引用本文： 郭慧青, 盛迅伦. 散发型视网膜色素变性致病基因及其遗传方式观察. 中华眼底病杂志, 2016, 32(6): 576-581. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2016.06.004 复制
视网膜色素变性(RP)遗传方式复杂并且具有高度的遗传异质性。除了常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传(XL)以及少数双基因型及线粒体遗传RP，还有40%~50%的RP患者因缺乏家族史而无遗传规律可循，称为散发型RP (sRP)[1, 2]。目前已证实，与RP有关的基因已超过70个[2]，致病基因众多且缺乏突变热点。既往采用筛选单个候选基因的方法筛查sRP患者的致病基因及其突变位点，不仅耗时漫长且检测效率低下，难以筛查到致病基因。目标序列捕获测序是将目标序列捕获芯片与高通量二代测序(NGS)技术相整合进行测序，以获得目标基因组序列的研究策略，使得致病基因突变检测更为简便、高效和准确。本研究采用外显子捕获结合NGS技术对一组sRP患者进行了致病基因突变检测，分析其遗传方式。现将结果报道如下。
1 对象和方法
2013年3月至2014年10月在宁夏眼科医院确诊为sRP的患者49例以及家庭成员128名纳入研究。本研究经本院伦理委员会审核批准。遵循赫尔辛基宣言，所有受检者和未成年患者监护人均签署知情同意书。
参照文献[3, 4]确立本组患者纳入标准，典型RP：(1) 有夜盲史；(2) 视力逐渐下降；(3) 典型眼底改变，视盘呈蜡黄色萎缩，视网膜有骨细胞样色素沉着，血管变细，视网膜呈青灰色；(4) 早期周边视野呈环形暗点，晚期视野呈向中心缩窄；(5) 病变早期即可出现视网膜电图(ERG)、眼电图(EOG)明显异常。无色素性RP：有夜盲史，ERG、EOG异常；眼底无色素沉着或仅在周边眼底出现少数几个骨细胞样色素斑。结晶样RP (BCD)：符合典型RP临床表现，眼底改变表现为闪亮的黄白色结晶，伴色素沉着。Usher综合征2型(USH2)：符合典型RP眼底改变，且伴中等程度的耳聋，前庭功能正常[5, 6]。排除Bardet-Biedl综合征和代谢异常所致的视网膜色素上皮(RPE)变性。
详细收集患者病史和家族史；询问病史确定夜盲出现年龄。所有患者及其家庭成员均行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼压、眼底彩色照相、视野、光相干断层扫描(OCT)、全视野ERG检查。行眼底自身荧光和荧光素眼底血管造影检查10例。所有患者病史、家族史及临床表现符合sRP诊断标准[7, 8]。其家庭成员均无夜盲病史，眼底检查未见色素沉着。
抽取患者及其家庭成员外周静脉血3~5 ml, 乙二胺四乙酸抗凝，采用德国QIAGEN公司Qiamp Blood试剂盒按照操作规程提取全基因组DNA。DNA质量浓度≥50 ng/μl, 吸光度[A，旧称光密度(OD)]A260/A280为1.8~2.0，DNA总量≥6 μg。应用美国Agilent公司Sureselect RNA探针对目前已知的230个遗传性视网膜疾病(HRD)致病基因的外显子区域进行捕获。针对HRD 2560个外显子非重复区设计生物素化的单链捕获探针[9]。将1 μg DNA文库与缓冲BL液和设计的探针混合，95℃加热7 min，65℃加热2 min; 加入23 ml预热至65℃的HY缓冲液，65℃杂交22 h。用500 μl 1倍结合缓冲液清洗50 μl MyOne磁珠(美国Life Technology公司) 3次，重悬于80 μl 1倍结合缓冲液。加入64 μl 2倍结合缓冲液至杂交混合物中，转移至含有80 μl MyOne磁珠的试管中。旋转混匀1 h。WB1缓冲液室温清洗磁珠15 min，WB3缓冲液65℃清洗3次，15 min/次。洗脱缓冲液洗脱结合的DNA。洗脱的DNA进行聚合酶链反应(PCR)，98℃预变性30 s; 98℃变性25 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行15个循环；最后72℃延伸5 min。纯化PCR产物。富集的文库用Il-lumina HiSeq 2000第二代测序仪进行双端测序，读长为100碱基对。
