引用本文： 陈璇, 邵珺, 夏大云, 王如兴, 姚勇. 二十二碳六烯酸对视网膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾离子通道的激活作用. 中华眼底病杂志, 2017, 33(3): 295-297. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.03.017 复制
二十二碳六烯酸（DHA）是人体必需脂肪酸n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）的一种，同时也是大脑和视网膜的重要构成成分[1]。n-3PUFA不仅可以抑制血小板聚集、降低血脂及直接扩张血管，亦有改善胰岛素抵抗以及抑制新生血管和保护视神经功能的作用[2-8]。大电导钙激活钾离子（BK）通道广泛分布于人体组织和细胞，参与血管张力调节、神经兴奋和神经递质释放等多种重要生理活动，不仅参与细胞膜电位的形成，而且可以维持血管平滑肌细胞舒缩功能的动态平衡[9]。我们推测，DHA对视网膜动脉的保护作用可能与激活视网膜动脉平滑肌细胞（RASMCs）BK通道有关。为了验证这一观点，我们观察了不同浓度DHA对RASMCs的BK通道总开放概率（NP0）及β1亚基的相对蛋白表达量。现将结果报道如下。
1 材料和方法
实验室自存RASMCs，经形态学观察确认细胞呈长梭形或椭圆形，免疫组织化学染色呈阳性[10]。澳洲胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，美国Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（凯基生物科技发展有限公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco公司），DHA（美国Sigma公司）。
RASMCs置于含10% FBS的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中传代培养，1.25 g/L 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化。取第6～8代细胞用于膜片钳实验。采用Axopatch 200B膜片钳放大器和pCLAMP 10.2软件记录BK单通道电流。以膜内向外型模式记录BK单通道电流。输出信号经8极Bessel滤波器滤波，采样频率20 kHz，滤波频率5 kHz，电极电阻5～10 MΩ。电极内液：KCl 140.0 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 10.0 mmol/L、乙二醇双四乙酸（EGTA）1.0 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L，pH 7.4；电极外液：KCl 140.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、EGTA 1.0 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L，pH 7.35。在电极外液钙离子浓度1 μmol/L，刺激电位60 mV，DHA浓度0.0、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0 μmol/L条件下，分别记录RAMSCs的BK通道电流，计算NP0。NP0=∑（Onn）/T[11]。其中，N为通道的开放数量，P0代表平均开放概率，T代表记录持续时间，On代表每个开放水平所需时间。
采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测RASMCs的BK通道中β1亚基的相对蛋白表达量。待细胞长至80%～90%融合时，1.25 g/L 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化。按细胞密度2×105个/孔接种至6孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，更换无FBS培养基饥饿培养12 h。按0.0、1.0、5.0 μmol/L不同浓度的DHA干预RASMCs，并以此分为对照组、低剂量组及高剂量组，每组设2个复孔，37℃、5%CO2培养箱中培养36 h后弃去培养液。用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，加入RIPA裂解液，在冰上充分裂解，以离心半径3 cm、转速12 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。等量蛋白行12%（β1亚基，相对分子质量约28×103）丙烯酰胺凝胶电泳，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，抗BK通道β亚基抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h。洗膜后再用超敏增强化学发光试剂盒发光采集图像，采用Image J软件对图像进行分析处理。β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。
采用SPSS 22.0统计软件行统计学分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示。不同浓度DHA作用下RASMCs的BK通道NP0的变化以及对照组、低剂量组和高剂量组BK通道β1亚基相对蛋白表达量比较均采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
