引用本文： 马映雪, 陈松, 何广辉, 杨婧, 陈莉, 姜鉴洪, 宋建. 蓝光诱导人视网膜色素上皮细胞分泌外泌体与核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白炎性体的相关性研究. 中华眼底病杂志, 2017, 33(5): 498-502. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.014 复制
老年性黄斑变性（AMD）病理损害累及视网膜色素上皮（RPE）细胞和Bruch膜，引起光感受器变性；多种免疫活化和调节异常均参与了AMD发病，其中炎性体是近年研究热点。Tseng等[1]发现AMD患眼RPE细胞炎性体激活，RPE细胞中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白（NLRP3）、白细胞介素（IL）-18和激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）水平上调。外泌体（exosomes）是一种活细胞分泌的直径在50～200 nm之间的具有脂质双分子层结构的小囊泡，囊泡内含有的蛋白组成与其分泌的细胞具有相关性[2]。研究结果表明，外泌体可携带核酸、蛋白质等生物活性小分子进行细胞间的信号传递；具有免疫活化和抑制功能，参与维持机体的免疫平衡[3, 4]。本研究通过蓝光诱导建立人RPE细胞光损伤模型模仿AMD损伤的RPE，观察光氧化损伤RPE细胞分泌的外泌体与NLRP3炎性体的相关性，旨为AMD发病机制的研究提供新思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
取对数生长期人RPE细胞株（ARPE-19）贴壁细胞分为实验组和对照组。实验组细胞采用4个波长为（448.0±24.0）nm的蓝光发光二极管灯，距离细胞35 cm连续照射6 h；对照组细胞常规培养。光学显微镜观察细胞形态；噻唑蓝（MTT）检测两组细胞增生活力，以对照组细胞增生率为1。12 h后收集培养液，分级低温超速离心获取外泌体。将培养液放入普通离心管，4 ℃条件下300×g离心10 min，去沉淀后2000×g离心20 min，去沉淀后再次10 000×g离心30 min，去沉淀后将得到的浓缩液移至Beckman离心管中，4 ℃条件下100 000×g离心70 min，收集沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，再次100 000×g离心70 min，得到的外泌体浓缩液以20 μl PBS重悬，−80 ℃冷藏备用。
将外泌体样本1∶10稀释，铜网蘸取少量稀释后样品，将铜网放入3%磷钨酸溶液中染色5 min加深背景，透射电子显微镜80 kV下观察并拍摄相片。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63和NLRP3炎性体相关细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1蛋白水平表达。外泌体悬液100 μl加20 μl苯甲基磺酰氟裂解液，二喹啉甲酸蛋白定量，加样前煮沸变性5 min；加样后聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶1000鼠抗人一抗CD63、IL-1β、IL-18和caspase-1，4 ℃过夜；1倍硬酯酸铅（PBST）浸洗，加入稀释至1∶5000的二抗，室温下摇床1 h，PBST浸洗3次后应用超敏化学发光试剂盒显色2 min，X光显影后扫描分析。
将浓度为200 μg/ml的实验组、对照组细胞外泌体分别作用于12孔板中平铺的正常RPE细胞，据此分为蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组。37 ℃、5%CO2培养24 h，培养期间不更换培养液；24 h后MTT检测两组细胞增生活力。以正常细胞外泌体+对照组细胞增生率为1。
Western blot检测两组RPE细胞NLRP3炎性体相关细胞因子IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达。检测方法同前。免疫荧光法检测两组RPE细胞外沁体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达。将外泌体作用后的两组细胞平铺在24孔板上，浓度约5×104/ml，4%多聚甲醛固定爬片后加入0.5%Triton-100避光处理 20 min；PBS浸洗3次，加入1 ml 3%的牛血清白蛋白室温封闭1 h；加足量稀释一抗（1∶100），湿盒中4 ℃ 过夜；PBST浸洗3次后滴加荧光二抗（1∶100），避光室温孵育1 h，再次PBST浸洗3次，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核后PBST浸洗4次，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。应用Image Pro Plus软件将细胞荧光亮度转化为灰度值进行量化分析。
实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组RPE细胞内NLRP3 mRNA的表达。按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，−80 ℃保存。运用Primer Premier 5.0软件设计上下游引物。NLRP3:上游引物 5′-GGCATATCACAGTGGGATTC-3′，下游引物5′-GATCTTCGCTGCGATCAAC-3′。甘油醛脱氢酶（GAPDH）：上游引物5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，下游引物:5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。反应条件：94 ℃，30 s；50～60 ℃，30 s；72 ℃，60 s。变性、退火、延伸重复35～40个循环。将得到的各组循环阈值（CT）数据以GAPDH为内参，采用2−△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。