目标序列测序后原始数据经过拆分获得各个样本的原始序列，去除测序数据中的接头和质量值≤20的低质量数据，运用BWA软件对比参考基因，应用GATK软件对各个样本的比对数据进行多态性位点检测，对单个碱基的变异和单核苷酸多态性(SNPs)插入缺失突变(InDels)等数据进行统计分析。同时对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计和分析。去除dbSNP137数据库、千人基因组和内部数据库800名正常汉族人数据库中出现的SNPs和InDels。同时过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的突变位点作为最后疾病相关的突变位点。根据AD、AR、XL的遗传规律，分析家族史，确立其遗传类型[10, 11]。
根据需要测序的DNA片段合成引物，PCR进行扩增，美国Applied Biosystems公司ABI3730xl测序仪以Sanger测序法进行测序，并将测序结果与目标序列捕获测序后的结果进行比对，最终确定致病基因突变位点。
2 结果
设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。49例患者目标序列平均测序深度为52.93~57.15，目标序列覆盖率71.0%~140.0%。98.17%~99.08%的目标序列覆盖率 > 4×，96.79%~98.48%目标序列覆盖率 > 10×，92.42%~96.90%的目标序列覆盖率 > 20×。
49例患者中，24例患者成功检测到致病突变位点，共涉及16个基因；检测阳性率为49.0%。发现突变位点41个。其中，新发现突变位点32个，占78.0%(表 1)。
表1
24例sRP患者基因突变检测结果
24例患者中，致病基因USH2A 7例，占29.2%；C2orf71、RDH12、GNGA1各2例，分别占8.3%RPGR1、IFT140、TULP1、CLRN1、RPE65、ABCA4、GUCA1A、EYS、CYP4V2、GPR98、ATXN7各1例，分别占4.2%。根据其家系成员基因筛查结果分析，24例患者中，ARRP者20例，占83.3%；ADRP者3例，占12.5%；XLRP者1例，占4.2%。7例检测到USH2A基因突变的患者中，确诊为USH2者3例，占所有患者的6.1%；无综合征ARRP者4例，占所有患者的8.2%。
24例患者出现夜盲年龄为2~47岁，就诊时年龄为4~70岁。BCVA为眼前数指~1.0。
ARRP者20例，患者序号为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、23。致病基因分别为USH2A、IFT140、USH2A、C2orf71、CNGA1、C2orf71、RDH12、USH2A、TULP1、CLRN1、CNGA1、RPE65、USH2A、USH2A、USH2A、USH2A、ABCA4、EYS、CYP4V2、GPR98。出现夜盲
时年龄5~40岁。BCVA为眼前数指~1.0。眼底视盘颜色明显变淡或蜡黄，视网膜血管变细，后极部及周边散在骨细胞样色素沉着；视网膜神经上皮层变薄。黄斑部萎缩7例，伴黄斑前膜2例，伴黄斑囊样水肿1例。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中度、重度下降1、6例，熄灭状12例；明适应a、b波振幅中度、重度下降3、7例，熄灭状9例。未行全视野ERG检查1例。色觉检查：全色盲、红绿色盲各1例；色觉正常11例；未行色觉检查7例。
