引用本文： 邵珺, 姚勇. 高糖缺氧环境下转甲状腺素蛋白对视网膜血管内皮细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2016, 32(2): 159-162. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.02.011 复制
转甲状腺素蛋白(TTR)主要由肝脏、脉络丛、胰腺的内分泌腺以及视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜等分泌[1]。参与甲状腺素蛋白T4和视黄醇结合蛋白转运并存在蛋白酶活性及酯酶活性等一些特殊的生物学功能[2, 3]。我们前期观察发现，正常条件下TTR对视网膜血管内皮细胞(REC)生长有一定作用[4] 。在此基础上，本研究进一步观察了高糖缺氧环境下TTR下对REC的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人REC(hREC)、人RPE细胞(hRPEC，上海拜力生物科技有限公司)；Dulbecco改良Eagle(DMEM)培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS，美国生命技术公司)；CoCl2(美国Sigma公司)；葡萄糖(国药集团)；24孔Transwell培养板(美国 Corning公司)；8000 WJ细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；实时无标记细胞功能分析仪(瑞士Roche公司)。
不同培养条件下细胞生长指数检测。分别于5.5 mmol/L葡萄糖(低糖，LG)、25.0 mmol/L葡萄糖(高糖，HG)以及200 μmol/L CoCl2诱导的缺氧环境[5, 6]中培养hREC、hRPEC。根据培养条件不同，将hREC、hRPEC分为LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组。LG组、HG组细胞分别置于含5.5、25.0 mmol/L葡萄糖和10%FBS DEME培养基，37℃，8000 WJ培养箱中培养；LG缺氧组、HG缺氧组DMED培养基中10%FBS更换为200 μmol/L CoCl2，其余培养条件相同。当细胞覆盖率达到80%～90%，PBS洗涤hREC、hRPEC 2次，0.05%胰蛋白酶消化2～3 min，随后加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养终止胰蛋白酶反应。3000个/孔细胞培养于平板中的5.5 mmol/L葡萄糖DMEM培养基中，过夜培养后，将附周细胞加洗2次，各组细胞200 μl新鲜DMEM基温育。将更换新鲜DMED培养基时间点设置为0 h，应用实时无标记细胞功能分析仪检测细胞培养后4、8、16、24、36、48、60、72 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
hREC、hRPEC细胞0.05%胰蛋白酶消化2～3 min，随后加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基终止胰蛋白酶反应。收获细胞，离心，洗涤后将3000个/孔的细胞培养于平板上。保温过夜后，将附周细胞洗涤2次，各组细胞均采用200 μl新鲜DMEM培养；培养基中分别加入4 μmol/L的TTR[7]，即LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR[7]。检测细胞培养后4、8、16、24、36、48、60、72 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
Transwell共培养体系观察hRPEC对hREC生长的影响。5.5 mmol/L葡萄糖DEME培养基中制备8000个/50 μl hREC细胞悬液；在可拆卸细胞培养板每孔加入50 μl细胞悬液，室温放置30 min后置于培养箱中培养和并实时监测；5.5 mmol/L葡萄糖的DEME培养基中制备2000个/50 μl的hRPEC细胞悬液；在接受小室的普通培养板每个孔中加入130 μl 5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基，放入小室，并在每个小室中分别加入50 μl hRPEC细胞悬液，再加入10 μl培养基使得液体达到60 μl/孔，将加入小室的培养板放入培养箱培养过夜；hREC和hRPEC培养过夜，培养hREC细胞的培养板取出后吸去培养液，各组分别加入110 μl新鲜培养液；各组细胞从每个小室取出吸去培养基后分别加入60 μl新鲜DMEM基，将含有hRPEC的小室放入与含有hREC的细胞培养板中，放回细胞功能分析仪中继续培养。检测细胞共培养后4、8、16、24、36、48 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
