引用本文： 庄淼, 邵珺, 谭澄烨, 姚勇. 转甲状腺素蛋白对视网膜微血管内皮细胞生物学行为的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(4): 368-370. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.04.014 复制
转甲状腺素蛋白(TTR)也称前白蛋白，为相对分子质量55×103的同源四聚体蛋白，主要由肝脏、脉络膜丛和胰岛细胞等合成。在眼内，视网膜色素上皮(RPE)细胞是TTR的唯一来源 [1]。TTR是20种淀粉样蛋白之一，除了涉及多种形式基因突变的玻璃体淀粉样变性的研究外[2-4]，亦有TTR血清或玻璃体浓度在糖尿病视网膜病变、高度近视等疾病中存在异常表达的报道[5-10]。然而TTR浓度的差异表达是否对疾病有作用，其作用的途径、机制和靶点等仍有待于进一步基础研究。视网膜微血管内皮细胞(RMVEC)是研究诸多眼科疾病基础的重要媒介[11, 12]。本研究通过了解TTR对RMVEC生物学行为的影响，希望从细胞学角度了解TTR是否对RMVEC有作用，为进一步研究其机制提供实验依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
RMVEC(实验室自存)，澳洲胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)，Dulbecco改良Eagle(DMEM)/F12培养基(美国Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(凯基生物科技发展有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Amresco公司)，人血浆前白蛋白(prealbumin human plasma，美国Millipore公司)，24孔Transwell培养板(美国Corning公司)。
RMVEC置于含100 ml/L FBS的DMEM/F12培养基，37℃，5%CO2培养箱中传代培养，1.25 g/L胰蛋白酶和1 g/L EDTA消化。取第6～8代细胞用于实验。 用不含FBS的DMEM/F12培养基溶解干粉状TTR，以TTR浓度不同分为0(初始浓度)、4 μmol/L组。
以细胞密度1×104个/孔将RMVEC接种于96孔板中，共10孔，每5孔归入一组。每孔加入200 μl相应蛋白浓度的无血清DMEM/F12培养基,培养48 h后加入MTT溶液，继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡混匀10 min，490 nm波长酶标仪检测其吸光度[A,旧称光密度(OD)]值。按公式计算细胞增生的提升率：提升率(%)=(1-4 μmol/L 组A值/初始浓度组A值)×100%。
在24孔板各孔内分别加入含有0、4 μmol/L TTR的无血清DMEM/F12培养基600 μl，同时置入孔径为8.0 μm的Transwell小室，小室内加入200 μl 含1×104个RMVEC的无FBS培养基培养。48 h后吸弃上下室培养基，用棉签擦净上室内细胞，24孔板内加入0.4 g/L多聚甲醛600 μl室温固定30 min，吸弃多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗小室背面2遍，24孔板内加入结晶紫600 μl，室温染色20 min，吸出后PBS冲洗小室背面2遍。显微镜下观察照相，随机取5个视野进行细胞计数。
预先用记号笔在35 mm培养皿底面作井字形标记，接种培养RMVEC，待细胞密度近100%时，使用10 μl枪头根据井字形标记划痕，PBS冲洗后更换培养基，分别加入0、4 μmol/L浓度TTR，于0(初始时间)、24、48 h分别拍摄各皿细胞显微图像，ImageJ图像软件测量边缘距离变化。
应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差(
2 结果
MTT法检测结果显示，初始浓度组、4 μmol/L组A值分别为0.17±0.02、0.40±0.03。两组A值比较，差异有统计学意义(t=15.47，P=0.0001)(图 1)。4 μmol/L组细胞增生率较初始浓度组提升57.4%。
