引用本文： 周贤慧, 孟旭霞, 付浴东, 刘鹏辉, 胡迭. 不同浓度外源性轴突导向因子-1对糖尿病大鼠视网膜血管通透性的影响. 中华眼底病杂志, 2017, 33(3): 286-289. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.03.015 复制
视网膜血管通透性增加是早期糖尿病（DM）视网膜病变（DR）的显著表现；降低视网膜血管通透性，抑制新生血管形成是阻止DR的主要手段[1,2]。我们前期研究表明，100 μg/ml的轴突导向因子（netrin）-1能降低视网膜血管通透性，抑制DR进展[3]。另有研究发现，不同浓度外源性netrin-1对新生血管的形成具有双重作用[4]。视网膜闭合蛋白（occludin）是构成紧密连接的跨膜蛋白，能与内皮细胞紧密连接的复合物相互作用，发挥调控细胞外渗透的作用[5]。而血视网膜屏障的破坏是通过打开内皮细胞间的紧密连接来实现的[6]，这提示occludin可作为观察视网膜血管通透性变化的研究对象。为了寻找新的降低DR血管通透性的方法并进一步确定合适的外源性netrin-1浓度，本研究观察了不同浓度外源性netrin-1对DM大鼠视网膜occludin表达以及视网膜血管通透性的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康清洁级8～12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体重约250 g，由山东鲁抗医药公司提供。所有动物的饲养及管理均符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。
采用随机数字表法将80只大鼠随机分为正常对照组（A组）、正常＋平衡盐溶液（BSS）组（B组）、正常＋netrin-1 500 μg/ml组（C组）、DM＋BSS组（D组）、DM＋netrin-1 10 μg/ml组（E组）、DM＋netrin-1 50 μg/ml组（F组）、DM＋netrin-1 100 μg/ml组（G组）、DM＋netrin-1 500 μg/ml组（H组），每组10只。E～H组大鼠按60 mg/kg的剂量，左下腹腔注射链脲佐菌素诱导DM动物模型。以注射48 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM模型建立成功[7]。建模成功率为83.3%。剔除建模失败大鼠后，再补充大鼠进行DM建模，确保各组最终大鼠数量为10只。建模3个月后，E～H组大鼠玻璃体腔分别注射10、50、100、500 μg/ml netrin-1 5 μl。C组大鼠玻璃体腔注射500 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS。A组大鼠不做任何处理。所有注射大鼠均未出现与注射相关的高眼压及巩膜口漏等并发症。
玻璃体腔注射netrin-1后1个月，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按45 mg/kg的剂量尾静脉注射伊凡斯蓝（EB）；循环2 h，打开胸腔，左心室插管，右心耳灌注多聚甲醛2 min，速度66 ml/min。灌注结束后，迅速取出眼球，剥离视网膜，干燥后称重。每个视网膜加甲酰胺 0.3 ml，70℃水浴箱孵育18 h；4℃条件下离心45 min，取上清液100 μl。分光光度计分别测量在620、740 nm处吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，并计算其差值。差值×1000=净A值。每一样本测量3次，取平均值。视网膜EB渗出量=[视网膜EB量（mg）/视网膜干重（g）]/[单位时间内血浆EB量（mg）/血浆体积（μl）×循环时间（h）]，结果以ng/mg表示。以视网膜EB渗出量表示视网膜血管通透性。以平均积分A值表示视网膜occludin的蛋白表达量。
采用免疫组织化学染色法观察大鼠视网膜occludin的阳性染色情况。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠，摘取眼球，制备石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，5%山羊血清封闭后，一抗用1:200兔抗大鼠occludin多克隆抗体，二抗用生物素标记山羊抗兔IgG抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。光学显微镜下观察并照相，以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。采用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行分析。