应用SPSS 22.0统计学软件进行行统计学分析处理。以单独培养72 h及共培养48 h为统计分析时间点，比较各组细胞生长指数。方差齐性检验＜0.05时运用最小显著法行单因素方差检验，方差齐性检验＞0.05时运用tamhane行单因素方差检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
LG组hREC、hRPEC细胞生长指数明显高于LG缺氧组、HG组，差异均有统计学意义(hREC：F=17.098、22.970,P＜0.05；hRPEC：F=45.442、9.011,P＜0.05)。HG组、HG缺氧组hREC(F=146.184)、hRPEC(F=27.907)生长受到抑制，生长指数显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 1,2)。
图1
各组hREC生长情况。*LG组与LG缺氧组比较，P＜0.05；#LG组与HG组比较，P＜0.05；**HG组与HG缺氧组比较，P＜0.05
图2
各组hRPEC生长情况。*LG组与LG缺氧组比较，P＜0.05；#LG组与HG组比较，P＜0.05；**HG组与HG缺氧组比较，P＜0.05
HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hREC生长受到抑制，细胞生长指数显著低于HG组、HG缺氧组，差异有统计学意义(F=161.430、24.106,P＜0.05)；LG组+TTR、LG缺氧组+TTR hREC细胞生长指数高于LG组、LG缺氧组，差异有统计学意义(F=200.486、48.662,P＜0.05)(图 3)。LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hRPEC细胞生长指数均较LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组的细胞生长指数提高，但差异无统计学意义(HG组：F=0.482,P＞0.05；HG缺氧组：F=0.673,P＞0.05；LG组：F=0.902,P＞0.05； LG缺氧组：F=0.832,P＞0.05)(图 4)。
图3
TTR对各组hREC生长影响。*HG组与HG组+TTR比较,P＜0.05；#HG缺氧组与HG缺氧+TTR比较，P＜0.05；**LG组与LG组+TTR比较，P＜0.05；##LG缺氧组与LG缺氧组+TTR比较， P＜0.05
图4
TTR对各组hRPEC生长影响。*HG组与HG组+TTR比较，P＞0.05；#HG缺氧组与HG缺氧组+TTR比较，P＞0.05；**LG组与LG组+TTR比较,P＞0.05；##LG缺氧组与LG缺氧组+TTR比较，P＞0.05
与单独生长细胞相比，共培养hRPEC对hREC生长有显著抑制作用，差异有统计学意义(LG组：F=15.711,P＜0.05； LG缺氧组：F=45.659,P＜0.05；HG,F=7.857,P＜0.05；HG缺氧组；F=6.348,P＜0.05)(图 5)。
图5
hRPEC与hREC共培养后细胞生长指数。*LG组hREC与LG组hRPEC比较，P＜0.05；#HG组hREC与HG组hRPEC比较，P＜0.05；**LG缺氧组hREC与LG缺氧组hRPEC比较，P＜0.05；##HG缺氧组hREC与HG缺氧组hRPEC比较，P＜0.05
3 讨论
本研究设定5.5 mmol/L葡萄糖为正常条件，25.0 mmol/l葡萄糖为异常条件，同时利用200 μmol/L CoCl2诱导细胞达到缺氧条件。结果显示，在HG缺氧条件下hREC、hRPEC生长均受到显著抑制。而当加入4 μmol/L的外源性TTR后，LG组及LG缺氧组hREC增生得到显著提升；HG组及HG缺氧组hREC受到显著抑制。说明TTR对hREC发挥抑制作用的必要条件是HG；而在LG环境中，缺氧条件并不能引发TTR对hREC的抑制作用。
由于眼部TTR主要由hRPEC表达，为此我们对hREC及hRPEC进行了transwell共培养，解析hRPEC对hREC的影响。结果显示，TTR对hRPEC的生长略有提升，但差异无统计学意义。而在transwell共培养体系中，hRPEC均能抑制hREC的增生，这和外源性TTR在LG环境中对hREC的促进作用相悖。由于TTR可以由hRPEC分泌，此结果可能与培养过程中TTR的表达量相关。因此，在进一步的实验中，我们将观察hRPEC细胞中TTR基因在各种环境中的转录水平，以及检测TTR蛋白在培养液中的实时当量。