序号22患者，眼底视盘颜色蜡黄；视网膜血管变细，后极部可见结晶样亮点，后极部包括黄斑区散在分布结晶样亮点或融合成条状，大小约为视网膜中央静脉管径的一半，视网膜散在不规则样色素沉着(图 1)。OCT检查可见中心凹形态变平，神经上皮层变薄，椭圆体带缺失，RPE层不连续(图 2)。临床诊断为BCD。基因测序为CYP4V2基因的复合杂合性突变(p.268-270del，c.789delT)(图 3)，为新发现的突变位点。
图1
左眼彩色眼底像。视盘颜色蜡黄，视网膜血管明显变细，后极部散在分布结晶样亮点，以及散在不规则样色素沉着 图 2 左眼OCT像。黄斑中心凹形态变平，神经上皮层变薄，椭圆体带缺失，RPE层不连续 图 3 基因测序图。CYP4V2基因复合杂合性突变(p.268-270del，c.789delT)(黑箭) 图 4 右眼彩色眼底像。视盘颜色红润，视网膜内未见色素沉着 图 5 基因测序图。TULP1基因的纯合突变(c.C1024G)(黑箭)
序号10患儿，5岁。夜间视力差。眼底视盘颜色红润，视网膜未见明显色素沉着(图 4)。OCT、眼底自身荧光检查均未见异常。临床诊断为无色素性RP。基因测序为TULP1基因的纯合突变(c.C1024G)(图 5)。其父母各携带1条突变基因；其姐姐未诉夜间视力差。眼底未见明显色素沉着。ERG检查双眼b波中度下降，其余未见异常。基因测序结果为携带1条TULP1基因的错义突变(c.C1024G)。
ADRP者3例，患者序号为19、21、24。致病基因分别为GUCA1A、RDH12、ATXN4；突变位点分别为c.T466C、c.C532T、c.G746T，其中c.G746T为新发现错义突变。患者出现夜盲时年龄分别为43、47、40岁。BCVA为眼前数指~1.0。眼底视盘颜色明显变淡或蜡黄，视网膜血管变细，后极部及周边散在骨细胞样色素颗粒沉着。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中、重度下降各1例；明适应a、b波振幅中度下降、熄灭状各1例。未行全视野ERG检查1例。
XLRP者1例，患者序号1。致病基因RPGR；突变位点c.2405_2406del，为新发现移码突变。患者出现夜盲时年龄20岁。BCVA为0.25。眼底视盘颜色淡，视网膜血管变细，周边弥漫性骨细胞样色素颗粒沉着。OCT检查显示神经上皮层变薄。色觉检查正常。全视野ERG检查，暗适应、明适应a、b波振幅均呈熄灭状。
致病基因USH2A 7例中，确诊为USH2综合征者3例，患者序号为2、4、15。致病基因USH2A。其中，序号2患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个剪切突变；序号4患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个移码突变；序号15患者该基因的突变类型为复合杂合型错义突变。患者均自幼出现中等程度听力下降，前庭功能检查均正常。眼底视盘颜色淡，视网膜血管变细，周边骨细胞样色素沉着。OCT检查显示神经上皮层变薄。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中、重度下降、熄灭状各1例；明适应a、b波振幅中度下降、重度下降、熄灭状各1例。
3 讨论
RP致病基因与临床表型具有高度异质性。应用连锁分析等传统方法研究孟德尔遗传方式的遗传性疾病，一般需要足够多的患者或大家系，对于小家系或散发患者难以分析。近年出现的外显子捕获技术利用特制的探针对特定的蛋白编码区域DNA或某段特定的序列进行捕获，富集后再进行高通量测序，具有效率高、经费低、时间短等优点[9]。我们前期曾使用传统测序方法对87例sRP患者检测了常见的5个RP致病突变基因，未发现致病突变基因位点[12]。本研究采用外显子结合目标区域测序技术，49例患者中24例患者成功检测到致病突变基因位点，共涉及16个基因，检测阳性率为49.0%，极大提高检测的效率。但仍有51%的患者未找到基因突变位点，其原因一方面可能是检测方法仍存在一定局限性；另一方面也不能排除此部分患者中存在新的RP致病基因的可能。