DHA浓度为0.0、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0 μmol/L时，RASMCs的BK通道NP0分别为0.044 4±0.001 2、0.081 2±0.004 2、0.209 0±0.006 1、0.310 5±0.005 3、0.465 0±0.007 8、0.497 7±0.014 5。随DHA浓度的升高，BK通道NP0增加。不同DHA浓度作用下RASMCs的BK通道NP0比较，差异有统计学意义（F=2.621，P＜0.05）（图1）。
图1
不同DHA浓度下BK通道电流图。O:通道开放；C:通道关闭
Western blot检测结果显示，对照组、低剂量组、高剂量组RASMCs的BK通道中β1亚基相对蛋白表达量比较，差异无统计学意义（F=11.657，P＞0.05）（图2）。
图2
3组RASMCs的BK通道β1亚基相对蛋白表达量比较
3 讨论
BK通道由孔道形成亚基α与调节亚基β组成，一个α亚单位结合一个β亚单位，形成四聚体[12]。BK通道主要受细胞跨膜电位及细胞内钙离子浓度的影响，正常情况下BK通道激活后钾离子外流，产生超极化，抑制电压依赖性钙离子通道开放，继而钙离子内流减少，引起血管平滑肌舒张，故BK通道功能主要为参与血管的舒张[13]。本研究采用单通道膜片钳技术研究不同浓度DHA对正常RASMCs的BK通道NP0的影响。结果表明，随着DHA浓度的增高，BK通道的NP0增高。这说明DHA可激活BK通道。因为单通道膜片钳技术是在无细胞内环境的条件下记录BK通道开放电流的，故该实验结果表明DHA激活BK通道的机制可能是DHA与BK通道作用后直接激活所致，但其作用机制尚不清楚。由于BK通道具有电压依赖及钙离子依赖性，因此我们推测DHA可能通过增加钙离子敏感性激活BK通道，其机制有待进一步研究。
BK通道亚单位尤其是调节亚基β1对BK通道的动力学和钙离子敏感性起重要调节作用[14,15]。因此，本研究观察了不同浓度DHA对RASMCs的BK通道β1亚基表达的影响。结果表明，不同浓度DHA对RASMCs的BK通道β1亚基蛋白表达没有影响。出现上述阴性结果的原因可能与以下几个方面有关：（1）本研究设置的DHA浓度是根据美国心脏协会建议成人每日服用1 g左右n-3 PUFA推测出来的，用于细胞实验有一定不确定性；（2）DHA对BK通道的激活作用可能不通过影响其亚单位表达来实现，而是直接作用或激活其他途径等[16]；（3）DHA对BK通道的激活作用可能本身具有瞬效性，并不具有长期的作用能力。
本研究结果表明，DHA可直接激活RASMCs的BK通道，增加视网膜动脉BK通道的NP0，但DHA对视网膜动脉BK通道亚单位表达无明显影响。提示DHA可能并非通过影响BK通道亚单位的表达激活BK通道，而是通过与BK通道作用后直接激活，从而扩张视网膜动脉，对视网膜动脉起保护作用。但本研究也存在一定局限性。首先，本研究只基于细胞层面，未能构建动物灌胃模型去探讨DHA对BK通道的激活是否具有长效作用，并且人为构建的细胞环境与动物体内实际内环境有一定差别。其次，膜片钳技术主要分为单通道及全细胞实验技术，本研究只采用了单通道膜片钳技术探讨了DHA对RASMCs细胞膜上BK通道的直接作用，而未行全细胞膜片钳技术研究两者对完整细胞膜上BK通道电流密度的影响。在接下来的研究中，我们将继续完善细胞实验，测定DHA对BK通道亚单位基因表达的影响；同时进行膜片钳全细胞实验测定BK通道电流密度的改变。更重要的是构建动物灌胃模型，分离消化RASMCs，并同时进行上述研究获得更为全面稳定的结果，进而阐明DHA对视网膜动脉BK通道的作用机制，为未来研究各种病理状态下视网膜动脉BK通道变化提供实验基础。
二十二碳六烯酸（DHA）是人体必需脂肪酸n-3多不饱和脂肪酸（n-3PUFA）的一种，同时也是大脑和视网膜的重要构成成分[1]。n-3PUFA不仅可以抑制血小板聚集、降低血脂及直接扩张血管，亦有改善胰岛素抵抗以及抑制新生血管和保护视神经功能的作用[2-8]。大电导钙激活钾离子（BK）通道广泛分布于人体组织和细胞，参与血管张力调节、神经兴奋和神经递质释放等多种重要生理活动，不仅参与细胞膜电位的形成，而且可以维持血管平滑肌细胞舒缩功能的动态平衡[9]。我们推测，DHA对视网膜动脉的保护作用可能与激活视网膜动脉平滑肌细胞（RASMCs）BK通道有关。为了验证这一观点，我们观察了不同浓度DHA对RASMCs的BK通道总开放概率（NP0）及β1亚基的相对蛋白表达量。现将结果报道如下。
1 材料和方法
实验室自存RASMCs，经形态学观察确认细胞呈长梭形或椭圆形，免疫组织化学染色呈阳性[10]。澳洲胎牛血清（FBS，美国Gibco公司），Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，美国Hyclone公司），0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化液（凯基生物科技发展有限公司），二甲基亚砜（DMSO，美国Amresco公司），DHA（美国Sigma公司）。
RASMCs置于含10% FBS的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2培养箱中传代培养，1.25 g/L 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化。取第6～8代细胞用于膜片钳实验。采用Axopatch 200B膜片钳放大器和pCLAMP 10.2软件记录BK单通道电流。以膜内向外型模式记录BK单通道电流。输出信号经8极Bessel滤波器滤波，采样频率20 kHz，滤波频率5 kHz，电极电阻5～10 MΩ。电极内液：KCl 140.0 mmol/L、4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES） 10.0 mmol/L、乙二醇双四乙酸（EGTA）1.0 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L、CaCl2 1.0 mmol/L，pH 7.4；电极外液：KCl 140.0 mmol/L、HEPES 10.0 mmol/L、EGTA 1.0 mmol/L、MgCl2 1.0 mmol/L，pH 7.35。在电极外液钙离子浓度1 μmol/L，刺激电位60 mV，DHA浓度0.0、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0 μmol/L条件下，分别记录RAMSCs的BK通道电流，计算NP0。NP0=∑（Onn）/T[11]。其中，N为通道的开放数量，P0代表平均开放概率，T代表记录持续时间，On代表每个开放水平所需时间。
