引用本文： 付金玲. Crumbs蛋白对斑马鱼视网膜不同种类光感受器细胞的影响. 中华眼底病杂志, 2017, 33(2): 172-175. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.02.014 复制
光感受器细胞进行性死亡是导致视网膜色素变性（RP）患者视力丧失的主要原因[1]。人类Crumbs（Crb）同系物-1（CRB1）基因突变可以导致RP和Leber先天性黑矇[2-7]。目前大多数CRB1致病突变发生在细胞外区域，表明CRB1能够感知光感受器细胞维持的细胞外信号。脊椎动物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3种内源性视网膜Crb蛋白[8,9]。作为一种脊椎动物的模式生物，斑马鱼视网膜光感受器细胞由一种视杆细胞和对紫外光（UV）及红绿蓝光（RGB）敏感的4种视锥细胞构成[10]，在部分视网膜疾病的研究上具有独特优势[11-13]。我们利用通过抑制内源性Crb2b功能从而破坏光感受器之间黏附的Tg（RH2-2：Crb2b-sf-EX/ RH2-2：GFP）pt108b转基因斑马鱼（pt108b斑马鱼）[14]，观察内源性视网膜Crb蛋白对不同种类光感受器细胞的影响，从而为RP发病机制研究提供可能的动物模型。
1 材料和方法
AB野生型斑马鱼及pt108b斑马鱼在14 h光照/10 h黑暗交替循环的恒温鱼房培育饲养。所有实验步骤均遵循匹兹堡大学动物研究使用及饲养标准。将27个月龄老年野生型斑马鱼及相同月龄pt108b斑马鱼眼球固定于4%多聚甲醛，常温过夜，梯度酒精脱水。将眼球标本和JB-4混合溶液放入JB-4包埋模具，参照JB-4包埋试剂盒（德国Polysciences公司）说明书进行包埋。超薄切片机（美国Thermo Electron公司）以3 μm厚度沿眼球腹-背及鼻-颞（前-后）两个方向进行切割成完整视网膜（图1，2）。收集通过眼球中央区域的3张连续切片，行福尔根染色[8]。光学显微镜观察（BX60，日本奥林巴斯公司），SPOT RT照相机进行完整视网膜照相，SPOT4.6软件（英国Diagnostic Instruments公司）进行分析。
图1
斑马鱼眼球延腹-背及鼻-颞（前-后）两个方向切割示意图
图2
27个月龄野生型斑马鱼眼球切割后光学显微镜像。2A. 经鼻-颞方向切割；2B. 经腹-背方向切割。可见完整视网膜 福尔根 标尺：50 μm
在三维空间中将沿两个垂直方向切割染色后的完整视网膜各经36°平均分割为鼻周边区、鼻中间区、中央区、颞中间区、颞周边区、背周边区、背中间区、腹中间区和腹周边区9个区域。光学显微镜镜下计数视杆细胞、UV视锥细胞、RGB视锥细胞3种类型光感受器细胞密度。细胞核计数区域为每个视网膜局部区域中央200 μm长度范围。分别计算野生型斑马鱼及pt108b斑马鱼3张连续切片视网膜9个区域上述3种类型光感受器细胞密度的算数平均值（n=5）。
应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差（ ）表示，行配对t检验。α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，野生型斑马鱼3种类型光感受器细胞在中央区排列最为紧密，周边区排列最为稀疏，鼻、颞、腹、背4个区域中央-中间-周边方向细胞密度逐渐下降。视杆细胞核呈圆形，较视锥细胞核染色深，位于视网膜外核层基底部；UV视锥细胞核也呈圆形，但较视杆细胞核大且比视杆细胞染色淡，位于视杆细胞顶端部、外限制膜基底部；RGB视锥细胞核延顶端-基底方向伸长，较视杆细胞核染色淡，位于外限制膜顶端部（图3）。
图3
