引用本文： 韩林峰, 柯根杰, 王林, 顾永昊, 顾起宏, 董凯, 刘家佳. 全视网膜激光光凝对增生型糖尿病视网膜病变视网膜前膜中环氧化酶-2、血管内皮生长因子表达的影响. 中华眼底病杂志, 2016, 32(2): 140-143. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.007 复制
糖尿病视网膜病变(DR)的病理基础是视网膜新生血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是目前最强的血管生成因子，同时有报道环氧化酶-2(COX-2)在DR中有较高的表达，被认为参与了DR新生血管的生成，与VEGF有着密切联系[1, 2]。全视网膜激光光凝(PRP)是治疗DR的有效手段，可有效减少新生血管生长因子的产生，抑制视网膜新生血管的生成[3, 4]。为此，我们检测了一组接受PRP治疗并行玻璃体切割手术的增生型DR(PDR)患者视网膜前膜组织中COX-2、VEGF的表达,初步探讨PRP治疗后视网膜新生血管，视网膜组织中COX-2、VEGF的变化。现将结果报道如下。
1 对象和方法
2012年12月至2013年12月在安徽医科大学附属省立医院眼科检查确诊并接受玻璃体切割手术的连续PDR患者35例35只眼纳入研究。所有患者均为PDRⅤ~Ⅵ期[5]。其中，男性21例，女性14例。年龄40~70岁，平均年龄(53.85±10.20)岁。糖尿病病程6~21年，平均病程(12.91±3.26)年。PDRⅤ期21只眼，Ⅵ期14只眼。使用胰岛素治疗者19例。患者均行视力、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、B型超声、光相干断层扫描(OCT)检查。
纳入标准：(1) 2型糖尿病；(2) 反复出现或大量玻璃体积血未经或经药物治疗后积血吸收效果不佳者，B型超声检查提示视网膜前机化膜形成和(或)合并有牵拉性视网膜脱离；(3) 无明显玻璃体积血者，间接检眼镜、眼B型超声、OCT检查提示眼底增生膜形成和(或)合并牵拉性视网膜脱离。排除标准：手术前空腹血糖＞8 mmol/L者；既往接受过巩膜扣带和(或)玻璃体视网膜手术者；玻璃体腔注射抗新生血管药物治疗者；视网膜激光光凝未达3个象限者；合并有严重高血压者；其他视网膜血管性疾病、老年性黄斑变性者。
将手术前未接受过任何激光光凝者分为非光凝组，接受过PRP治疗[6]者分为光凝组，分别为19例19只眼和16例16只眼。非光凝组19例患者中，男性12例，女性7例；平均年龄(51.16±9.41)岁。右眼8只眼，左眼11只眼；PDRⅤ期12只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(13.05±3.32)年；平均空腹血糖(6.16±0.97) mmol/L；使用胰岛素治疗者9例。光凝组16例患者。其中，男性9例，女性7例；平均年龄(53.38±11.64)岁。右眼6只眼，左眼10只眼；PDRⅤ期9只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(12.75±3.28)年；平均空腹血糖(6.05±0.73) mmol/L；使用胰岛素治疗者10例。两组患者年龄(t=0.623)、性别(χ2=0.173)、眼别(χ2=0.077)、PDR分期眼数(χ2=0.173)、平均糖尿病病程(t=0.270)、平均空腹血糖(t=0.366)、使用胰岛素治疗者例数(χ2=0.801)比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
所有患者知情并签署手术同意书后行常规睫状体平坦部三通道闭合式玻璃体切割手术。收集手术中剥离的视网膜前膜，4%多聚甲醛固定，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，厚度4 μm连续切片，常规苏木精-伊红(HE)染色。光学显微镜下观察增生膜病理组织形态学变化。