采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差（
）表示。两组细胞免疫荧光检测结果行方差齐性检验，MTT检测结果采用配对t检验，其余两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，对照组细胞呈单层生长，梭形或多角形，融合后呈铺路石样生长；实验组细胞肿胀，细胞胞体失去多角形态，部分胞体变长，呈成纤维细胞形态（图1）。MTT检测结果显示，实验组细胞增生率为66.0%，低于对照组细胞，差异有统计学意义（t=3.92，P＜0.050）。
图1
培养的RPE细胞光学显微镜像。1A. 正常组，细胞呈单层生长，梭形或多角形，融合后呈铺路石样生长；1B. 实验组，细胞肿胀，细胞胞体失去多角形态，部分胞体变长，呈成纤维细胞形态 ×400
透射电子显微镜观察发现，实验组、对照组细胞外泌体形态无明显差异；直径约50～200 nm，呈双凹托盘状，有立体感，表面膜结构脂质双分子可见（图2）。
图2
外泌体透射电子显微镜像。2A. 实验组；2B. 对照组。两组细胞外泌体形态无明显差异；直径约50～200 nm，呈双凹托盘状，有立体感，表面膜结构脂质双分子可见 磷钨酸 标尺：2A. 400 nm；2B. 100 nm
Western blot检测发现，实验组、对照组细胞外泌体均表达CD63。两组细胞外泌体中IL-1β（t=18.04）、IL-18（t=12.55）、caspase-1（t=14.70）蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图3）。
图3
实验组、对照组细胞外泌体中IL-1β、1L-18、caspase-1蛋白表达比较。3A. 电泳图，1、2分别为对照组、实验组；3B. 统计结果。*与对照组比较，P＜0.050
MTT检测发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞增生率为76.5%，低于正常细胞外泌体+对照组，差异有统计学意义（t=3.49，P＜0.050）。
Western blot检测发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组细胞外泌体中IL-1β（t=18.59）、IL-18（t=23.95）、caspase-1（t=35.27）蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图4）。
图4
蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组细胞外泌体中IL-1β、1L-18、caspase-1蛋白表达比较。4A. 电泳图，1、2分别为正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组；4B. 统计结果。*与正常细胞外泌体+对照组比较，P＜0.050
荧光显微镜观察发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1的表达高于正常细胞外泌体+对照组（图5）；两组细胞外泌体中IL-18（t=6.11）、IL-1β（t=6.30）、caspase-1（t=12.77）蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图6）。
图5
正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达荧光显微镜像。5A～5C、5D～5F.分别为正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1的表达。蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1表达明显强于正常细胞外泌体+对照组 DAPI ×100
图6
正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达量比较。*与正常细胞外泌体+对照组比较，P＜0.050
RT-PCR检测发现，实验组、对照组细胞NLRP3 mRNA相对表达量分别为1.000±0.069、0.200±0.010；实验组细胞NLRP3 mRNA相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（t=12.20，P＜0.001）。
3 讨论
光损伤机制在AMD发病中被广泛研究并证实，蓝光暴露与AMD之间存在相关性[5, 6]；波长440 nm蓝光可诱导体外培养的RPE细胞通过氧化应激反应或光氧化损伤发生细胞凋亡及坏死[7]。蔡善君等[8]认为，阈值上光照强度下蓝光照射6 h，光照后12 h为诱导体外培养人RPE细胞凋亡的最佳条件。本研究选择4组蓝光LED灯距离细胞35 cm处照射6 h后培养12 h作为实验组，辐射强度约为3.2 mW/cm2。光照后RPE细胞肿胀，失去多角形态，细胞体变长，且增生活力明显减弱，提示体外培养的ARPE-19细胞系在蓝光照射后发生了光氧化损伤作用。可应用光氧化损伤的RPE细胞近似模拟早期AMD的RPE细胞。
