引用本文： 周贤慧, 孟旭霞, 孙运波, 胡迭, 郭庆敏. 轴突导向因子netrin-1对早期糖尿病大鼠血视网膜屏障的影响. 中华眼底病杂志, 2015, 31(5): 472-476. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2015.05.015 复制
糖尿病视网膜病变(DR)早期视网膜血管通透性增高，血视网膜屏障(BRB)破坏，晚期出现病理性新生血管，导致视力严重下降[1]。因此，在DR早期，保护BRB，防止血管通透性损害是阻止DR进展的关键因素之一[2]。轴突导向因子netrin-1为可溶性神经导向因子[3]，能特异性识别环境中因子，向细胞内传递吸引或排斥信号以介导轴突的生长方向。近年研究发现，netrin-1不仅具有神经导向作用，对血管的生成同样起诱导和调控作用[4, 5]。但netrin-1对DR血管通透性是否有影响，在DR新生血管形成前期是否也具有调控作用尚不清楚。为此，我们观察了外源性netrin-1玻璃体腔注射后，糖尿病(DM)大鼠视网膜血管通透性变化，并对其变化发生的可能机制进行了分析探讨。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体重约250 g，清洁级，山东鲁抗医药公司提供，青岛大学动物房饲养。随机数字表法将其分为正常对照组、DM+平衡盐溶液(BSS)组、DM+ netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组。每组均为20只大鼠。正常对照组外的60只大鼠按60 mg/kg剂量左下腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导DM动物模型。72 h后测空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM造模成功，继续高糖高脂饲养3个月，期间定期监测血糖，使血糖维持在成模要求的范围直至实验结束。
DM建模成功后3个月，DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠玻璃体腔分别注射10、100μg/ml的外源性netrin-1 5μl；DM+BSS组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS；正常对照组大鼠不做任何处理。玻璃体腔注射时斜行进针，注射结束后按压穿刺口3 min。所有实验眼未出现巩膜口漏及高眼压。
伊凡思蓝(EB)测定视网膜血管通透性。DM 4个月时，各组随机选取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，按45 mg/kg剂量尾静脉注入EB。循环120 min后，1%多聚甲醛以66 ml/min行心脏灌注2 min。灌注结束后摘除眼球，剥离视网膜，4℃过夜晾干后称干重。每一个视网膜加甲酰胺0.3 ml，70℃孵育18 h，分别测定620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值差。差值×1000=净A值。每一样本测量3次，取平均值。计算EB经视网膜血管的渗漏量：[视网膜EB量(mg)/视网膜干重(g)]/[单位时间内血浆EB量(mg)/血浆体积(μl)×循环时间(h)]，结果以ng/mg表示。以平均积分A值(IA值)表示视网膜闭合蛋白(occludin)的表达量。苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜微血管的病理改变；免疫组织化学染色检测occludin的表达。DM 4个月时，每组随机选取5只大鼠过量麻醉法处死。迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，作5μm厚度的连续切片。石蜡切片常规脱蜡和水化后，抗原修复，5%山羊血清封闭，一抗兔抗大鼠occludin多克隆抗体(1 ：200)，二抗生物素标记山羊抗兔IgG抗体，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。Image pro plus 6.0软件进行图像分析。
荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测视网膜occldin mRNA表达。DM 4个月时，每组随机选取5只大鼠过量麻醉处死。每50～100 mg视网膜加1 ml RNAiso plus，裂解视网膜组织；提取视网膜总RNA，DNase试剂盒去除RNA内残留DNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白(actin)基因作为内参，occludin引物双链嵌合荧光染色法(SYBR GreenⅠ)扩增相应基因。Occludin上游引物序列：5′-CCTGTC TATGCTCGTCATCG-3′；下游引物序列: 5′-TAGCC GTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin上游引物序列: 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；下游引物序列: 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度为60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环数，即Ct值。正常对照组大鼠视网膜occludin mRNA表达量设为1。
