caspase-3、FAS、GAPDH；2、4、6分别为对照组caspase-3、FAS、GAPDH
图4
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组caspase-3、FAS蛋白表达比较
RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，10.0μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(t=-67.419，P=0.000)；FASL mRNA表达明显增强，差异也有统计学意义(t=39.365，P=0.001)(图 5，6)。
图5
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RT-PCR检测像。M.标记物；1、3、5分别为10.0μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2、FASL、β-actin；2、4、6分别为对照组bcl-2、FASL、β-actin
图6
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组bcl-2、FASL mRNA表达比较
3 讨论
TSRs作为TSP-1抗血管生成的主要活性区域受到广泛关注。通过化学合成多肽方法可认识其作用并为药物开发提供理论依据[7]。TSRs主要包括3个活性片段序列：(1) CSVTCG序列，可抑制成纤维细胞生长因子(FGF)-2和VEGF诱导的鸡绒毛膜尿囊膜内毛细血管的形成[8, 9]；(2) WSHWSPW序列，可抑制FGF-2诱导的血管形成，而对VEGF诱导的血管新生无作用[8, 9]；(3) GVITRIR序列，对FGF-2和VEGF诱导的内皮细胞移行有抑制作用，可抗血管新生[10]。本研究设计合成多肽VR-10是包含GVITRIR序列及VTC氨基酸的十肽分子，且处于TSP-1抗血管新生活性区段，既排除了TSP-1 C-端促血管新生区域及与血管新生无关的其他调节区对治疗作用的干扰，又有效地解决了临床上应用大分子多肽在药代动力学上的困难。
血管生成的一个主要步骤是内皮细胞的增生，TSP-1在体外可直接抑制兔黄体、牛肾上腺皮质、肺动脉、人脐静脉及牛视网膜内皮细胞的增生，这种抑制作用被抗TSP-1单克隆抗体所中和[11, 12]。本研究应用MTT法检测TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞亦显示出抑制作用，且合成多肽具有剂量依赖性。RF/6A细胞属于微血管内皮细胞，作为血管新生的载体细胞，对其增生的抑制是TSP-1全肽及VR-10合成多肽参与抗血管生成活性的一个主要方面。
内皮细胞在细胞因子的趋化下发生迁移，在异常血管新生中起重要作用。本研究运用Transwell小室迁移实验证实TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用，与Yafai等[12]研究结果相似。血管新生与内皮细胞迁移有关，TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞迁移的抑制作用可能是其抗血管新生的机制之一。
Bcl-2基因过度表达可以促进细胞生存，但不能通过刺激细胞分裂、增生、阻断细胞凋亡而延长细胞寿命，因而又被称为生存基因[13]。Nör等[14]研究发现，TSP-1诱导人皮肤微血管内皮细胞凋亡呈剂量依赖性，添加TSP-1于人皮肤微血管内皮细胞培养后，bcl-2表达减少2.2倍。本研究结果显示，10.0μg/ml VR-10合成多肽作用RF/6A细胞表达bcl-2 mRNA较对照组减少。说明VR-10合成多肽亦可通过改变bcl-2的基因表达而参与RF/6A细胞的凋亡。
FAS是细胞膜Ⅰ型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体家族，主要以膜受体形式存在，在细胞凋亡中具有信号传导作用。FAS与FASL结合使细胞表面FAS分子交联，凋亡信号被传到细胞内，通过调节蛋白，征集活化caspase-8，启动级联反应导致细胞死亡，所以FASL又称死亡因子[15]。Volpert等[9]研究发现，皮肤微血管内皮细胞持续低量表达FAS及FASL。TSP-1通过上调FASL表达诱导凋亡外部途径的活化。对于FAS/FASL缺陷小鼠，TSP-1不能抑制碱性FGF诱导的角膜新生血管，提示FAS/FASL凋亡受体途径在TSP-1诱导凋亡中起重要作用。本研究结果显示，10.0μg/mlVR-10合成多肽作用RF/6A细胞表达FASL mRNA及FAS蛋白较对照组增加。提示该合成多肽通过FAS/FASL途径诱导细胞凋亡。
细胞凋亡是caspase-3家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，亦是caspase酶联反应的终末因子。我们发现，在相对分子质量32×103、20×103处可见caspase-3蛋白条带。说明对照组RF/6A细胞中caspase-3蛋白多为无活性酶原形式，在10.0μg/ml VR-10合成多肽处理作用下，表达FASL mRNA及FAS蛋白均有增加，从而使得caspase-3蛋白被激活产生活性小分子片段。提示VR-10合成多肽亦存在依赖caspase-3活化介导的内皮细胞凋亡而下调血管生成。