野生型斑马鱼视网膜组织光学显微镜像。视杆细胞核呈圆形、染色深；UV视锥细胞核呈圆形、染色淡（黑箭）；RGB视锥细胞核染色淡，位于外限制膜顶端部 福尔根 标尺：5 μm
与野生型斑马鱼比较，pt108b斑马鱼位于视网膜外核层顶部细长的RGB视锥细胞核密度明显减少，中央区和中间区RGB视锥细胞几乎完全消失（图4，5）；细胞核呈圆形、淡染并稀疏分布）（图4）。位于外核层基底部的视杆细胞核小呈圆形、染色深（图4）。
图4
pt108b斑马鱼视网膜组织光学显微镜像。UV视锥细胞核呈圆形、淡染并稀疏分布（黑箭）；视杆细胞核小呈圆形、染色深 福尔根 标尺：5 μm
图5
野生型斑马鱼和pt108b斑马鱼视网膜组织不同区域光学显微镜像。5A～5E. 野生型斑马鱼；5F～5J. pt108b斑马鱼。pt108b斑马鱼位于视网膜外核层顶部细长的RGB视锥细胞核密度较野生型斑马鱼明显减少，中央区和中间区RGB视锥细胞几乎完全消失 福尔根 标尺：10 μm
与野生型斑马鱼比较，pt108b斑马鱼视网膜中央区RGB视锥细胞密度显著下降，差异有统计学意义（P=0.7689）；UV视锥细胞密度差异无统计学意义变（P=0.000 01）；视杆细胞密度显著增加，差异有统计学意义（P=0.000 2）（图5，6）。
图6
27个月龄野生型斑马鱼和同月龄pt108b斑马鱼视网膜中央区光感受器细胞密度比较。*P＜0.005
3 讨论
由于脊椎动物视网膜体积大、形态弯曲，计数整个视网膜细胞数目较为困难，但可以通过系统抽样局部视网膜区域的细胞密度研究在老化过程中或在疾病中视网膜细胞数目的变化趋势。因此，本研究设计了一种简单实用的方法评价在视网膜9个局部区域3种类型光感受器细胞密度的变化。虽然此种采样策略并不能直接揭示视网膜细胞的总数，但能客观评价年龄、区域和遗传变异对视网膜细胞的影响。
作为一种脊椎动物的模式生物，斑马鱼在发育中与人具有很高的相似性。目前以斑马鱼模型研究视网膜的早期发育已经取得了较大进展[15]。脊椎动物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3种内源性视网膜Crb蛋白；而由于基因组的部分重复，斑马鱼存在Crb1、Crb2a、Crb2b、Crb3a和Crb3bCrb等5种内源性视网膜Crb蛋白[9,16]。斑马鱼Crb2a、Crb2b蛋白通过直接介导内节细胞间黏附来维持规律的视锥细胞马赛克结构，而pt108b斑马鱼转基因表达的Crb2b-sf-EX通过竞争性结合到内源性视网膜Crb蛋白的细胞外区域从而破坏Crb2a/Crb2b介导的内节黏附，继而破坏规律的马赛克结构[14]。
本研究结果显示，27个月龄的老年pt108b斑马鱼视网膜中位于外核层顶端区域细长的细胞核显著减少，取代细长细胞核的是一些稀疏分布、圆形淡染的细胞核，这些细胞核有别于位于外核层基底部小而圆形、深染的视杆细胞核。导致其形态变化的原因可能是由于在老年pt108b斑马鱼中RGB视锥细胞被选择性地逐渐杀死，UV视锥细胞核迁移并占据RGB视锥细胞的位置；Crb2b-sf-EX的过度表达有选择性地杀死RGB视锥细胞，UV视锥细胞核向顶部迁移并驻留在外限制膜的顶端。本研究同时比较了Crb功能受到抑制的老年pt108b斑马鱼与同月老年野生型斑马鱼视网膜中央区不同类型光感受器细胞的密度。选择视网膜中央区作为代表区域是因为斑马鱼视网膜中央区细胞出现最早，是评估年龄对细胞密度影响的最佳区域。结果发现，pt108b斑马鱼RGB视锥细胞密度大幅度减少，UV视锥细胞密度几乎不变；视杆细胞密度大幅度增多。视杆细胞密度增多考虑是由于斑马鱼视网膜具有独特的自我修复能力[17]，视锥细胞死亡可以直接刺激与之紧密相邻的视杆细胞增生。