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析处理。定量资料结果以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，大鼠腹腔注射STZ后4个月，DM+BSS组大鼠视网膜神经节细胞层水肿，内、外核层细胞数减少伴排列紊乱，视网膜微血管不规则扩张，结构异常。玻璃体注射netrin-1后视网膜神经节细胞水肿减轻，数量增多，视网膜微血管扩张程度减轻(图 1)。
图1
DM+BSS组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜组织光学显微镜像。1A.DM+BSS组；1B. DM+netrin-1高剂量组。DM+BSS组大鼠视网膜神经节细胞层水肿明显，视网膜微血管纡曲扩张；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜神经节细胞层水肿减轻，微血管扩张减轻 HE×100
免疫组织化学染色结果显示，正常对照组大鼠视网膜棕黄色颗粒主要集中于视网膜血管壁周围，其中神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层及内核层也有少量分布；DM+BSS组大鼠视网膜棕黄色颗粒颜色变浅，染色范围缩小；DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜棕黄色颗粒较DM+BSS组深；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜棕黄色颗粒较DM+netrin-1低剂量组进一步加深(图 2)。
图2
各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。2A.正常对照组；2B. DM+BSS组；2C. DM+netrin-1低剂量组；2D. DM+netrin-1高剂量组。正常对照组大鼠视网膜occludin主要表达于血管周围；DM+BSS组大鼠视网膜occludin表达明显减少。玻璃体腔注射netirn-1后视网膜occludin表达增多，且DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜occludin的表达量较DM+netrin-1低剂量组高 DAB×40
正常对照组、DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜IA值分别为4.83±0.82、1.33±0.31、2.52±0.56、3.01±0.67。正常对照组视网膜IA值与DM+BSS组比较，差异有统计学意义(t=26.99, P=0.00)；DM+BSS组、DM+ netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组间大鼠视网膜IA值比较，差异有统计学意义(F=177.13, P=0.00)，且DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜occludin表达较低剂量组高。DM+BSS组大鼠视网膜IA值与DM+netrin-1低剂量组比较，差异有统计学意义(t=-13.98, P=0.00)；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜IA值与正常对照组比较，差异有统计学意义(t=12.87, P=0.00)。
RT-PCR检测结果显示，与正常对照组大鼠视网膜中occludin mRNA表达比较，其余各组大鼠视网膜中occludin mRNA表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 1)。DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜occludin mRNA表达与DM+BSS组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜中occludin mRNA表达与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
表1
各组大鼠视网膜中occludin mRNA的表达量比较
视网膜通透性检测结果显示，正常对照组、DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜EB渗漏量分别为(12.27±2.51)、(34.46±5.11)、(29.22±3.82)、(21.45±3.91) ng/mg。DM+BSS组大鼠视网膜EB渗漏量较正常对照组高，差异有统计学意义(t=-35.39，P=0.00)；DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量、DM+netrin-1高剂量组间大鼠视网膜EB渗漏量比较，差异有统计意义(F=179.69, P=0.00)；DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜EB渗漏量与DM+netrin-1高剂量组比较，差异有统计学意义(t=12.73, P=0.00)。DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜EB渗漏量少，但仍较正常对照组高，差异有统计学意义(t=-16.28, P=0.00)。