我们的前期研究发现，高度近视患者玻璃体内TTR含量大幅增长[8-10],而糖尿病患者体液TTR当量大幅下降[11],即糖尿病患者和高度近视患者体液内的TTR含量变化趋势相反；此外，也有临床报道显示高度近视患者不易发生DR[12, 13]。这些临床表象的背后，可能存在一些与TTR相关的机制。在我们的进一步研究中，拟在生物功能方面全面探索TTR对细胞信号通路的介入，进一步探索TTR对hREC细胞的作用机制。
转甲状腺素蛋白(TTR)主要由肝脏、脉络丛、胰腺的内分泌腺以及视网膜色素上皮(RPE)和脉络膜等分泌[1]。参与甲状腺素蛋白T4和视黄醇结合蛋白转运并存在蛋白酶活性及酯酶活性等一些特殊的生物学功能[2, 3]。我们前期观察发现，正常条件下TTR对视网膜血管内皮细胞(REC)生长有一定作用[4] 。在此基础上，本研究进一步观察了高糖缺氧环境下TTR下对REC的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
人REC(hREC)、人RPE细胞(hRPEC，上海拜力生物科技有限公司)；Dulbecco改良Eagle(DMEM)培养基、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS，美国生命技术公司)；CoCl2(美国Sigma公司)；葡萄糖(国药集团)；24孔Transwell培养板(美国 Corning公司)；8000 WJ细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司)；实时无标记细胞功能分析仪(瑞士Roche公司)。
不同培养条件下细胞生长指数检测。分别于5.5 mmol/L葡萄糖(低糖，LG)、25.0 mmol/L葡萄糖(高糖，HG)以及200 μmol/L CoCl2诱导的缺氧环境[5, 6]中培养hREC、hRPEC。根据培养条件不同，将hREC、hRPEC分为LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组。LG组、HG组细胞分别置于含5.5、25.0 mmol/L葡萄糖和10%FBS DEME培养基，37℃，8000 WJ培养箱中培养；LG缺氧组、HG缺氧组DMED培养基中10%FBS更换为200 μmol/L CoCl2，其余培养条件相同。当细胞覆盖率达到80%～90%，PBS洗涤hREC、hRPEC 2次，0.05%胰蛋白酶消化2～3 min，随后加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养终止胰蛋白酶反应。3000个/孔细胞培养于平板中的5.5 mmol/L葡萄糖DMEM培养基中，过夜培养后，将附周细胞加洗2次，各组细胞200 μl新鲜DMEM基温育。将更换新鲜DMED培养基时间点设置为0 h，应用实时无标记细胞功能分析仪检测细胞培养后4、8、16、24、36、48、60、72 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
hREC、hRPEC细胞0.05%胰蛋白酶消化2～3 min，随后加入含有5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基终止胰蛋白酶反应。收获细胞，离心，洗涤后将3000个/孔的细胞培养于平板上。保温过夜后，将附周细胞洗涤2次，各组细胞均采用200 μl新鲜DMEM培养；培养基中分别加入4 μmol/L的TTR[7]，即LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR[7]。检测细胞培养后4、8、16、24、36、48、60、72 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
Transwell共培养体系观察hRPEC对hREC生长的影响。5.5 mmol/L葡萄糖DEME培养基中制备8000个/50 μl hREC细胞悬液；在可拆卸细胞培养板每孔加入50 μl细胞悬液，室温放置30 min后置于培养箱中培养和并实时监测；5.5 mmol/L葡萄糖的DEME培养基中制备2000个/50 μl的hRPEC细胞悬液；在接受小室的普通培养板每个孔中加入130 μl 5.5 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基，放入小室，并在每个小室中分别加入50 μl hRPEC细胞悬液，再加入10 μl培养基使得液体达到60 μl/孔，将加入小室的培养板放入培养箱培养过夜；hREC和hRPEC培养过夜，培养hREC细胞的培养板取出后吸去培养液，各组分别加入110 μl新鲜培养液；各组细胞从每个小室取出吸去培养基后分别加入60 μl新鲜DMEM基，将含有hRPEC的小室放入与含有hREC的细胞培养板中，放回细胞功能分析仪中继续培养。检测细胞共培养后4、8、16、24、36、48 h的细胞生长指数。每一时间点均为4组细胞平行培养。