Hartong等[10]认为，多数sRP患者为AR或XL (对于男性患者)。尽管少数患者可能是由于自身基因突变而开始一个新的遗传过程，即由该基因突变患者作为初始进行遗传，在以后的遗传中，遗传方式可以为ADRP、ARRP、XLRP遗传类型中的任何一种。本研究检测到致病基因的24例患者中，83.3%为AR，12.5%为AD，4.2%为XL。与Hartong等[10]观点相符。
本研究中24例患者检测到致病突变基因16个，突变位点41个，其中78.0%为新发现的突变位点。由于种族、地域不同，不同种族人群的突变频谱存在较大差异[12]。有学者报道，日本人群sRP和ARRP中GNGA1、EYS是主要致病基因，突变率分别为13.3%、13.3%；GNGA1的突变率明显高于欧洲国家[13]。欧洲人群EYS、USH2A在sRP、ARRP患者中突变率较高[14]。本研究中涉及的突变基因较多，其中USH2A基因的突变率较高，占29.2%，其他各基因突变率较低。因此，我们认为USH2A基因是本组sRP患者的主要致病基因。但由于样本量不够大，还需进一步研究结果证实。
RP可以合并不同类型的综合征，其中最常见者为USH；大约可占全部RP患者的15.0%~20.0%[5]。根据临床表现不同USH又可分为3型。USH2A基因是USH2的主要致病基因，约占USH2致病基因的70.0%。目前已发现100余种突变与之相关[6]。目前国内外已有多项研究表明，USH2A基因突变也可引起非综合征型的常染色体ARRP，且较为常见[15]。Seyedahmadi等[16]对北美225例非综合征型ARRP患者进行USH2A基因突变分析，结果发现有4.5%的患者携带错义突变p.C759F，且与USH2患者的突变类型有所不同。非综合征RP患者USH2A基因突变形式通常为纯合错义突变或复合杂合错义突变。美国有研究者对USH和非综合征ARRP患者进行基因突变分析，发现12.0%~25.0%的ARRP患者携带USH2A基因突变[17]。由此可见，USH2A基因是美国ARRP患者中最常见的致病基因。本研究中，共有7例患者检测到USH2A基因突变，3例患者自幼出现中等程度的听力损害，前庭功能正常诊断为USH2。其中序号2患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个剪切突变，序号4患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个移码突变；序号15患者为复合杂合型错义突变。另外4例患者无听力异常，诊断为无综合征型ARRP。突变方式均为复合杂合型错义突变。目前，在国内关于USH2A基因的研究较少，且无有关USH2A基因可引起无综合征型ARRP的报道。本研究中，USH2A基因在无综合征型ARRP患者中的突变率较高，占8.2%。
RP分为典型性和非典型性。非典型性RP包括BCD、无色素性RP、中心性和旁中心性RP和单眼RP[16, 17]。本研究中BCD和无色素性RP各1例。BCD在欧美国家发病率较低，而在中国和日本发病率则相对较高，中国人群中其发病率为1/24 000[18]。目前，唯一可确定的导致BCD的基因是CYP4V2，其编码产物参与脂肪酸的代谢[18, 19]。单明华和李扬[19]对国内24例BCD患者进行CYP4V2基因检测，除1例患者外，其他患者均检测到CYP4V2基因上的突变。本研究中序号22患者临床诊断为BCD，基因测序结果为CYP4V2基因上的2个移码突变(c.802-810del、c.789delT)，为未报道过的新发突变。进一步证实了CYP4V2基因突变可导致BCD，扩展了CYP4V2的基因突变谱。无色素性RP患者临床特征为夜盲但眼底无色素沉着，也有部分患者长期观察可出现色素沉着。本研究中序号10患儿为无色素性RP，基因测序结果为TULP1基因上的纯合错义突变(c.C1024G)。其父母各携带1条突变基因。其姐姐未诉夜间视力差，眼底未见明显色素沉着，ERG检查b波双眼中度下降。基因测序结果为携带者。目前国内有关无色素性RP基因突变研究较少。有研究报道，TULP1基因突变是与早发型RP有关的1个基因[20]，但国内暂无TULP1基因突变与无色素性RP的相关研究报道。