3 讨论
BRB是血眼屏障的重要组成部分，由内屏障及外屏障构成，是维持视网膜内环境稳态的重要结构。DM时，视网膜屏障功能破坏，血管通透性增加，其中内屏障功能受损是导致视网膜血管通透性增加的主要原因[6]。Occludin是构成视网膜血管内皮细胞紧密连接的跨膜蛋白，存在于血视网膜内屏障的紧密连接处，是观察视网膜屏障功能和血管通透性的重要指标[7, 8]。
Netrin-1是最早发现的神经诱导因子，能特异性的识别环境中的吸引或排斥信号，介导轴突生长[3]。新近研究发现，netrin-1在血管生长发育中也起到重要作用[9, 10]，能够促进内皮细胞增生、迁移和黏附，引导新生血管形成[4]，而且由netrin-1介导生成的血管具有完整的内皮细胞结构[11]。然而，Lu等[12]通过敲除netrin-1基因及加入外源性netrin-1，发现细胞出现回缩现象，提示外源性netrin-1可能抑制内皮细胞迁移，进而抑制血管生成。Bouvrée等[13]在鸡胚实验中印证了这一观点。那么，netrin-1对血管生成是促进作用还是抑制作用？Yang等[14]的相关实验发现，netrin-l对血管生成起双重调控作用，其作用的性质取决于外源性netrin-1浓度，即低浓度促进血管生成，高浓度抑制血管生成。
本研究结果显示，大鼠玻璃体腔注射netrin-1后，视网膜紧密连接蛋白occludin表达量较DM+BSS组升高，并且DM+netrin-1高剂量组较DM+netrin-1低剂量组效果更显著，但高剂量netrin-1仍不能使视网膜中occludin的表达恢复正常水平。另外，玻璃体腔注射netrin-1后，视网膜血管通透性降低，且通透性变化趋势与netrin-1浓度变化有关，即100 mg/ml的DM+netrin-1高剂量组视网膜EB渗漏量较10 mg/ml的DM+netrin-1低剂量组少。由此，我们认为，netrin-1对BRB具有保护作用，推测该作用可能是通过保护紧密连接蛋白occludin，抑制其降低来实现的；并且外源性netrin-1浓度越高，对视网膜血管的保护作用可能越显著。
Zhang等[15]研究发现，DM大鼠3个月时，视网膜中netrin-1表达较对照组明显升高，认为netrin-1在DR进展中起重要作用。而本研究中在DM 3个月时，向玻璃体腔注射外源性netrin-1后，抑制DR进展，我们推测可能是当netrin-1浓度升高后存在一个负反馈，具体机制目前不清楚，有待进一步实验印证。
本实验预实验阶段，对DM 1周, 1、2、3个月的大鼠进行netrin-1玻璃体腔注射，结果发现除netrin-1组与对照组不同外，其余差异均无统计学意义，因此本研究选择DM 3个月时行玻璃体腔注射。结果中未观察到netrin-1对血管通透性的双重作用，这可能与我们注射netrin-1的浓度较高及浓度梯度较少有关。但是关于netrin-1如何保护糖尿病视网膜血管中occludin，抑制BRB的破坏的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。
糖尿病视网膜病变(DR)早期视网膜血管通透性增高，血视网膜屏障(BRB)破坏，晚期出现病理性新生血管，导致视力严重下降[1]。因此，在DR早期，保护BRB，防止血管通透性损害是阻止DR进展的关键因素之一[2]。轴突导向因子netrin-1为可溶性神经导向因子[3]，能特异性识别环境中因子，向细胞内传递吸引或排斥信号以介导轴突的生长方向。近年研究发现，netrin-1不仅具有神经导向作用，对血管的生成同样起诱导和调控作用[4, 5]。但netrin-1对DR血管通透性是否有影响，在DR新生血管形成前期是否也具有调控作用尚不清楚。为此，我们观察了外源性netrin-1玻璃体腔注射后，糖尿病(DM)大鼠视网膜血管通透性变化，并对其变化发生的可能机制进行了分析探讨。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体重约250 g，清洁级，山东鲁抗医药公司提供，青岛大学动物房饲养。随机数字表法将其分为正常对照组、DM+平衡盐溶液(BSS)组、DM+ netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组。每组均为20只大鼠。正常对照组外的60只大鼠按60 mg/kg剂量左下腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导DM动物模型。72 h后测空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM造模成功，继续高糖高脂饲养3个月，期间定期监测血糖，使血糖维持在成模要求的范围直至实验结束。
DM建模成功后3个月，DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠玻璃体腔分别注射10、100μg/ml的外源性netrin-1 5μl；DM+BSS组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS；正常对照组大鼠不做任何处理。玻璃体腔注射时斜行进针，注射结束后按压穿刺口3 min。所有实验眼未出现巩膜口漏及高眼压。