应用CD34、COX-2、VEGF单克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法免疫组织化学测定视网膜前膜组织中COX-2、VEGF蛋白表达。石蜡切片常规脱蜡、水化，按试剂盒说明进行CD34、COX-2、VEGF 免疫组织化学染色。3% H2O2 去离子水孵育5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。分别滴加CD34、COX-2、VEGF一抗，37℃孵育2 h，PBS 冲洗2 min，3次；分别加入即用型鼠抗人CD34 单克隆抗体、鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体，37℃孵育20 min，PBS冲洗2 min,3 次，二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片，PBS代替一抗作阴性对照。细胞膜和(或)胞质呈棕褐色为阳性。
微血管密度(MVD)测定计数方法同文献[7]，任何被CD34抗体染成棕褐色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均为1个微血管计数；只要组织结构不相连，其分支结构也作为1个微血管进行计算；血管肌层较厚及管腔＞8个红细胞直径的血管予以排除。首先在100倍光学显微镜下寻找微血管最多的区域，再在200倍光学显微镜下计数3个视野的微血管数，取平均值作为MVD。 盲法下进行测定，每张切片均分别由2名病理科医师判读，两者计数差值＞10%时重新计数。
按参照文献[8]的方法运用电荷耦合器件图像采集系统在光学显微镜下对COX-2、VEGF免疫组织化学染色的组织切片进行图像采集，每个标本随机选取3个区域及以上；应用Image-proplus 6.0图像软件对所采集的图像进行分析处理，按照免疫组织化学阳性染色特征选取图片中特定区域，计算阳性区域的积分吸光度[A，旧称光密度(OD)](IA)值，所有COX-2、VEGF免疫组织化学染色切片IA值测定均在同一参数条件下完成。以COX-2、VEGF的IA值的平均值代表各种蛋白的分布密度。
采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析处理。计数资料以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，非光凝组患眼视网膜前膜大而肥厚；纤维组织结构内可见数量较多、管径较大的新生血管，血管结构多数不完整，部分区域可见较多新鲜出血。光凝组患眼视网膜前膜相对较薄；可见散在、管径较小的新生血管，血管结构相对完整，出血相对较少(图 1)。
图1
视网膜前膜光学显微镜像。1A.非光凝组，纤维组织结构内可见数量较多、管径较大的新生血管；1B.光凝组，可见炎症细胞明显增多 HE 标尺：50 μm
高倍光学显微镜下计数，非光凝组患眼MVD为5.41～9.72个，平均MVD为(7.42±1.39)个；光凝 组患眼MVD为2.74～6.67个，平均MVD为(4.56± 1.22)个。非光凝组患眼MVD数量明显高于光凝组，差异有统计学意义(t=6.41,P＜0.001)。
免疫组织化学染色观察发现，非光凝组患眼视网膜前膜中新生血管内皮细胞CD34、COX-2、VEGF均可见阳性表达；新生血管分布不均匀，呈点、线、簇状结构排列，并有不规则的管腔样结构存在；血管壁薄，未见明显平滑肌形成。光凝组患眼视网膜前膜中新生血管内皮细胞CD34、COX-2、VEGF表达较非光凝组减少，部分切片未见阳性表达(图 2)。
图2
视网膜前膜免疫组织化学染色像。2A～2C.非光凝组，可见内皮细胞CD34(2A)、COX-2(2B)、VEGF(2C)棕黄色阳性表达；2D～2F.光凝组，可见少数内皮细胞CD34棕黄色阳性表达(2D)，COX-2(2E)、VEGF(2F)棕黄色阳性表达较少 SP 标尺：50 μm