视网膜色素变性(RP)遗传方式复杂并且具有高度的遗传异质性。除了常染色体显性遗传(AD)、常染色体隐性遗传(AR)、X连锁遗传(XL)以及少数双基因型及线粒体遗传RP，还有40%~50%的RP患者因缺乏家族史而无遗传规律可循，称为散发型RP (sRP)[1, 2]。目前已证实，与RP有关的基因已超过70个[2]，致病基因众多且缺乏突变热点。既往采用筛选单个候选基因的方法筛查sRP患者的致病基因及其突变位点，不仅耗时漫长且检测效率低下，难以筛查到致病基因。目标序列捕获测序是将目标序列捕获芯片与高通量二代测序(NGS)技术相整合进行测序，以获得目标基因组序列的研究策略，使得致病基因突变检测更为简便、高效和准确。本研究采用外显子捕获结合NGS技术对一组sRP患者进行了致病基因突变检测，分析其遗传方式。现将结果报道如下。
1 对象和方法
2013年3月至2014年10月在宁夏眼科医院确诊为sRP的患者49例以及家庭成员128名纳入研究。本研究经本院伦理委员会审核批准。遵循赫尔辛基宣言，所有受检者和未成年患者监护人均签署知情同意书。
参照文献[3, 4]确立本组患者纳入标准，典型RP：(1) 有夜盲史；(2) 视力逐渐下降；(3) 典型眼底改变，视盘呈蜡黄色萎缩，视网膜有骨细胞样色素沉着，血管变细，视网膜呈青灰色；(4) 早期周边视野呈环形暗点，晚期视野呈向中心缩窄；(5) 病变早期即可出现视网膜电图(ERG)、眼电图(EOG)明显异常。无色素性RP：有夜盲史，ERG、EOG异常；眼底无色素沉着或仅在周边眼底出现少数几个骨细胞样色素斑。结晶样RP (BCD)：符合典型RP临床表现，眼底改变表现为闪亮的黄白色结晶，伴色素沉着。Usher综合征2型(USH2)：符合典型RP眼底改变，且伴中等程度的耳聋，前庭功能正常[5, 6]。排除Bardet-Biedl综合征和代谢异常所致的视网膜色素上皮(RPE)变性。
详细收集患者病史和家族史；询问病史确定夜盲出现年龄。所有患者及其家庭成员均行最佳矫正视力(BCVA)、裂隙灯显微镜、间接检眼镜、眼压、眼底彩色照相、视野、光相干断层扫描(OCT)、全视野ERG检查。行眼底自身荧光和荧光素眼底血管造影检查10例。所有患者病史、家族史及临床表现符合sRP诊断标准[7, 8]。其家庭成员均无夜盲病史，眼底检查未见色素沉着。
抽取患者及其家庭成员外周静脉血3~5 ml, 乙二胺四乙酸抗凝，采用德国QIAGEN公司Qiamp Blood试剂盒按照操作规程提取全基因组DNA。DNA质量浓度≥50 ng/μl, 吸光度[A，旧称光密度(OD)]A260/A280为1.8~2.0，DNA总量≥6 μg。应用美国Agilent公司Sureselect RNA探针对目前已知的230个遗传性视网膜疾病(HRD)致病基因的外显子区域进行捕获。针对HRD 2560个外显子非重复区设计生物素化的单链捕获探针[9]。将1 μg DNA文库与缓冲BL液和设计的探针混合，95℃加热7 min，65℃加热2 min; 加入23 ml预热至65℃的HY缓冲液，65℃杂交22 h。用500 μl 1倍结合缓冲液清洗50 μl MyOne磁珠(美国Life Technology公司) 3次，重悬于80 μl 1倍结合缓冲液。加入64 μl 2倍结合缓冲液至杂交混合物中，转移至含有80 μl MyOne磁珠的试管中。旋转混匀1 h。WB1缓冲液室温清洗磁珠15 min，WB3缓冲液65℃清洗3次，15 min/次。洗脱缓冲液洗脱结合的DNA。洗脱的DNA进行聚合酶链反应(PCR)，98℃预变性30 s; 98℃变性25 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，共进行15个循环；最后72℃延伸5 min。纯化PCR产物。富集的文库用Il-lumina HiSeq 2000第二代测序仪进行双端测序，读长为100碱基对。