伊凡思蓝(EB)测定视网膜血管通透性。DM 4个月时，各组随机选取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，按45 mg/kg剂量尾静脉注入EB。循环120 min后，1%多聚甲醛以66 ml/min行心脏灌注2 min。灌注结束后摘除眼球，剥离视网膜，4℃过夜晾干后称干重。每一个视网膜加甲酰胺0.3 ml，70℃孵育18 h，分别测定620、740 nm的吸光度[A，旧称光密度(OD)]值差。差值×1000=净A值。每一样本测量3次，取平均值。计算EB经视网膜血管的渗漏量：[视网膜EB量(mg)/视网膜干重(g)]/[单位时间内血浆EB量(mg)/血浆体积(μl)×循环时间(h)]，结果以ng/mg表示。以平均积分A值(IA值)表示视网膜闭合蛋白(occludin)的表达量。苏木精-伊红(HE)染色观察视网膜微血管的病理改变；免疫组织化学染色检测occludin的表达。DM 4个月时，每组随机选取5只大鼠过量麻醉法处死。迅速摘除眼球，4%多聚甲醛固定24 h，常规脱水，石蜡包埋，作5μm厚度的连续切片。石蜡切片常规脱蜡和水化后，抗原修复，5%山羊血清封闭，一抗兔抗大鼠occludin多克隆抗体(1 ：200)，二抗生物素标记山羊抗兔IgG抗体，3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，封片，光学显微镜下观察。以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。Image pro plus 6.0软件进行图像分析。
荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测视网膜occldin mRNA表达。DM 4个月时，每组随机选取5只大鼠过量麻醉处死。每50～100 mg视网膜加1 ml RNAiso plus，裂解视网膜组织；提取视网膜总RNA，DNase试剂盒去除RNA内残留DNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白(actin)基因作为内参，occludin引物双链嵌合荧光染色法(SYBR GreenⅠ)扩增相应基因。Occludin上游引物序列：5′-CCTGTC TATGCTCGTCATCG-3′；下游引物序列: 5′-TAGCC GTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin上游引物序列: 5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′；下游引物序列: 5′-C TAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度为60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环数，即Ct值。正常对照组大鼠视网膜occludin mRNA表达量设为1。
采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析处理。定量资料结果以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，大鼠腹腔注射STZ后4个月，DM+BSS组大鼠视网膜神经节细胞层水肿，内、外核层细胞数减少伴排列紊乱，视网膜微血管不规则扩张，结构异常。玻璃体注射netrin-1后视网膜神经节细胞水肿减轻，数量增多，视网膜微血管扩张程度减轻(图 1)。
图1
DM+BSS组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜组织光学显微镜像。1A.DM+BSS组；1B. DM+netrin-1高剂量组。DM+BSS组大鼠视网膜神经节细胞层水肿明显，视网膜微血管纡曲扩张；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜神经节细胞层水肿减轻，微血管扩张减轻 HE×100
免疫组织化学染色结果显示，正常对照组大鼠视网膜棕黄色颗粒主要集中于视网膜血管壁周围，其中神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层及内核层也有少量分布；DM+BSS组大鼠视网膜棕黄色颗粒颜色变浅，染色范围缩小；DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜棕黄色颗粒较DM+BSS组深；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜棕黄色颗粒较DM+netrin-1低剂量组进一步加深(图 2)。
图2
各组大鼠视网膜免疫组织化学染色像。2A.正常对照组；2B. DM+BSS组；2C. DM+netrin-1低剂量组；2D. DM+netrin-1高剂量组。正常对照组大鼠视网膜occludin主要表达于血管周围；DM+BSS组大鼠视网膜occludin表达明显减少。玻璃体腔注射netirn-1后视网膜occludin表达增多，且DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜occludin的表达量较DM+netrin-1低剂量组高 DAB×40