采用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测RASMCs的BK通道中β1亚基的相对蛋白表达量。待细胞长至80%～90%融合时，1.25 g/L 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化。按细胞密度2×105个/孔接种至6孔板，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，更换无FBS培养基饥饿培养12 h。按0.0、1.0、5.0 μmol/L不同浓度的DHA干预RASMCs，并以此分为对照组、低剂量组及高剂量组，每组设2个复孔，37℃、5%CO2培养箱中培养36 h后弃去培养液。用预冷的磷酸盐缓冲液冲洗细胞3次，加入RIPA裂解液，在冰上充分裂解，以离心半径3 cm、转速12 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度。等量蛋白行12%（β1亚基，相对分子质量约28×103）丙烯酰胺凝胶电泳，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，抗BK通道β亚基抗体4 ℃孵育过夜，洗膜，辣根过氧化物酶标记二抗室温孵育2 h。洗膜后再用超敏增强化学发光试剂盒发光采集图像，采用Image J软件对图像进行分析处理。β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。
采用SPSS 22.0统计软件行统计学分析。计量资料用均数±标准差（ ）表示。不同浓度DHA作用下RASMCs的BK通道NP0的变化以及对照组、低剂量组和高剂量组BK通道β1亚基相对蛋白表达量比较均采用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
DHA浓度为0.0、1.0、3.0、5.0、7.5、10.0 μmol/L时，RASMCs的BK通道NP0分别为0.044 4±0.001 2、0.081 2±0.004 2、0.209 0±0.006 1、0.310 5±0.005 3、0.465 0±0.007 8、0.497 7±0.014 5。随DHA浓度的升高，BK通道NP0增加。不同DHA浓度作用下RASMCs的BK通道NP0比较，差异有统计学意义（F=2.621，P＜0.05）（图1）。
图1
不同DHA浓度下BK通道电流图。O:通道开放；C:通道关闭
Western blot检测结果显示，对照组、低剂量组、高剂量组RASMCs的BK通道中β1亚基相对蛋白表达量比较，差异无统计学意义（F=11.657，P＞0.05）（图2）。
图2
3组RASMCs的BK通道β1亚基相对蛋白表达量比较
3 讨论
BK通道由孔道形成亚基α与调节亚基β组成，一个α亚单位结合一个β亚单位，形成四聚体[12]。BK通道主要受细胞跨膜电位及细胞内钙离子浓度的影响，正常情况下BK通道激活后钾离子外流，产生超极化，抑制电压依赖性钙离子通道开放，继而钙离子内流减少，引起血管平滑肌舒张，故BK通道功能主要为参与血管的舒张[13]。本研究采用单通道膜片钳技术研究不同浓度DHA对正常RASMCs的BK通道NP0的影响。结果表明，随着DHA浓度的增高，BK通道的NP0增高。这说明DHA可激活BK通道。因为单通道膜片钳技术是在无细胞内环境的条件下记录BK通道开放电流的，故该实验结果表明DHA激活BK通道的机制可能是DHA与BK通道作用后直接激活所致，但其作用机制尚不清楚。由于BK通道具有电压依赖及钙离子依赖性，因此我们推测DHA可能通过增加钙离子敏感性激活BK通道，其机制有待进一步研究。
BK通道亚单位尤其是调节亚基β1对BK通道的动力学和钙离子敏感性起重要调节作用[14,15]。因此，本研究观察了不同浓度DHA对RASMCs的BK通道β1亚基表达的影响。结果表明，不同浓度DHA对RASMCs的BK通道β1亚基蛋白表达没有影响。出现上述阴性结果的原因可能与以下几个方面有关：（1）本研究设置的DHA浓度是根据美国心脏协会建议成人每日服用1 g左右n-3 PUFA推测出来的，用于细胞实验有一定不确定性；（2）DHA对BK通道的激活作用可能不通过影响其亚单位表达来实现，而是直接作用或激活其他途径等[16]；（3）DHA对BK通道的激活作用可能本身具有瞬效性，并不具有长期的作用能力。
本研究结果表明，DHA可直接激活RASMCs的BK通道，增加视网膜动脉BK通道的NP0，但DHA对视网膜动脉BK通道亚单位表达无明显影响。提示DHA可能并非通过影响BK通道亚单位的表达激活BK通道，而是通过与BK通道作用后直接激活，从而扩张视网膜动脉，对视网膜动脉起保护作用。但本研究也存在一定局限性。首先，本研究只基于细胞层面，未能构建动物灌胃模型去探讨DHA对BK通道的激活是否具有长效作用，并且人为构建的细胞环境与动物体内实际内环境有一定差别。其次，膜片钳技术主要分为单通道及全细胞实验技术，本研究只采用了单通道膜片钳技术探讨了DHA对RASMCs细胞膜上BK通道的直接作用，而未行全细胞膜片钳技术研究两者对完整细胞膜上BK通道电流密度的影响。在接下来的研究中，我们将继续完善细胞实验，测定DHA对BK通道亚单位基因表达的影响；同时进行膜片钳全细胞实验测定BK通道电流密度的改变。更重要的是构建动物灌胃模型，分离消化RASMCs，并同时进行上述研究获得更为全面稳定的结果，进而阐明DHA对视网膜动脉BK通道的作用机制，为未来研究各种病理状态下视网膜动脉BK通道变化提供实验基础。