目标序列测序后原始数据经过拆分获得各个样本的原始序列，去除测序数据中的接头和质量值≤20的低质量数据，运用BWA软件对比参考基因，应用GATK软件对各个样本的比对数据进行多态性位点检测，对单个碱基的变异和单核苷酸多态性(SNPs)插入缺失突变(InDels)等数据进行统计分析。同时对测序深度、均一性、探针特异性等数据进行统计和分析。去除dbSNP137数据库、千人基因组和内部数据库800名正常汉族人数据库中出现的SNPs和InDels。同时过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的突变位点作为最后疾病相关的突变位点。根据AD、AR、XL的遗传规律，分析家族史，确立其遗传类型[10, 11]。
根据需要测序的DNA片段合成引物，PCR进行扩增，美国Applied Biosystems公司ABI3730xl测序仪以Sanger测序法进行测序，并将测序结果与目标序列捕获测序后的结果进行比对，最终确定致病基因突变位点。
2 结果
设计合成的目标基因特异性捕获探针可有效捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段。49例患者目标序列平均测序深度为52.93~57.15，目标序列覆盖率71.0%~140.0%。98.17%~99.08%的目标序列覆盖率 > 4×，96.79%~98.48%目标序列覆盖率 > 10×，92.42%~96.90%的目标序列覆盖率 > 20×。
49例患者中，24例患者成功检测到致病突变位点，共涉及16个基因；检测阳性率为49.0%。发现突变位点41个。其中，新发现突变位点32个，占78.0%(表 1)。
表1
24例sRP患者基因突变检测结果
24例患者中，致病基因USH2A 7例，占29.2%；C2orf71、RDH12、GNGA1各2例，分别占8.3%RPGR1、IFT140、TULP1、CLRN1、RPE65、ABCA4、GUCA1A、EYS、CYP4V2、GPR98、ATXN7各1例，分别占4.2%。根据其家系成员基因筛查结果分析，24例患者中，ARRP者20例，占83.3%；ADRP者3例，占12.5%；XLRP者1例，占4.2%。7例检测到USH2A基因突变的患者中，确诊为USH2者3例，占所有患者的6.1%；无综合征ARRP者4例，占所有患者的8.2%。
24例患者出现夜盲年龄为2~47岁，就诊时年龄为4~70岁。BCVA为眼前数指~1.0。
ARRP者20例，患者序号为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、20、22、23。致病基因分别为USH2A、IFT140、USH2A、C2orf71、CNGA1、C2orf71、RDH12、USH2A、TULP1、CLRN1、CNGA1、RPE65、USH2A、USH2A、USH2A、USH2A、ABCA4、EYS、CYP4V2、GPR98。出现夜盲
时年龄5~40岁。BCVA为眼前数指~1.0。眼底视盘颜色明显变淡或蜡黄，视网膜血管变细，后极部及周边散在骨细胞样色素沉着；视网膜神经上皮层变薄。黄斑部萎缩7例，伴黄斑前膜2例，伴黄斑囊样水肿1例。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中度、重度下降1、6例，熄灭状12例；明适应a、b波振幅中度、重度下降3、7例，熄灭状9例。未行全视野ERG检查1例。色觉检查：全色盲、红绿色盲各1例；色觉正常11例；未行色觉检查7例。