正常对照组、DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜IA值分别为4.83±0.82、1.33±0.31、2.52±0.56、3.01±0.67。正常对照组视网膜IA值与DM+BSS组比较，差异有统计学意义(t=26.99, P=0.00)；DM+BSS组、DM+ netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组间大鼠视网膜IA值比较，差异有统计学意义(F=177.13, P=0.00)，且DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜occludin表达较低剂量组高。DM+BSS组大鼠视网膜IA值与DM+netrin-1低剂量组比较，差异有统计学意义(t=-13.98, P=0.00)；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜IA值与正常对照组比较，差异有统计学意义(t=12.87, P=0.00)。
RT-PCR检测结果显示，与正常对照组大鼠视网膜中occludin mRNA表达比较，其余各组大鼠视网膜中occludin mRNA表达减少，差异有统计学意义(P＜0.05)(表 1)。DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜occludin mRNA表达与DM+BSS组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)；DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜中occludin mRNA表达与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
表1
各组大鼠视网膜中occludin mRNA的表达量比较
视网膜通透性检测结果显示，正常对照组、DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量组、DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜EB渗漏量分别为(12.27±2.51)、(34.46±5.11)、(29.22±3.82)、(21.45±3.91) ng/mg。DM+BSS组大鼠视网膜EB渗漏量较正常对照组高，差异有统计学意义(t=-35.39，P=0.00)；DM+BSS组、DM+netrin-1低剂量、DM+netrin-1高剂量组间大鼠视网膜EB渗漏量比较，差异有统计意义(F=179.69, P=0.00)；DM+netrin-1低剂量组大鼠视网膜EB渗漏量与DM+netrin-1高剂量组比较，差异有统计学意义(t=12.73, P=0.00)。DM+netrin-1高剂量组大鼠视网膜EB渗漏量少，但仍较正常对照组高，差异有统计学意义(t=-16.28, P=0.00)。
3 讨论
BRB是血眼屏障的重要组成部分，由内屏障及外屏障构成，是维持视网膜内环境稳态的重要结构。DM时，视网膜屏障功能破坏，血管通透性增加，其中内屏障功能受损是导致视网膜血管通透性增加的主要原因[6]。Occludin是构成视网膜血管内皮细胞紧密连接的跨膜蛋白，存在于血视网膜内屏障的紧密连接处，是观察视网膜屏障功能和血管通透性的重要指标[7, 8]。
Netrin-1是最早发现的神经诱导因子，能特异性的识别环境中的吸引或排斥信号，介导轴突生长[3]。新近研究发现，netrin-1在血管生长发育中也起到重要作用[9, 10]，能够促进内皮细胞增生、迁移和黏附，引导新生血管形成[4]，而且由netrin-1介导生成的血管具有完整的内皮细胞结构[11]。然而，Lu等[12]通过敲除netrin-1基因及加入外源性netrin-1，发现细胞出现回缩现象，提示外源性netrin-1可能抑制内皮细胞迁移，进而抑制血管生成。Bouvrée等[13]在鸡胚实验中印证了这一观点。那么，netrin-1对血管生成是促进作用还是抑制作用？Yang等[14]的相关实验发现，netrin-l对血管生成起双重调控作用，其作用的性质取决于外源性netrin-1浓度，即低浓度促进血管生成，高浓度抑制血管生成。
本研究结果显示，大鼠玻璃体腔注射netrin-1后，视网膜紧密连接蛋白occludin表达量较DM+BSS组升高，并且DM+netrin-1高剂量组较DM+netrin-1低剂量组效果更显著，但高剂量netrin-1仍不能使视网膜中occludin的表达恢复正常水平。另外，玻璃体腔注射netrin-1后，视网膜血管通透性降低，且通透性变化趋势与netrin-1浓度变化有关，即100 mg/ml的DM+netrin-1高剂量组视网膜EB渗漏量较10 mg/ml的DM+netrin-1低剂量组少。由此，我们认为，netrin-1对BRB具有保护作用，推测该作用可能是通过保护紧密连接蛋白occludin，抑制其降低来实现的；并且外源性netrin-1浓度越高，对视网膜血管的保护作用可能越显著。
Zhang等[15]研究发现，DM大鼠3个月时，视网膜中netrin-1表达较对照组明显升高，认为netrin-1在DR进展中起重要作用。而本研究中在DM 3个月时，向玻璃体腔注射外源性netrin-1后，抑制DR进展，我们推测可能是当netrin-1浓度升高后存在一个负反馈，具体机制目前不清楚，有待进一步实验印证。
本实验预实验阶段，对DM 1周, 1、2、3个月的大鼠进行netrin-1玻璃体腔注射，结果发现除netrin-1组与对照组不同外，其余差异均无统计学意义，因此本研究选择DM 3个月时行玻璃体腔注射。结果中未观察到netrin-1对血管通透性的双重作用，这可能与我们注射netrin-1的浓度较高及浓度梯度较少有关。但是关于netrin-1如何保护糖尿病视网膜血管中occludin，抑制BRB的破坏的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。