非光凝组患眼视网膜前膜中CD34(t=6.147)、COX-2(t=5.944)、VEGF(t=7.445)IA值均明显高于光凝组，差异均有统计学意义(P＜0.001)(图 3)。
图3
两组视网膜前膜组织中CD34、COX-2、VEGF IA值比较
3 讨论
视网膜微循环障碍是导致血视网膜屏障破坏、新生血管生成的主要因素[9]。CD34抗原是一种与新生小血管相关的特异性白细胞分化抗原，相较其他新生血管标记物在表达上更具有高度稳定性和特异性素[10, 11]。本研究利用CD34 在血管内皮细胞的阳性表达作为视网膜前膜新生血管表达的标志，并同时计算MVD。
既往研究证实，COX-2与 VEGF的过表达在炎症、肿瘤等异常病理状态下的新生血管生成中起着重要作用，并且COX-2的表达与VEGF呈正相关素[12-14]。在缺氧视网膜动物模型的视网膜中COX-2、VEGF的表达明显升高[15]。临床上抗VEGF药物能有效控制DR新生血管生成，并能明显减少已经形成的新生血管素[16-18]，进一步证实VEGF在DR新生血管生成中起到重要的作用。
本研究严格按DR分级[5]标准纳入研究对象。两组患者年龄、性别、病程、眼别、空腹血糖、是否使用胰岛素等差异无统计学意义，患者基线资料可比。结果显示：(1)PDR视网膜前膜中存在较多新生血管，COX-2、VEGF呈阳性表达；(2)光凝组患眼视网膜前膜中MVD数量明显低于非光凝组，PRP治疗能有效减少视网膜前膜中新生血管数量；(3)非光凝组患眼视网膜前膜中CD34、COX-2、VEGF IA值均明显高于光凝组，PRP治疗后视网膜新生血管数量及视网膜前膜组织中COX-2、VEGF含量明显减少。因此，我们推测PRP治疗能有效抑制PDR视网膜前膜中新生血管的生成和COX-2、VEGF的表达，是其抑制视网膜新生血管形成的可能机制。
本研究存在的不足是因样本量较小且其中部分患者不能准确提供行PRP治疗时间及开始使用胰岛素时眼底情况，未能对PRP到接受手术治疗时间及胰岛素使用时间进行统计，其两者时间长短对视网膜前膜组织病理形态以及COX-2、VEGF的表达可能存在影响；患者手术前空腹血糖只能体现患者手术前较短时间的血糖水平，不能完全反映患者的长期血糖水平。所以需要更大样本的前瞻性研究及完善的研究设计，进一步分析证实COX-2、VEGF与PDR形成之间相互作用关系及PRP抑制视网膜新生血管形成的确切机制。
糖尿病视网膜病变(DR)的病理基础是视网膜新生血管的形成。血管内皮生长因子(VEGF)是目前最强的血管生成因子，同时有报道环氧化酶-2(COX-2)在DR中有较高的表达，被认为参与了DR新生血管的生成，与VEGF有着密切联系[1, 2]。全视网膜激光光凝(PRP)是治疗DR的有效手段，可有效减少新生血管生长因子的产生，抑制视网膜新生血管的生成[3, 4]。为此，我们检测了一组接受PRP治疗并行玻璃体切割手术的增生型DR(PDR)患者视网膜前膜组织中COX-2、VEGF的表达,初步探讨PRP治疗后视网膜新生血管，视网膜组织中COX-2、VEGF的变化。现将结果报道如下。
1 对象和方法
2012年12月至2013年12月在安徽医科大学附属省立医院眼科检查确诊并接受玻璃体切割手术的连续PDR患者35例35只眼纳入研究。所有患者均为PDRⅤ~Ⅵ期[5]。其中，男性21例，女性14例。年龄40~70岁，平均年龄(53.85±10.20)岁。糖尿病病程6~21年，平均病程(12.91±3.26)年。PDRⅤ期21只眼，Ⅵ期14只眼。使用胰岛素治疗者19例。患者均行视力、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、B型超声、光相干断层扫描(OCT)检查。
纳入标准：(1) 2型糖尿病；(2) 反复出现或大量玻璃体积血未经或经药物治疗后积血吸收效果不佳者，B型超声检查提示视网膜前机化膜形成和(或)合并有牵拉性视网膜脱离；(3) 无明显玻璃体积血者，间接检眼镜、眼B型超声、OCT检查提示眼底增生膜形成和(或)合并牵拉性视网膜脱离。排除标准：手术前空腹血糖＞8 mmol/L者；既往接受过巩膜扣带和(或)玻璃体视网膜手术者；玻璃体腔注射抗新生血管药物治疗者；视网膜激光光凝未达3个象限者；合并有严重高血压者；其他视网膜血管性疾病、老年性黄斑变性者。