采用荧光定量聚合酶链反应检测大鼠视网膜occludin mRNA表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠。视网膜称重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解视网膜，提取视网膜总RNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，用occludin引物SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法扩增相应基因。Occludin：上游引物5′-CCTGTCTATGCTCGTCATCG-3′，下游引物5′-TAGCCGTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环阈值。将A组大鼠视网膜occludin mRNA表达设定为1，计算其他各组大鼠视网膜occludin mRNA表达。
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，定量资料结果以均数±标准差（ ）表示。本研究测量数据经检验均符合正态分布，均数经Levene检验呈方差齐性。两独立样本间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；两变量间关系分析采用相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
A～C组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层及内核层（图1A，1B）。D组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于视网膜血管周围，表达量少，阳性染色浅。E～H组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于视网膜血管周围，并随着外源性netrin-1浓度的升高而增加（图1C～1G）。
与A组比较，D组大鼠视网膜occludin阳性表达（t=27.71，P=0.00）、mRNA表达（t=8.59，P=0.00）减少，差异有统计学意义。D～H组大鼠视网膜occludin阳性表达（F=146.31，P=0.00）、mRNA表达（F=16.54，P=0.00）比较，差异有统计学意义。B、C组大鼠视网膜occludin阳性表达（t=−1.13，P=0.27）、mRNA表达（t=0.93，P=0.36）比较，差异无统计学意义（表1）。相关性分析结果显示，随着外源性netrin-1浓度升高，大鼠视网膜occludin阳性表达、mRNA表达升高；大鼠视网膜occludin mRNA表达（r=0.73，P=0.00）、mRNA表达（r=0.81，P=0.00）均与外源性netrin-1浓度呈正相关。
与A组比较，D组大鼠视网膜血管通透性增加，差异有统计学意义（t=−42.72，P=0.00）。D～H组大鼠视网膜血管通透性比较，差异有统计学意义（F=67.77，P=0.00）。B、C组大鼠视网膜血管通透性比较，差异无统计学意义（t=1.04，P=0.31）（表1）。相关性分析结果显示，外源性netrin-1浓度越高，大鼠视网膜血管通透性越低，两者呈负相关（r=−0.61，P=0.00）。
表1
各组大鼠视网膜occludin阳性表达、mRNA表达及视网膜血管通透性比较（
）
3 讨论
Netrin-1能介导轴突的生长和延长。最近研究发现，netrin-1在血管的发生过程中也发挥重要作用[8,9]。Zhang等[10]和Liu等[11]发现，DM大鼠视网膜netrin-1表达增多，认为netrin-1在DR进展中起重要作用。而Tu等[12]发现，netrin-1对视网膜血管具有双重作用；浓度＜200 ng/ml的低剂量netrin-1可与CD146受体结合，促进血管生成；浓度高于2000 ng/ml的高剂量netrin-1可与非协调性分子5同源蛋白B结合，抑制血管生成。本研究结果显示，大鼠玻璃体腔注射netrin-1后视网膜occludin表达量增高，视网膜血管通透性降低，且其变化趋势与netrin-1浓度变化有关。由此我们认为，netrin-1对DM大鼠视网膜血管具有保护作用，其该作用可能是通过保护occludin，抑制其表达降低来实现的；并且，外源性netrin-1浓度越高，对视网膜血管的保护作用可能越显著。
我们前期实验研究发现，100 μg/ml外源性netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性[3]。基于此，本研究对DM大鼠玻璃体腔注射不同浓度外源性netrin-1，以探讨netrin-1作用的临界浓度。结果显示，E～H组大鼠视网膜occludin的表达逐渐增加，视网膜血管通透性逐渐下降，并且呈现浓度相关性。该结果与Tu等[12]报道结果不一致，且并未得到预期实验结果。我们分析这可能与以下几个因素有关：（1）玻璃体腔注射有效浓度误差较大。本实验研究属于体内实验，玻璃体腔注射netrin-1的量可能存在一定误差，并且体内实验相对于细胞培养敏感性差。（2）实验中玻璃体腔注射的外源性netrin-1的浓度级数不够，需要进一步扩大实验样本量。（3）DM时视网膜netrin-1表达增多[10]；而外源性加入netin-1后是否有可能引发负反馈机制尚需要进一步实验支持。