Crb蛋白能够影响斑马鱼视网膜不同种类光感受器细胞的密度。研究Crb功能受到抑制对斑马鱼视网膜不同种类光感受器细胞的影响为RP提供动物模型，有助于进一步揭示RP的发病机制；研究Crb2b在斑马鱼视网膜再生中的作用有望恢复人类光感受器细胞的自我修复能力，从而为RP提供有效的治疗方法。
志谢 感谢卫翔云教授提供实验指导，邹键提供技术支持
读者•作者•编者 关于中华医学会系列杂志指南共识类文章撰写与发表的推荐规范 制定和推广临床指南是当前规范医疗卫生服务的重要举措，为保证临床指南制定的科学、公正和权威，以及使临床指南适应于我国国情，从而更好地发挥指导作用，中华医学会杂志社对指南共识类文章的撰写与发表推荐规范如下。 1 指南共识类文章的撰写 指南共识类文章指具有学术权威性的指导类文章，包括指南、标准、共识、专家建议、草案等。拟在中华医学会系列杂志发表的指南共识类文章，需具备以下条件：（1）有明确的应用范围和目的；（2）制定方为该学科学术代表群体，权益相关各方均有合理参与；（3）有科学的前期研究铺垫，有循证医学证据支持，制定过程严谨规范，文字表述明确，选题有代表性；（4）内容经过充分的专家论证与临床检验，应用性强；（5）制定者与出版者具有独立性，必要时明确告知读者利益冲突情况；（6）制定者提供内容和文字经过审核的终稿。 2 指南共识类文章的发表 （1）指南共识类文章宜在符合其报道范围和读者定位的相关学术期刊上发表；（2）不同期刊可共同决定同时或联合发表某篇指南，版式可有所不同，但内容必须一致；（3）指南类文章二次发表应遵循《关于中华医学会系列杂志论文二次发表的推荐规范》。 关于缩略语使用的要求 文中尽量少用缩略语。已被公知公认的缩略语可以不加注释直接使用。例如：DNA、RNA等。不常用的、尚未被公知公认的缩略语以及原词过长、在文中多次出现者，若为中文可于文中第一次出现时写出全称，在圆括号内写出缩略语；若为外文可于文中第一次出现时写出中文全称，在圆括号内写出其外文缩略语。例如：流行性脑脊髓膜炎（流脑），高度近视圆顶状黄斑（DSM）。再次出现时方可直接使用其缩略语。不超过4个汉字的名词不宜使用缩略语，以免影响论文的可读性。外文缩略语不得拆开转行。文题中不能使用缩略语。 中华医学会杂志社
光感受器细胞进行性死亡是导致视网膜色素变性（RP）患者视力丧失的主要原因[1]。人类Crumbs（Crb）同系物-1（CRB1）基因突变可以导致RP和Leber先天性黑矇[2-7]。目前大多数CRB1致病突变发生在细胞外区域，表明CRB1能够感知光感受器细胞维持的细胞外信号。脊椎动物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3种内源性视网膜Crb蛋白[8,9]。作为一种脊椎动物的模式生物，斑马鱼视网膜光感受器细胞由一种视杆细胞和对紫外光（UV）及红绿蓝光（RGB）敏感的4种视锥细胞构成[10]，在部分视网膜疾病的研究上具有独特优势[11-13]。我们利用通过抑制内源性Crb2b功能从而破坏光感受器之间黏附的Tg（RH2-2：Crb2b-sf-EX/ RH2-2：GFP）pt108b转基因斑马鱼（pt108b斑马鱼）[14]，观察内源性视网膜Crb蛋白对不同种类光感受器细胞的影响，从而为RP发病机制研究提供可能的动物模型。
1 材料和方法
AB野生型斑马鱼及pt108b斑马鱼在14 h光照/10 h黑暗交替循环的恒温鱼房培育饲养。所有实验步骤均遵循匹兹堡大学动物研究使用及饲养标准。将27个月龄老年野生型斑马鱼及相同月龄pt108b斑马鱼眼球固定于4%多聚甲醛，常温过夜，梯度酒精脱水。将眼球标本和JB-4混合溶液放入JB-4包埋模具，参照JB-4包埋试剂盒（德国Polysciences公司）说明书进行包埋。超薄切片机（美国Thermo Electron公司）以3 μm厚度沿眼球腹-背及鼻-颞（前-后）两个方向进行切割成完整视网膜（图1，2）。收集通过眼球中央区域的3张连续切片，行福尔根染色[8]。光学显微镜观察（BX60，日本奥林巴斯公司），SPOT RT照相机进行完整视网膜照相，SPOT4.6软件（英国Diagnostic Instruments公司）进行分析。