将手术前未接受过任何激光光凝者分为非光凝组，接受过PRP治疗[6]者分为光凝组，分别为19例19只眼和16例16只眼。非光凝组19例患者中，男性12例，女性7例；平均年龄(51.16±9.41)岁。右眼8只眼，左眼11只眼；PDRⅤ期12只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(13.05±3.32)年；平均空腹血糖(6.16±0.97) mmol/L；使用胰岛素治疗者9例。光凝组16例患者。其中，男性9例，女性7例；平均年龄(53.38±11.64)岁。右眼6只眼，左眼10只眼；PDRⅤ期9只眼，Ⅵ期7只眼。平均糖尿病病程(12.75±3.28)年；平均空腹血糖(6.05±0.73) mmol/L；使用胰岛素治疗者10例。两组患者年龄(t=0.623)、性别(χ2=0.173)、眼别(χ2=0.077)、PDR分期眼数(χ2=0.173)、平均糖尿病病程(t=0.270)、平均空腹血糖(t=0.366)、使用胰岛素治疗者例数(χ2=0.801)比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。
所有患者知情并签署手术同意书后行常规睫状体平坦部三通道闭合式玻璃体切割手术。收集手术中剥离的视网膜前膜，4%多聚甲醛固定，常规梯度酒精脱水，石蜡包埋，厚度4 μm连续切片，常规苏木精-伊红(HE)染色。光学显微镜下观察增生膜病理组织形态学变化。
应用CD34、COX-2、VEGF单克隆抗体及链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法免疫组织化学测定视网膜前膜组织中COX-2、VEGF蛋白表达。石蜡切片常规脱蜡、水化，按试剂盒说明进行CD34、COX-2、VEGF 免疫组织化学染色。3% H2O2 去离子水孵育5 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗。分别滴加CD34、COX-2、VEGF一抗，37℃孵育2 h，PBS 冲洗2 min，3次；分别加入即用型鼠抗人CD34 单克隆抗体、鼠抗人COX-2单克隆抗体、鼠抗人VEGF单克隆抗体，37℃孵育20 min，PBS冲洗2 min,3 次，二氨基联苯胺显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明封片，PBS代替一抗作阴性对照。细胞膜和(或)胞质呈棕褐色为阳性。
微血管密度(MVD)测定计数方法同文献[7]，任何被CD34抗体染成棕褐色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均为1个微血管计数；只要组织结构不相连，其分支结构也作为1个微血管进行计算；血管肌层较厚及管腔＞8个红细胞直径的血管予以排除。首先在100倍光学显微镜下寻找微血管最多的区域，再在200倍光学显微镜下计数3个视野的微血管数，取平均值作为MVD。 盲法下进行测定，每张切片均分别由2名病理科医师判读，两者计数差值＞10%时重新计数。
按参照文献[8]的方法运用电荷耦合器件图像采集系统在光学显微镜下对COX-2、VEGF免疫组织化学染色的组织切片进行图像采集，每个标本随机选取3个区域及以上；应用Image-proplus 6.0图像软件对所采集的图像进行分析处理，按照免疫组织化学阳性染色特征选取图片中特定区域，计算阳性区域的积分吸光度[A，旧称光密度(OD)](IA)值，所有COX-2、VEGF免疫组织化学染色切片IA值测定均在同一参数条件下完成。以COX-2、VEGF的IA值的平均值代表各种蛋白的分布密度。