本研究结果表明，TSP-1活性片段VR-10合成多肽对RF/6A细胞增生、迁移具有抑制作用，通过增加凋亡促进基因FAS/FASL而活化caspase-3，同时伴有生存基因bcl-2的减少，共同作用介导内皮细胞凋亡。提示VR-10合成多肽可为抗新生血管性疾病的防治提供新思路。但本研究未能在缺氧条件下深入分析VR-10合成多肽对内皮细胞的影响，是一不足。有关VR-10合成多肽在新生血管性疾病中的确切作用尚有待进一步研究来探讨。
我们的前期研究发现，缺氧状态下人视网膜色素上皮细胞中血小板反应蛋白-1(TSP-1)的表达随时间延长而减少，其可能作为血管生成的负向作用因子参与血管新生性疾病的发生发展[1]。近年来TSP-1在眼部的作用研究越来越多[2-5]，但有关TSP-1在眼部新生血管生成中的具体作用还不明确。研究表明，TSP-1是结构复杂的大分子糖蛋白，其中Ⅰ型重复序列(TSRs)被认为是抑制内皮细胞增生、诱导内皮细胞凋亡和抑制血管新生等作用的结构基础[6, 7]。而内皮细胞是血管生成的关键因素，抗血管生成治疗也多针对内皮细胞的增生及移行能力进行。为此，我们针对TSRs设计合成了活性片段VR-10合成多肽，观察其对恒河猴脉络膜视网膜内皮细胞(RF/6A)增生、迁移及凋亡相关基因的作用，以期为抗新生血管性疾病的防治提供新思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料、细胞培养及分组
RF/6A细胞株由陈伟博士惠赠。传代3~10代细胞用于实验。VR-10合成多肽由百奥泰生物科技(广州)公司合成，纯化及分析，肽序缬氨酸-苏氨酸-半胱氨酸-甘氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-精氨酸-异亮氨酸-精氨酸，分子量1 117.3，纯度97.85%。重组人TSP-1蛋白(美国R&D公司)，兔抗人凋亡相关因子配体(FAS)多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，兔抗人半胱天冬酶(caspase)-3多克隆抗体、羊抗兔IgG/异硫氰酸荧光素(FITC)、兔抗羊IgG/FITC(美国Santa Cruz公司)。
采用含10%牛血清蛋白(BSA)的最低必需培养液(MEM)，将RF/6A细胞株置于5% CO2、95%空气、90%湿度、37℃细胞培养箱中培养，次日更换培养液。
实验分为对照组、干预组进行。干预组包括0.1、1.0、10.0μg/ml VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组。各组细胞均采用含10%胎牛血清(FBS)的完全培养基培养，干预组在此基础上采用与其分组相对应的浓度、药物干预细胞。
1.2 实验方法
采用噻唑蓝(MTT)法检测干预组RF/6A细胞存活率。以100μl/孔接种细胞，细胞密度约为1×104个/ml，在5% CO2空气及100%湿度的细胞培养箱中分别孵育6、12、24、48 h，每孔加入1倍MTT 50μl，在37℃孵育4 h。酶标仪在570 nm波长处检测每孔的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值。实验重复3次。细胞存活率=(加药细胞A值/对照细胞A值)×100％。
细胞培养24 h后，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，换无血清MEM培养基饥饿培养6 h。0.25%胰酶消化后，含0.05%BSA无血清MEM培养基终止消化，调整细胞数为5×104个/ml。在24孔板、滤膜为8μm孔径的聚碳酸脂微孔滤膜Transwell小室上室中加入细胞悬液200μl，下室加入含10%FBS的MEM培养基500μl。37℃培养24 h。上室经PBS洗涤后，用4%多聚甲醛固定迁移至上室外表面上的细胞，苏木精-伊红染色，显微镜下计算迁移细胞数。取5个视野计数穿膜细胞数并取均值。迁移抑制率=(对照组迁移细胞数-干预组迁移细胞数)/对照组迁移细胞数×100％。
采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞中caspase-3、FAS的蛋白表达。提取细胞内总蛋白，配胶后蛋白上样，每个电泳道加样20μl，电压调至200 V，电泳。转膜后加一抗(FAS：1：200；caspase-3：1：400)，4℃过夜，加二抗羊抗兔IgG/辣根过氧化物酶(1：40 000)，37℃，1 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗膜4次。暗室内采用增强化学发光法检测目的条带，胶片曝光，定影并显影，将背景较高的底片放入X线片背景去除液中，观察到理想的结果时终止反应，用水清洗去除不需要的背景。阳性条带以Gel Pro4.0版凝胶光密度分析软件进行分析，测量其A值。以目的条带与磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)内参照条带的比值代表蛋白的表达水平。