图1
斑马鱼眼球延腹-背及鼻-颞（前-后）两个方向切割示意图
图2
27个月龄野生型斑马鱼眼球切割后光学显微镜像。2A. 经鼻-颞方向切割；2B. 经腹-背方向切割。可见完整视网膜 福尔根 标尺：50 μm
在三维空间中将沿两个垂直方向切割染色后的完整视网膜各经36°平均分割为鼻周边区、鼻中间区、中央区、颞中间区、颞周边区、背周边区、背中间区、腹中间区和腹周边区9个区域。光学显微镜镜下计数视杆细胞、UV视锥细胞、RGB视锥细胞3种类型光感受器细胞密度。细胞核计数区域为每个视网膜局部区域中央200 μm长度范围。分别计算野生型斑马鱼及pt108b斑马鱼3张连续切片视网膜9个区域上述3种类型光感受器细胞密度的算数平均值（n=5）。
应用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差（ ）表示，行配对t检验。α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，野生型斑马鱼3种类型光感受器细胞在中央区排列最为紧密，周边区排列最为稀疏，鼻、颞、腹、背4个区域中央-中间-周边方向细胞密度逐渐下降。视杆细胞核呈圆形，较视锥细胞核染色深，位于视网膜外核层基底部；UV视锥细胞核也呈圆形，但较视杆细胞核大且比视杆细胞染色淡，位于视杆细胞顶端部、外限制膜基底部；RGB视锥细胞核延顶端-基底方向伸长，较视杆细胞核染色淡，位于外限制膜顶端部（图3）。
图3
野生型斑马鱼视网膜组织光学显微镜像。视杆细胞核呈圆形、染色深；UV视锥细胞核呈圆形、染色淡（黑箭）；RGB视锥细胞核染色淡，位于外限制膜顶端部 福尔根 标尺：5 μm
与野生型斑马鱼比较，pt108b斑马鱼位于视网膜外核层顶部细长的RGB视锥细胞核密度明显减少，中央区和中间区RGB视锥细胞几乎完全消失（图4，5）；细胞核呈圆形、淡染并稀疏分布）（图4）。位于外核层基底部的视杆细胞核小呈圆形、染色深（图4）。
图4
pt108b斑马鱼视网膜组织光学显微镜像。UV视锥细胞核呈圆形、淡染并稀疏分布（黑箭）；视杆细胞核小呈圆形、染色深 福尔根 标尺：5 μm
图5
野生型斑马鱼和pt108b斑马鱼视网膜组织不同区域光学显微镜像。5A～5E. 野生型斑马鱼；5F～5J. pt108b斑马鱼。pt108b斑马鱼位于视网膜外核层顶部细长的RGB视锥细胞核密度较野生型斑马鱼明显减少，中央区和中间区RGB视锥细胞几乎完全消失 福尔根 标尺：10 μm
与野生型斑马鱼比较，pt108b斑马鱼视网膜中央区RGB视锥细胞密度显著下降，差异有统计学意义（P=0.7689）；UV视锥细胞密度差异无统计学意义变（P=0.000 01）；视杆细胞密度显著增加，差异有统计学意义（P=0.000 2）（图5，6）。
图6
27个月龄野生型斑马鱼和同月龄pt108b斑马鱼视网膜中央区光感受器细胞密度比较。*P＜0.005
3 讨论
由于脊椎动物视网膜体积大、形态弯曲，计数整个视网膜细胞数目较为困难，但可以通过系统抽样局部视网膜区域的细胞密度研究在老化过程中或在疾病中视网膜细胞数目的变化趋势。因此，本研究设计了一种简单实用的方法评价在视网膜9个局部区域3种类型光感受器细胞密度的变化。虽然此种采样策略并不能直接揭示视网膜细胞的总数，但能客观评价年龄、区域和遗传变异对视网膜细胞的影响。