图1
48 h不同浓度TTR对RMVEC增生的影响。*P<0.01
细胞迁移实验结果显示，初始浓度组、4 μmol/L组RMVEC向外迁移数分别为(140±7)、(227±14)个。 两组间RMVEC向外迁移数比较，差异有统计学意义(t=5.44，P=0.000 6)(图 2)。
图2
48 h不同浓度TTR 对RMVEC迁移的影响。*P<0.01
细胞划痕实验结果显示，初始时间各组细胞划痕间距大致相等；24 h，初始浓度组、4 μmol/L组划痕愈合距离分别为(134.4±45.4)、(330.0±23.1) μm。两组细胞划痕愈合距离比较，差异有统计学意义(t=8.25，P<0.01)。48 h，4 μmol/L组完全愈合，初始浓度组未愈合(图 3)。
图3
细胞划痕实验结果。3A.细胞显微镜像；3B.初始浓度组、4 μmol/L组细胞愈合距离比较。*P<0.01
3 讨论
TTR在体内的主要作用是转运甲状腺素或与视黄醇结合蛋白结合，参与视黄醇的转运[13]。TTR血液或玻璃体浓度在一些系统及眼疾病状态下与正常状态之间存在差异[5-10, 14-17]。郭悦江等[18]利用siRNA沉默了前列腺癌PC3细胞表达的TTR，发现TTR对PC3细胞的生长和转移有明显的促进作用。本研究同样从生物学行为的角度，发现TTR对RMVEC的影响。本研究在预实验中设置了TTR浓度分别0、2、4、6 μmol/L共4组，未发现2、4、6 μmol/L组间存在明显差异。由于人体内TTR正常浓度为4 μmol/L[19]，因此本研究采用0、4 μmol/L两个浓度进行进一步的观察。通过采用MMT法、细胞迁移实验、细胞划痕实验等经典实验方法，经过反复多次实验，结果一致。说明TTR的确能影响RMVEC的增生、迁移、损伤愈合能力，这对通过RMVEC研究眼科疾病的发生发展提供了一条新思路。
然而，TTR对RMVEC作用的上下游细胞因子尚未在本实验中明确。在前列腺癌PC3细胞系中，证实了TTR是通过c-myc信号通路对其产生生物学行为方面的影响[20, 21]。在研究家族淀粉样变性时，检测到血清和玻璃体中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度变化[2, 17]。而TTR是否是通过VEGF实现对RMVEC的作用亦有待进一步研究证实。此外，RPE细胞、Müller细胞等在眼部生理和解剖中都扮演重要的作用，TTR对它们的影响亦有待深入的研究。
转甲状腺素蛋白(TTR)也称前白蛋白，为相对分子质量55×103的同源四聚体蛋白，主要由肝脏、脉络膜丛和胰岛细胞等合成。在眼内，视网膜色素上皮(RPE)细胞是TTR的唯一来源 [1]。TTR是20种淀粉样蛋白之一，除了涉及多种形式基因突变的玻璃体淀粉样变性的研究外[2-4]，亦有TTR血清或玻璃体浓度在糖尿病视网膜病变、高度近视等疾病中存在异常表达的报道[5-10]。然而TTR浓度的差异表达是否对疾病有作用，其作用的途径、机制和靶点等仍有待于进一步基础研究。视网膜微血管内皮细胞(RMVEC)是研究诸多眼科疾病基础的重要媒介[11, 12]。本研究通过了解TTR对RMVEC生物学行为的影响，希望从细胞学角度了解TTR是否对RMVEC有作用，为进一步研究其机制提供实验依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
RMVEC(实验室自存)，澳洲胎牛血清(FBS，美国Gibco公司)，Dulbecco改良Eagle(DMEM)/F12培养基(美国Hyclone公司)，0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(凯基生物科技发展有限公司)，二甲基亚砜(DMSO，美国Amresco公司)，人血浆前白蛋白(prealbumin human plasma，美国Millipore公司)，24孔Transwell培养板(美国Corning公司)。
RMVEC置于含100 ml/L FBS的DMEM/F12培养基，37℃，5%CO2培养箱中传代培养，1.25 g/L胰蛋白酶和1 g/L EDTA消化。取第6～8代细胞用于实验。 用不含FBS的DMEM/F12培养基溶解干粉状TTR，以TTR浓度不同分为0(初始浓度)、4 μmol/L组。