采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞中B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、FAS配体(FASL)及β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA表达。细胞消化后，将细胞密度为5×104个/ml的细胞悬液接种于6孔板，在37℃、5%CO2孵箱中培养24 h。待细胞近融合状态时，换含0.2%BSA的MEM培养基培养24 h后，加入含10.0μg/ml VR-10合成多肽的MEM完全培养基进行干预，不含合成多肽的MEM完全培养基为对照组，在37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后进行RT-PCR检测。每并列3孔为一组，实验重复3次。Trizol提取总RNA，经RT-PCR合成cDNA第1链，引物由上海生工公司合成。FASL：上游引物5′-ATG CAGCAGCCCTTCAATTA-3′，下游引物5′-ATCCT ACCAAGGCAACCAG-3′，扩增片段引物长度273碱基对(bp)；bcl-2：上游引物5′-CTGGGAGAACAGG GTACGA-3′，下游引物5′-ATGACCCCACCGAACT CAA-3′，扩增片段引物长度460 bp。FASL反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共30个循环，最终72℃延伸5 min；bcl-2反应条件：95℃预变性5 min，94℃30 s，54℃30 s，72℃30 s，共37个循环，最终72℃延伸5 min。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相。
1.3 统计学方法
采用SPSS 16.0统计软件行统计分析，数据以均数±标准差(
2 结果
MTT法检测结果显示，随作用时间延长，干预组RF/6A细胞存活率越低；随VR-10合成多肽浓度增加，RF/6A细胞存活率也越低。以作用48 h时10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率最低，为78%(图 1)。10.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞存活率与其他干预组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图1
不同作用时间干预组RF/6A细胞存活率比较
细胞培养24 h后，对照组，0.1、1.0、10.0μg/ml VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率分别为0.0%、11.8%、15.6%、56.8%、51.0%。以10.0μg/ml VR-10合成多肽组最高，1.0μg/ml TSP-1全肽组次之。与对照组比较，不同浓度VR-10合成多肽组及1.0μg/ml TSP-1全肽组RF/6A细胞迁移抑制率均明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。0.1μg/ml VR-10合成多肽组与1.0μg/ml VR-10合成多肽组RF/6A细胞迁移抑制率比较，差异无统计学意义(P=0.114)(图 2)。
图2
细胞培养24 h后各组RF/6A细胞迁移抑制率比较
Western blot检测结果显示，在相对分子质量32×103、20×103处可见caspase-3蛋白条带，在相对分子质量48×103处可见FAS蛋白条带(图 3)。10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RF/6A细胞中caspase-3(t=-66.240、138.813)、FAS(t=163.114)蛋白表达比较，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 4)。
图3
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组Western blot检测像。M.标记物；1、3、5分别为10.0μg/ml VR-10合成多肽组caspase-3、FAS、GAPDH；2、4、6分别为对照组caspase-3、FAS、GAPDH
图4
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组caspase-3、FAS蛋白表达比较
RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，10.0μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2 mRNA表达明显降低，差异有统计学意义(t=-67.419，P=0.000)；FASL mRNA表达明显增强，差异也有统计学意义(t=39.365，P=0.001)(图 5，6)。