应用SPSS 22.0统计学软件进行行统计学分析处理。以单独培养72 h及共培养48 h为统计分析时间点，比较各组细胞生长指数。方差齐性检验＜0.05时运用最小显著法行单因素方差检验，方差齐性检验＞0.05时运用tamhane行单因素方差检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
LG组hREC、hRPEC细胞生长指数明显高于LG缺氧组、HG组，差异均有统计学意义(hREC：F=17.098、22.970,P＜0.05；hRPEC：F=45.442、9.011,P＜0.05)。HG组、HG缺氧组hREC(F=146.184)、hRPEC(F=27.907)生长受到抑制，生长指数显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)(图 1,2)。
图1
各组hREC生长情况。*LG组与LG缺氧组比较，P＜0.05；#LG组与HG组比较，P＜0.05；**HG组与HG缺氧组比较，P＜0.05
图2
各组hRPEC生长情况。*LG组与LG缺氧组比较，P＜0.05；#LG组与HG组比较，P＜0.05；**HG组与HG缺氧组比较，P＜0.05
HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hREC生长受到抑制，细胞生长指数显著低于HG组、HG缺氧组，差异有统计学意义(F=161.430、24.106,P＜0.05)；LG组+TTR、LG缺氧组+TTR hREC细胞生长指数高于LG组、LG缺氧组，差异有统计学意义(F=200.486、48.662,P＜0.05)(图 3)。LG组+TTR、LG缺氧组+TTR、HG组+TTR、HG缺氧组+TTR hRPEC细胞生长指数均较LG组、LG缺氧组、HG组、HG缺氧组的细胞生长指数提高，但差异无统计学意义(HG组：F=0.482,P＞0.05；HG缺氧组：F=0.673,P＞0.05；LG组：F=0.902,P＞0.05； LG缺氧组：F=0.832,P＞0.05)(图 4)。
图3
TTR对各组hREC生长影响。*HG组与HG组+TTR比较,P＜0.05；#HG缺氧组与HG缺氧+TTR比较，P＜0.05；**LG组与LG组+TTR比较，P＜0.05；##LG缺氧组与LG缺氧组+TTR比较， P＜0.05
图4
TTR对各组hRPEC生长影响。*HG组与HG组+TTR比较，P＞0.05；#HG缺氧组与HG缺氧组+TTR比较，P＞0.05；**LG组与LG组+TTR比较,P＞0.05；##LG缺氧组与LG缺氧组+TTR比较，P＞0.05
与单独生长细胞相比，共培养hRPEC对hREC生长有显著抑制作用，差异有统计学意义(LG组：F=15.711,P＜0.05； LG缺氧组：F=45.659,P＜0.05；HG,F=7.857,P＜0.05；HG缺氧组；F=6.348,P＜0.05)(图 5)。
图5
hRPEC与hREC共培养后细胞生长指数。*LG组hREC与LG组hRPEC比较，P＜0.05；#HG组hREC与HG组hRPEC比较，P＜0.05；**LG缺氧组hREC与LG缺氧组hRPEC比较，P＜0.05；##HG缺氧组hREC与HG缺氧组hRPEC比较，P＜0.05
3 讨论
本研究设定5.5 mmol/L葡萄糖为正常条件，25.0 mmol/l葡萄糖为异常条件，同时利用200 μmol/L CoCl2诱导细胞达到缺氧条件。结果显示，在HG缺氧条件下hREC、hRPEC生长均受到显著抑制。而当加入4 μmol/L的外源性TTR后，LG组及LG缺氧组hREC增生得到显著提升；HG组及HG缺氧组hREC受到显著抑制。说明TTR对hREC发挥抑制作用的必要条件是HG；而在LG环境中，缺氧条件并不能引发TTR对hREC的抑制作用。
由于眼部TTR主要由hRPEC表达，为此我们对hREC及hRPEC进行了transwell共培养，解析hRPEC对hREC的影响。结果显示，TTR对hRPEC的生长略有提升，但差异无统计学意义。而在transwell共培养体系中，hRPEC均能抑制hREC的增生，这和外源性TTR在LG环境中对hREC的促进作用相悖。由于TTR可以由hRPEC分泌，此结果可能与培养过程中TTR的表达量相关。因此，在进一步的实验中，我们将观察hRPEC细胞中TTR基因在各种环境中的转录水平，以及检测TTR蛋白在培养液中的实时当量。
我们的前期研究发现，高度近视患者玻璃体内TTR含量大幅增长[8-10],而糖尿病患者体液TTR当量大幅下降[11],即糖尿病患者和高度近视患者体液内的TTR含量变化趋势相反；此外，也有临床报道显示高度近视患者不易发生DR[12, 13]。这些临床表象的背后，可能存在一些与TTR相关的机制。在我们的进一步研究中，拟在生物功能方面全面探索TTR对细胞信号通路的介入，进一步探索TTR对hREC细胞的作用机制。