作为一种脊椎动物的模式生物，斑马鱼在发育中与人具有很高的相似性。目前以斑马鱼模型研究视网膜的早期发育已经取得了较大进展[15]。脊椎动物中存在Crb1、Crb2、Crb3等3种内源性视网膜Crb蛋白；而由于基因组的部分重复，斑马鱼存在Crb1、Crb2a、Crb2b、Crb3a和Crb3bCrb等5种内源性视网膜Crb蛋白[9,16]。斑马鱼Crb2a、Crb2b蛋白通过直接介导内节细胞间黏附来维持规律的视锥细胞马赛克结构，而pt108b斑马鱼转基因表达的Crb2b-sf-EX通过竞争性结合到内源性视网膜Crb蛋白的细胞外区域从而破坏Crb2a/Crb2b介导的内节黏附，继而破坏规律的马赛克结构[14]。
本研究结果显示，27个月龄的老年pt108b斑马鱼视网膜中位于外核层顶端区域细长的细胞核显著减少，取代细长细胞核的是一些稀疏分布、圆形淡染的细胞核，这些细胞核有别于位于外核层基底部小而圆形、深染的视杆细胞核。导致其形态变化的原因可能是由于在老年pt108b斑马鱼中RGB视锥细胞被选择性地逐渐杀死，UV视锥细胞核迁移并占据RGB视锥细胞的位置；Crb2b-sf-EX的过度表达有选择性地杀死RGB视锥细胞，UV视锥细胞核向顶部迁移并驻留在外限制膜的顶端。本研究同时比较了Crb功能受到抑制的老年pt108b斑马鱼与同月老年野生型斑马鱼视网膜中央区不同类型光感受器细胞的密度。选择视网膜中央区作为代表区域是因为斑马鱼视网膜中央区细胞出现最早，是评估年龄对细胞密度影响的最佳区域。结果发现，pt108b斑马鱼RGB视锥细胞密度大幅度减少，UV视锥细胞密度几乎不变；视杆细胞密度大幅度增多。视杆细胞密度增多考虑是由于斑马鱼视网膜具有独特的自我修复能力[17]，视锥细胞死亡可以直接刺激与之紧密相邻的视杆细胞增生。
Crb蛋白能够影响斑马鱼视网膜不同种类光感受器细胞的密度。研究Crb功能受到抑制对斑马鱼视网膜不同种类光感受器细胞的影响为RP提供动物模型，有助于进一步揭示RP的发病机制；研究Crb2b在斑马鱼视网膜再生中的作用有望恢复人类光感受器细胞的自我修复能力，从而为RP提供有效的治疗方法。
志谢 感谢卫翔云教授提供实验指导，邹键提供技术支持
读者•作者•编者 关于中华医学会系列杂志指南共识类文章撰写与发表的推荐规范 制定和推广临床指南是当前规范医疗卫生服务的重要举措，为保证临床指南制定的科学、公正和权威，以及使临床指南适应于我国国情，从而更好地发挥指导作用，中华医学会杂志社对指南共识类文章的撰写与发表推荐规范如下。 1 指南共识类文章的撰写 指南共识类文章指具有学术权威性的指导类文章，包括指南、标准、共识、专家建议、草案等。拟在中华医学会系列杂志发表的指南共识类文章，需具备以下条件：（1）有明确的应用范围和目的；（2）制定方为该学科学术代表群体，权益相关各方均有合理参与；（3）有科学的前期研究铺垫，有循证医学证据支持，制定过程严谨规范，文字表述明确，选题有代表性；（4）内容经过充分的专家论证与临床检验，应用性强；（5）制定者与出版者具有独立性，必要时明确告知读者利益冲突情况；（6）制定者提供内容和文字经过审核的终稿。 2 指南共识类文章的发表 （1）指南共识类文章宜在符合其报道范围和读者定位的相关学术期刊上发表；（2）不同期刊可共同决定同时或联合发表某篇指南，版式可有所不同，但内容必须一致；（3）指南类文章二次发表应遵循《关于中华医学会系列杂志论文二次发表的推荐规范》。 关于缩略语使用的要求 文中尽量少用缩略语。已被公知公认的缩略语可以不加注释直接使用。例如：DNA、RNA等。不常用的、尚未被公知公认的缩略语以及原词过长、在文中多次出现者，若为中文可于文中第一次出现时写出全称，在圆括号内写出缩略语；若为外文可于文中第一次出现时写出中文全称，在圆括号内写出其外文缩略语。例如：流行性脑脊髓膜炎（流脑），高度近视圆顶状黄斑（DSM）。再次出现时方可直接使用其缩略语。不超过4个汉字的名词不宜使用缩略语，以免影响论文的可读性。外文缩略语不得拆开转行。文题中不能使用缩略语。 中华医学会杂志社