采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析处理。计数资料以均数±标准差(
2 结果
光学显微镜观察发现，非光凝组患眼视网膜前膜大而肥厚；纤维组织结构内可见数量较多、管径较大的新生血管，血管结构多数不完整，部分区域可见较多新鲜出血。光凝组患眼视网膜前膜相对较薄；可见散在、管径较小的新生血管，血管结构相对完整，出血相对较少(图 1)。
图1
视网膜前膜光学显微镜像。1A.非光凝组，纤维组织结构内可见数量较多、管径较大的新生血管；1B.光凝组，可见炎症细胞明显增多 HE 标尺：50 μm
高倍光学显微镜下计数，非光凝组患眼MVD为5.41～9.72个，平均MVD为(7.42±1.39)个；光凝 组患眼MVD为2.74～6.67个，平均MVD为(4.56± 1.22)个。非光凝组患眼MVD数量明显高于光凝组，差异有统计学意义(t=6.41,P＜0.001)。
免疫组织化学染色观察发现，非光凝组患眼视网膜前膜中新生血管内皮细胞CD34、COX-2、VEGF均可见阳性表达；新生血管分布不均匀，呈点、线、簇状结构排列，并有不规则的管腔样结构存在；血管壁薄，未见明显平滑肌形成。光凝组患眼视网膜前膜中新生血管内皮细胞CD34、COX-2、VEGF表达较非光凝组减少，部分切片未见阳性表达(图 2)。
图2
视网膜前膜免疫组织化学染色像。2A～2C.非光凝组，可见内皮细胞CD34(2A)、COX-2(2B)、VEGF(2C)棕黄色阳性表达；2D～2F.光凝组，可见少数内皮细胞CD34棕黄色阳性表达(2D)，COX-2(2E)、VEGF(2F)棕黄色阳性表达较少 SP 标尺：50 μm
非光凝组患眼视网膜前膜中CD34(t=6.147)、COX-2(t=5.944)、VEGF(t=7.445)IA值均明显高于光凝组，差异均有统计学意义(P＜0.001)(图 3)。
图3
两组视网膜前膜组织中CD34、COX-2、VEGF IA值比较
3 讨论
视网膜微循环障碍是导致血视网膜屏障破坏、新生血管生成的主要因素[9]。CD34抗原是一种与新生小血管相关的特异性白细胞分化抗原，相较其他新生血管标记物在表达上更具有高度稳定性和特异性素[10, 11]。本研究利用CD34 在血管内皮细胞的阳性表达作为视网膜前膜新生血管表达的标志，并同时计算MVD。
既往研究证实，COX-2与 VEGF的过表达在炎症、肿瘤等异常病理状态下的新生血管生成中起着重要作用，并且COX-2的表达与VEGF呈正相关素[12-14]。在缺氧视网膜动物模型的视网膜中COX-2、VEGF的表达明显升高[15]。临床上抗VEGF药物能有效控制DR新生血管生成，并能明显减少已经形成的新生血管素[16-18]，进一步证实VEGF在DR新生血管生成中起到重要的作用。
本研究严格按DR分级[5]标准纳入研究对象。两组患者年龄、性别、病程、眼别、空腹血糖、是否使用胰岛素等差异无统计学意义，患者基线资料可比。结果显示：(1)PDR视网膜前膜中存在较多新生血管，COX-2、VEGF呈阳性表达；(2)光凝组患眼视网膜前膜中MVD数量明显低于非光凝组，PRP治疗能有效减少视网膜前膜中新生血管数量；(3)非光凝组患眼视网膜前膜中CD34、COX-2、VEGF IA值均明显高于光凝组，PRP治疗后视网膜新生血管数量及视网膜前膜组织中COX-2、VEGF含量明显减少。因此，我们推测PRP治疗能有效抑制PDR视网膜前膜中新生血管的生成和COX-2、VEGF的表达，是其抑制视网膜新生血管形成的可能机制。
本研究存在的不足是因样本量较小且其中部分患者不能准确提供行PRP治疗时间及开始使用胰岛素时眼底情况，未能对PRP到接受手术治疗时间及胰岛素使用时间进行统计，其两者时间长短对视网膜前膜组织病理形态以及COX-2、VEGF的表达可能存在影响；患者手术前空腹血糖只能体现患者手术前较短时间的血糖水平，不能完全反映患者的长期血糖水平。所以需要更大样本的前瞻性研究及完善的研究设计，进一步分析证实COX-2、VEGF与PDR形成之间相互作用关系及PRP抑制视网膜新生血管形成的确切机制。