图5
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组RT-PCR检测像。M.标记物；1、3、5分别为10.0μg/ml VR-10合成多肽组bcl-2、FASL、β-actin；2、4、6分别为对照组bcl-2、FASL、β-actin
图6
10.0μg/ml VR-10合成多肽组与对照组bcl-2、FASL mRNA表达比较
3 讨论
TSRs作为TSP-1抗血管生成的主要活性区域受到广泛关注。通过化学合成多肽方法可认识其作用并为药物开发提供理论依据[7]。TSRs主要包括3个活性片段序列：(1) CSVTCG序列，可抑制成纤维细胞生长因子(FGF)-2和VEGF诱导的鸡绒毛膜尿囊膜内毛细血管的形成[8, 9]；(2) WSHWSPW序列，可抑制FGF-2诱导的血管形成，而对VEGF诱导的血管新生无作用[8, 9]；(3) GVITRIR序列，对FGF-2和VEGF诱导的内皮细胞移行有抑制作用，可抗血管新生[10]。本研究设计合成多肽VR-10是包含GVITRIR序列及VTC氨基酸的十肽分子，且处于TSP-1抗血管新生活性区段，既排除了TSP-1 C-端促血管新生区域及与血管新生无关的其他调节区对治疗作用的干扰，又有效地解决了临床上应用大分子多肽在药代动力学上的困难。
血管生成的一个主要步骤是内皮细胞的增生，TSP-1在体外可直接抑制兔黄体、牛肾上腺皮质、肺动脉、人脐静脉及牛视网膜内皮细胞的增生，这种抑制作用被抗TSP-1单克隆抗体所中和[11, 12]。本研究应用MTT法检测TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞亦显示出抑制作用，且合成多肽具有剂量依赖性。RF/6A细胞属于微血管内皮细胞，作为血管新生的载体细胞，对其增生的抑制是TSP-1全肽及VR-10合成多肽参与抗血管生成活性的一个主要方面。
内皮细胞在细胞因子的趋化下发生迁移，在异常血管新生中起重要作用。本研究运用Transwell小室迁移实验证实TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞迁移具有抑制作用，与Yafai等[12]研究结果相似。血管新生与内皮细胞迁移有关，TSP-1全肽及VR-10合成多肽对RF/6A细胞迁移的抑制作用可能是其抗血管新生的机制之一。
Bcl-2基因过度表达可以促进细胞生存，但不能通过刺激细胞分裂、增生、阻断细胞凋亡而延长细胞寿命，因而又被称为生存基因[13]。Nör等[14]研究发现，TSP-1诱导人皮肤微血管内皮细胞凋亡呈剂量依赖性，添加TSP-1于人皮肤微血管内皮细胞培养后，bcl-2表达减少2.2倍。本研究结果显示，10.0μg/ml VR-10合成多肽作用RF/6A细胞表达bcl-2 mRNA较对照组减少。说明VR-10合成多肽亦可通过改变bcl-2的基因表达而参与RF/6A细胞的凋亡。
FAS是细胞膜Ⅰ型糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体家族，主要以膜受体形式存在，在细胞凋亡中具有信号传导作用。FAS与FASL结合使细胞表面FAS分子交联，凋亡信号被传到细胞内，通过调节蛋白，征集活化caspase-8，启动级联反应导致细胞死亡，所以FASL又称死亡因子[15]。Volpert等[9]研究发现，皮肤微血管内皮细胞持续低量表达FAS及FASL。TSP-1通过上调FASL表达诱导凋亡外部途径的活化。对于FAS/FASL缺陷小鼠，TSP-1不能抑制碱性FGF诱导的角膜新生血管，提示FAS/FASL凋亡受体途径在TSP-1诱导凋亡中起重要作用。本研究结果显示，10.0μg/mlVR-10合成多肽作用RF/6A细胞表达FASL mRNA及FAS蛋白较对照组增加。提示该合成多肽通过FAS/FASL途径诱导细胞凋亡。
细胞凋亡是caspase-3家族成员介导的蛋白酶级联反应过程，caspase-3是细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，亦是caspase酶联反应的终末因子。我们发现，在相对分子质量32×103、20×103处可见caspase-3蛋白条带。说明对照组RF/6A细胞中caspase-3蛋白多为无活性酶原形式，在10.0μg/ml VR-10合成多肽处理作用下，表达FASL mRNA及FAS蛋白均有增加，从而使得caspase-3蛋白被激活产生活性小分子片段。提示VR-10合成多肽亦存在依赖caspase-3活化介导的内皮细胞凋亡而下调血管生成。
本研究结果表明，TSP-1活性片段VR-10合成多肽对RF/6A细胞增生、迁移具有抑制作用，通过增加凋亡促进基因FAS/FASL而活化caspase-3，同时伴有生存基因bcl-2的减少，共同作用介导内皮细胞凋亡。提示VR-10合成多肽可为抗新生血管性疾病的防治提供新思路。但本研究未能在缺氧条件下深入分析VR-10合成多肽对内皮细胞的影响，是一不足。有关VR-10合成多肽在新生血管性疾病中的确切作用尚有待进一步研究来探讨。