序号22患者，眼底视盘颜色蜡黄；视网膜血管变细，后极部可见结晶样亮点，后极部包括黄斑区散在分布结晶样亮点或融合成条状，大小约为视网膜中央静脉管径的一半，视网膜散在不规则样色素沉着(图 1)。OCT检查可见中心凹形态变平，神经上皮层变薄，椭圆体带缺失，RPE层不连续(图 2)。临床诊断为BCD。基因测序为CYP4V2基因的复合杂合性突变(p.268-270del，c.789delT)(图 3)，为新发现的突变位点。
图1
左眼彩色眼底像。视盘颜色蜡黄，视网膜血管明显变细，后极部散在分布结晶样亮点，以及散在不规则样色素沉着 图 2 左眼OCT像。黄斑中心凹形态变平，神经上皮层变薄，椭圆体带缺失，RPE层不连续 图 3 基因测序图。CYP4V2基因复合杂合性突变(p.268-270del，c.789delT)(黑箭) 图 4 右眼彩色眼底像。视盘颜色红润，视网膜内未见色素沉着 图 5 基因测序图。TULP1基因的纯合突变(c.C1024G)(黑箭)
序号10患儿，5岁。夜间视力差。眼底视盘颜色红润，视网膜未见明显色素沉着(图 4)。OCT、眼底自身荧光检查均未见异常。临床诊断为无色素性RP。基因测序为TULP1基因的纯合突变(c.C1024G)(图 5)。其父母各携带1条突变基因；其姐姐未诉夜间视力差。眼底未见明显色素沉着。ERG检查双眼b波中度下降，其余未见异常。基因测序结果为携带1条TULP1基因的错义突变(c.C1024G)。
ADRP者3例，患者序号为19、21、24。致病基因分别为GUCA1A、RDH12、ATXN4；突变位点分别为c.T466C、c.C532T、c.G746T，其中c.G746T为新发现错义突变。患者出现夜盲时年龄分别为43、47、40岁。BCVA为眼前数指~1.0。眼底视盘颜色明显变淡或蜡黄，视网膜血管变细，后极部及周边散在骨细胞样色素颗粒沉着。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中、重度下降各1例；明适应a、b波振幅中度下降、熄灭状各1例。未行全视野ERG检查1例。
XLRP者1例，患者序号1。致病基因RPGR；突变位点c.2405_2406del，为新发现移码突变。患者出现夜盲时年龄20岁。BCVA为0.25。眼底视盘颜色淡，视网膜血管变细，周边弥漫性骨细胞样色素颗粒沉着。OCT检查显示神经上皮层变薄。色觉检查正常。全视野ERG检查，暗适应、明适应a、b波振幅均呈熄灭状。
致病基因USH2A 7例中，确诊为USH2综合征者3例，患者序号为2、4、15。致病基因USH2A。其中，序号2患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个剪切突变；序号4患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个移码突变；序号15患者该基因的突变类型为复合杂合型错义突变。患者均自幼出现中等程度听力下降，前庭功能检查均正常。眼底视盘颜色淡，视网膜血管变细，周边骨细胞样色素沉着。OCT检查显示神经上皮层变薄。全视野ERG检查，暗适应a、b波振幅中、重度下降、熄灭状各1例；明适应a、b波振幅中度下降、重度下降、熄灭状各1例。
3 讨论
RP致病基因与临床表型具有高度异质性。应用连锁分析等传统方法研究孟德尔遗传方式的遗传性疾病，一般需要足够多的患者或大家系，对于小家系或散发患者难以分析。近年出现的外显子捕获技术利用特制的探针对特定的蛋白编码区域DNA或某段特定的序列进行捕获，富集后再进行高通量测序，具有效率高、经费低、时间短等优点[9]。我们前期曾使用传统测序方法对87例sRP患者检测了常见的5个RP致病突变基因，未发现致病突变基因位点[12]。本研究采用外显子结合目标区域测序技术，49例患者中24例患者成功检测到致病突变基因位点，共涉及16个基因，检测阳性率为49.0%，极大提高检测的效率。但仍有51%的患者未找到基因突变位点，其原因一方面可能是检测方法仍存在一定局限性；另一方面也不能排除此部分患者中存在新的RP致病基因的可能。