本研究结果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性，并且该作用与外源性netrin-1浓度有关，其对视网膜血管的保护作用可能是通过保护occludin来实现的。但关于netrin-1降低DM大鼠视网膜血管通透性的有效浓度范围以及netrin-1保护occludin的具体机制还不明确，有待进一步实验加以探讨分析。
志谢 感谢烟台市业达医院刘晓玲医师对文稿撰写提供的帮助
视网膜血管通透性增加是早期糖尿病（DM）视网膜病变（DR）的显著表现；降低视网膜血管通透性，抑制新生血管形成是阻止DR的主要手段[1,2]。我们前期研究表明，100 μg/ml的轴突导向因子（netrin）-1能降低视网膜血管通透性，抑制DR进展[3]。另有研究发现，不同浓度外源性netrin-1对新生血管的形成具有双重作用[4]。视网膜闭合蛋白（occludin）是构成紧密连接的跨膜蛋白，能与内皮细胞紧密连接的复合物相互作用，发挥调控细胞外渗透的作用[5]。而血视网膜屏障的破坏是通过打开内皮细胞间的紧密连接来实现的[6]，这提示occludin可作为观察视网膜血管通透性变化的研究对象。为了寻找新的降低DR血管通透性的方法并进一步确定合适的外源性netrin-1浓度，本研究观察了不同浓度外源性netrin-1对DM大鼠视网膜occludin表达以及视网膜血管通透性的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康清洁级8～12周龄雄性Sprague-Dawley大鼠80只，体重约250 g，由山东鲁抗医药公司提供。所有动物的饲养及管理均符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。
采用随机数字表法将80只大鼠随机分为正常对照组（A组）、正常＋平衡盐溶液（BSS）组（B组）、正常＋netrin-1 500 μg/ml组（C组）、DM＋BSS组（D组）、DM＋netrin-1 10 μg/ml组（E组）、DM＋netrin-1 50 μg/ml组（F组）、DM＋netrin-1 100 μg/ml组（G组）、DM＋netrin-1 500 μg/ml组（H组），每组10只。E～H组大鼠按60 mg/kg的剂量，左下腹腔注射链脲佐菌素诱导DM动物模型。以注射48 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM模型建立成功[7]。建模成功率为83.3%。剔除建模失败大鼠后，再补充大鼠进行DM建模，确保各组最终大鼠数量为10只。建模3个月后，E～H组大鼠玻璃体腔分别注射10、50、100、500 μg/ml netrin-1 5 μl。C组大鼠玻璃体腔注射500 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS。A组大鼠不做任何处理。所有注射大鼠均未出现与注射相关的高眼压及巩膜口漏等并发症。
玻璃体腔注射netrin-1后1个月，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，按45 mg/kg的剂量尾静脉注射伊凡斯蓝（EB）；循环2 h，打开胸腔，左心室插管，右心耳灌注多聚甲醛2 min，速度66 ml/min。灌注结束后，迅速取出眼球，剥离视网膜，干燥后称重。每个视网膜加甲酰胺 0.3 ml，70℃水浴箱孵育18 h；4℃条件下离心45 min，取上清液100 μl。分光光度计分别测量在620、740 nm处吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，并计算其差值。差值×1000=净A值。每一样本测量3次，取平均值。视网膜EB渗出量=[视网膜EB量（mg）/视网膜干重（g）]/[单位时间内血浆EB量（mg）/血浆体积（μl）×循环时间（h）]，结果以ng/mg表示。以视网膜EB渗出量表示视网膜血管通透性。以平均积分A值表示视网膜occludin的蛋白表达量。
采用免疫组织化学染色法观察大鼠视网膜occludin的阳性染色情况。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠，摘取眼球，制备石蜡切片。石蜡切片脱蜡至水，5%山羊血清封闭后，一抗用1:200兔抗大鼠occludin多克隆抗体，二抗用生物素标记山羊抗兔IgG抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。光学显微镜下观察并照相，以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。采用Image Pro Plus 6.0软件对图像进行分析。
采用荧光定量聚合酶链反应检测大鼠视网膜occludin mRNA表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠。视网膜称重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解视网膜，提取视网膜总RNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照，用occludin引物SYBR Green Ⅰ嵌合荧光法扩增相应基因。Occludin：上游引物5′-CCTGTCTATGCTCGTCATCG-3′，下游引物5′-TAGCCGTAACCGTAGCCGTA-3′；β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环阈值。将A组大鼠视网膜occludin mRNA表达设定为1，计算其他各组大鼠视网膜occludin mRNA表达。