以细胞密度1×104个/孔将RMVEC接种于96孔板中，共10孔，每5孔归入一组。每孔加入200 μl相应蛋白浓度的无血清DMEM/F12培养基,培养48 h后加入MTT溶液，继续培养4 h后弃上清，每孔加入150 μl DMSO，震荡混匀10 min，490 nm波长酶标仪检测其吸光度[A,旧称光密度(OD)]值。按公式计算细胞增生的提升率：提升率(%)=(1-4 μmol/L 组A值/初始浓度组A值)×100%。
在24孔板各孔内分别加入含有0、4 μmol/L TTR的无血清DMEM/F12培养基600 μl，同时置入孔径为8.0 μm的Transwell小室，小室内加入200 μl 含1×104个RMVEC的无FBS培养基培养。48 h后吸弃上下室培养基，用棉签擦净上室内细胞，24孔板内加入0.4 g/L多聚甲醛600 μl室温固定30 min，吸弃多聚甲醛，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗小室背面2遍，24孔板内加入结晶紫600 μl，室温染色20 min，吸出后PBS冲洗小室背面2遍。显微镜下观察照相，随机取5个视野进行细胞计数。
预先用记号笔在35 mm培养皿底面作井字形标记，接种培养RMVEC，待细胞密度近100%时，使用10 μl枪头根据井字形标记划痕，PBS冲洗后更换培养基，分别加入0、4 μmol/L浓度TTR，于0(初始时间)、24、48 h分别拍摄各皿细胞显微图像，ImageJ图像软件测量边缘距离变化。
应用SPSS 15.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差(
2 结果
MTT法检测结果显示，初始浓度组、4 μmol/L组A值分别为0.17±0.02、0.40±0.03。两组A值比较，差异有统计学意义(t=15.47，P=0.0001)(图 1)。4 μmol/L组细胞增生率较初始浓度组提升57.4%。
图1
48 h不同浓度TTR对RMVEC增生的影响。*P<0.01
细胞迁移实验结果显示，初始浓度组、4 μmol/L组RMVEC向外迁移数分别为(140±7)、(227±14)个。 两组间RMVEC向外迁移数比较，差异有统计学意义(t=5.44，P=0.000 6)(图 2)。
图2
48 h不同浓度TTR 对RMVEC迁移的影响。*P<0.01
细胞划痕实验结果显示，初始时间各组细胞划痕间距大致相等；24 h，初始浓度组、4 μmol/L组划痕愈合距离分别为(134.4±45.4)、(330.0±23.1) μm。两组细胞划痕愈合距离比较，差异有统计学意义(t=8.25，P<0.01)。48 h，4 μmol/L组完全愈合，初始浓度组未愈合(图 3)。
图3
细胞划痕实验结果。3A.细胞显微镜像；3B.初始浓度组、4 μmol/L组细胞愈合距离比较。*P<0.01
3 讨论
TTR在体内的主要作用是转运甲状腺素或与视黄醇结合蛋白结合，参与视黄醇的转运[13]。TTR血液或玻璃体浓度在一些系统及眼疾病状态下与正常状态之间存在差异[5-10, 14-17]。郭悦江等[18]利用siRNA沉默了前列腺癌PC3细胞表达的TTR，发现TTR对PC3细胞的生长和转移有明显的促进作用。本研究同样从生物学行为的角度，发现TTR对RMVEC的影响。本研究在预实验中设置了TTR浓度分别0、2、4、6 μmol/L共4组，未发现2、4、6 μmol/L组间存在明显差异。由于人体内TTR正常浓度为4 μmol/L[19]，因此本研究采用0、4 μmol/L两个浓度进行进一步的观察。通过采用MMT法、细胞迁移实验、细胞划痕实验等经典实验方法，经过反复多次实验，结果一致。说明TTR的确能影响RMVEC的增生、迁移、损伤愈合能力，这对通过RMVEC研究眼科疾病的发生发展提供了一条新思路。
然而，TTR对RMVEC作用的上下游细胞因子尚未在本实验中明确。在前列腺癌PC3细胞系中，证实了TTR是通过c-myc信号通路对其产生生物学行为方面的影响[20, 21]。在研究家族淀粉样变性时，检测到血清和玻璃体中血管内皮生长因子(VEGF)的浓度变化[2, 17]。而TTR是否是通过VEGF实现对RMVEC的作用亦有待进一步研究证实。此外，RPE细胞、Müller细胞等在眼部生理和解剖中都扮演重要的作用，TTR对它们的影响亦有待深入的研究。