Hartong等[10]认为，多数sRP患者为AR或XL (对于男性患者)。尽管少数患者可能是由于自身基因突变而开始一个新的遗传过程，即由该基因突变患者作为初始进行遗传，在以后的遗传中，遗传方式可以为ADRP、ARRP、XLRP遗传类型中的任何一种。本研究检测到致病基因的24例患者中，83.3%为AR，12.5%为AD，4.2%为XL。与Hartong等[10]观点相符。
本研究中24例患者检测到致病突变基因16个，突变位点41个，其中78.0%为新发现的突变位点。由于种族、地域不同，不同种族人群的突变频谱存在较大差异[12]。有学者报道，日本人群sRP和ARRP中GNGA1、EYS是主要致病基因，突变率分别为13.3%、13.3%；GNGA1的突变率明显高于欧洲国家[13]。欧洲人群EYS、USH2A在sRP、ARRP患者中突变率较高[14]。本研究中涉及的突变基因较多，其中USH2A基因的突变率较高，占29.2%，其他各基因突变率较低。因此，我们认为USH2A基因是本组sRP患者的主要致病基因。但由于样本量不够大，还需进一步研究结果证实。
RP可以合并不同类型的综合征，其中最常见者为USH；大约可占全部RP患者的15.0%~20.0%[5]。根据临床表现不同USH又可分为3型。USH2A基因是USH2的主要致病基因，约占USH2致病基因的70.0%。目前已发现100余种突变与之相关[6]。目前国内外已有多项研究表明，USH2A基因突变也可引起非综合征型的常染色体ARRP，且较为常见[15]。Seyedahmadi等[16]对北美225例非综合征型ARRP患者进行USH2A基因突变分析，结果发现有4.5%的患者携带错义突变p.C759F，且与USH2患者的突变类型有所不同。非综合征RP患者USH2A基因突变形式通常为纯合错义突变或复合杂合错义突变。美国有研究者对USH和非综合征ARRP患者进行基因突变分析，发现12.0%~25.0%的ARRP患者携带USH2A基因突变[17]。由此可见，USH2A基因是美国ARRP患者中最常见的致病基因。本研究中，共有7例患者检测到USH2A基因突变，3例患者自幼出现中等程度的听力损害，前庭功能正常诊断为USH2。其中序号2患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个剪切突变，序号4患者该基因的突变类型为2个错义突变和1个移码突变；序号15患者为复合杂合型错义突变。另外4例患者无听力异常，诊断为无综合征型ARRP。突变方式均为复合杂合型错义突变。目前，在国内关于USH2A基因的研究较少，且无有关USH2A基因可引起无综合征型ARRP的报道。本研究中，USH2A基因在无综合征型ARRP患者中的突变率较高，占8.2%。
RP分为典型性和非典型性。非典型性RP包括BCD、无色素性RP、中心性和旁中心性RP和单眼RP[16, 17]。本研究中BCD和无色素性RP各1例。BCD在欧美国家发病率较低，而在中国和日本发病率则相对较高，中国人群中其发病率为1/24 000[18]。目前，唯一可确定的导致BCD的基因是CYP4V2，其编码产物参与脂肪酸的代谢[18, 19]。单明华和李扬[19]对国内24例BCD患者进行CYP4V2基因检测，除1例患者外，其他患者均检测到CYP4V2基因上的突变。本研究中序号22患者临床诊断为BCD，基因测序结果为CYP4V2基因上的2个移码突变(c.802-810del、c.789delT)，为未报道过的新发突变。进一步证实了CYP4V2基因突变可导致BCD，扩展了CYP4V2的基因突变谱。无色素性RP患者临床特征为夜盲但眼底无色素沉着，也有部分患者长期观察可出现色素沉着。本研究中序号10患儿为无色素性RP，基因测序结果为TULP1基因上的纯合错义突变(c.C1024G)。其父母各携带1条突变基因。其姐姐未诉夜间视力差，眼底未见明显色素沉着，ERG检查b波双眼中度下降。基因测序结果为携带者。目前国内有关无色素性RP基因突变研究较少。有研究报道，TULP1基因突变是与早发型RP有关的1个基因[20]，但国内暂无TULP1基因突变与无色素性RP的相关研究报道。