采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，定量资料结果以均数±标准差（ ）表示。本研究测量数据经检验均符合正态分布，均数经Levene检验呈方差齐性。两独立样本间比较采用独立样本t 检验；多组间比较采用单因素方差分析；两变量间关系分析采用相关性分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
A～C组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层及内核层（图1A，1B）。D组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于视网膜血管周围，表达量少，阳性染色浅。E～H组大鼠视网膜occludin阳性表达主要位于视网膜血管周围，并随着外源性netrin-1浓度的升高而增加（图1C～1G）。
与A组比较，D组大鼠视网膜occludin阳性表达（t=27.71，P=0.00）、mRNA表达（t=8.59，P=0.00）减少，差异有统计学意义。D～H组大鼠视网膜occludin阳性表达（F=146.31，P=0.00）、mRNA表达（F=16.54，P=0.00）比较，差异有统计学意义。B、C组大鼠视网膜occludin阳性表达（t=−1.13，P=0.27）、mRNA表达（t=0.93，P=0.36）比较，差异无统计学意义（表1）。相关性分析结果显示，随着外源性netrin-1浓度升高，大鼠视网膜occludin阳性表达、mRNA表达升高；大鼠视网膜occludin mRNA表达（r=0.73，P=0.00）、mRNA表达（r=0.81，P=0.00）均与外源性netrin-1浓度呈正相关。
与A组比较，D组大鼠视网膜血管通透性增加，差异有统计学意义（t=−42.72，P=0.00）。D～H组大鼠视网膜血管通透性比较，差异有统计学意义（F=67.77，P=0.00）。B、C组大鼠视网膜血管通透性比较，差异无统计学意义（t=1.04，P=0.31）（表1）。相关性分析结果显示，外源性netrin-1浓度越高，大鼠视网膜血管通透性越低，两者呈负相关（r=−0.61，P=0.00）。
表1
各组大鼠视网膜occludin阳性表达、mRNA表达及视网膜血管通透性比较（
）
3 讨论
Netrin-1能介导轴突的生长和延长。最近研究发现，netrin-1在血管的发生过程中也发挥重要作用[8,9]。Zhang等[10]和Liu等[11]发现，DM大鼠视网膜netrin-1表达增多，认为netrin-1在DR进展中起重要作用。而Tu等[12]发现，netrin-1对视网膜血管具有双重作用；浓度＜200 ng/ml的低剂量netrin-1可与CD146受体结合，促进血管生成；浓度高于2000 ng/ml的高剂量netrin-1可与非协调性分子5同源蛋白B结合，抑制血管生成。本研究结果显示，大鼠玻璃体腔注射netrin-1后视网膜occludin表达量增高，视网膜血管通透性降低，且其变化趋势与netrin-1浓度变化有关。由此我们认为，netrin-1对DM大鼠视网膜血管具有保护作用，其该作用可能是通过保护occludin，抑制其表达降低来实现的；并且，外源性netrin-1浓度越高，对视网膜血管的保护作用可能越显著。
我们前期实验研究发现，100 μg/ml外源性netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性[3]。基于此，本研究对DM大鼠玻璃体腔注射不同浓度外源性netrin-1，以探讨netrin-1作用的临界浓度。结果显示，E～H组大鼠视网膜occludin的表达逐渐增加，视网膜血管通透性逐渐下降，并且呈现浓度相关性。该结果与Tu等[12]报道结果不一致，且并未得到预期实验结果。我们分析这可能与以下几个因素有关：（1）玻璃体腔注射有效浓度误差较大。本实验研究属于体内实验，玻璃体腔注射netrin-1的量可能存在一定误差，并且体内实验相对于细胞培养敏感性差。（2）实验中玻璃体腔注射的外源性netrin-1的浓度级数不够，需要进一步扩大实验样本量。（3）DM时视网膜netrin-1表达增多[10]；而外源性加入netin-1后是否有可能引发负反馈机制尚需要进一步实验支持。
本研究结果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性，并且该作用与外源性netrin-1浓度有关，其对视网膜血管的保护作用可能是通过保护occludin来实现的。但关于netrin-1降低DM大鼠视网膜血管通透性的有效浓度范围以及netrin-1保护occludin的具体机制还不明确，有待进一步实验加以探讨分析。
志谢 感谢烟台市业达医院刘晓玲医师对文稿撰写提供的帮助