外泌体是一类直径在50～200 nm的具有脂质双分子层结构的小囊泡，由各种活细胞分泌，其蛋白组成与其分泌的细胞具有相关性，外泌体可携带核酸、蛋白质等生物活性小分子进行细胞间的信号传递，且具有免疫活化、免疫抑制功能，参与机体免疫平衡的维持[3, 4]。近年来外泌体与AMD发病之间的关系受到广泛关注。Biasutto等[9]在ARPE-19细胞分泌的外泌体中检测到13种蛋白质、38种磷酸化蛋白和3种裂解蛋白质，这些蛋白同时也在AMD患者玻璃体中被检测到，提示视网膜细胞通过外泌体向玻璃体腔分泌细胞内、非水溶性、受体蛋白质。此外，Wang等[10]研究发现，玻璃膜疣含有外泌体的标记物，而且这些标记物同样存在于老龄鼠Bruch膜中。在应激状态下，RPE细胞释放外泌体，其表面可包被补体，并与补体因子H结合，这一过程也可能参与了AMD发病。本研究结果发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞中IL-1β、IL-18、caspase-1相对表达量均较正常细胞外泌体+对照组升高，提示RPE细胞受到光氧化损伤后分泌含有致病信息的外泌体，并且通过出胞作用分布在细胞外环境中，即这些致病信息可能通过人体内环境分布和扩散，在AMD发病过程中发挥了重要作用。
近年来NLRP3炎性体在AMD中发挥的作用被广泛研究，尤其玻璃膜疣中的补体调节成分、β淀粉样蛋白及氧化副产物对NLRP3炎性体激活作用[11-13]。作为先天免疫的一部分，补体系统首先对组织损伤做出反应并且能够被细胞凋亡激活[14]。Doyle等[15]研究发现，玻璃膜疣成分可以激活粘多糖预刺激过的巨噬细胞；另外，C1q作用于粘多糖预刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞和单核细胞系真核细胞后，可激发caspase-1切割和IL-1β分泌增多，提示补体成分C1q在激活NLRP3炎性体中的重要作用；另有研究结果则证明了其他补体成分如C3a和膜攻击复合物对于激活NLRP3炎性体的重要作用[16-18]。随着年龄的增长，RPE细胞对光感受器外节的吞噬能力下降，脂质过氧化物和脂褐素沉积在RPE细胞，因此有学者认为脂褐质在RPE细胞的沉积导致了溶酶体损伤并直接激活NLRP3炎性体[1, 19, 20]。其他脂质过氧化产物和成分如4-羟基壬烯醛和羟乙基吡咯，也能够刺激NLRP3炎性体的激活[15, 21]。Piippo等[22]发现，细胞分解自噬功能衰退后，不仅导致细胞内蛋白质聚积和氧化应激，还可以活化NLRP3炎性体，增加有生物活性的IL-1β产生，NLRP3炎性体的静止则将大大减少caspase-1的激活和炎症因子IL-18、IL-1β的释放。上述所有因素，包括脂质沉积、慢性促炎症反应、氧化应激都能诱导持续的RPE细胞应激反应，损伤线粒体并促进NLRP3炎性体通路的激活。本研究结果显示，蓝光诱导后RPE细胞分泌的外泌体中IL-18、IL-1β以及caspase-1蛋白表达明显增多，证明光氧化损伤RPE细胞后确能激活NLRP3炎性体，且外泌体很可能作为某种媒介在NLRP3的激活中发挥了作用。
本研究将ARPE-19细胞系作为研究对象，并采用蓝光诱导造模，成功提取了蓝光模型ARPE-19分泌的外泌体，并将其作用于正常RPE细胞，检测到实验组细胞分泌的外泌体上调了正常RPE细胞内NLRP3相关细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1以及NLRP3 mRNA水平，提示外泌体能够在蛋白水平和基因水平上影响RPE细胞的生理活动。而其具体机制途径及这一过程是否在AMD的发病中发挥作用，尚且需要进一步的研究。
老年性黄斑变性（AMD）病理损害累及视网膜色素上皮（RPE）细胞和Bruch膜，引起光感受器变性；多种免疫活化和调节异常均参与了AMD发病，其中炎性体是近年研究热点。Tseng等[1]发现AMD患眼RPE细胞炎性体激活，RPE细胞中核苷酸结合寡聚化结构样受体蛋白（NLRP3）、白细胞介素（IL）-18和激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）水平上调。外泌体（exosomes）是一种活细胞分泌的直径在50～200 nm之间的具有脂质双分子层结构的小囊泡，囊泡内含有的蛋白组成与其分泌的细胞具有相关性[2]。研究结果表明，外泌体可携带核酸、蛋白质等生物活性小分子进行细胞间的信号传递；具有免疫活化和抑制功能，参与维持机体的免疫平衡[3, 4]。本研究通过蓝光诱导建立人RPE细胞光损伤模型模仿AMD损伤的RPE，观察光氧化损伤RPE细胞分泌的外泌体与NLRP3炎性体的相关性，旨为AMD发病机制的研究提供新思路。现将结果报道如下。
1 材料和方法
取对数生长期人RPE细胞株（ARPE-19）贴壁细胞分为实验组和对照组。实验组细胞采用4个波长为（448.0±24.0）nm的蓝光发光二极管灯，距离细胞35 cm连续照射6 h；对照组细胞常规培养。光学显微镜观察细胞形态；噻唑蓝（MTT）检测两组细胞增生活力，以对照组细胞增生率为1。12 h后收集培养液，分级低温超速离心获取外泌体。将培养液放入普通离心管，4 ℃条件下300×g离心10 min，去沉淀后2000×g离心20 min，去沉淀后再次10 000×g离心30 min，去沉淀后将得到的浓缩液移至Beckman离心管中，4 ℃条件下100 000×g离心70 min，收集沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后，再次100 000×g离心70 min，得到的外泌体浓缩液以20 μl PBS重悬，−80 ℃冷藏备用。
将外泌体样本1∶10稀释，铜网蘸取少量稀释后样品，将铜网放入3%磷钨酸溶液中染色5 min加深背景，透射电子显微镜80 kV下观察并拍摄相片。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测外泌体表面特异性标志蛋白CD63和NLRP3炎性体相关细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1蛋白水平表达。外泌体悬液100 μl加20 μl苯甲基磺酰氟裂解液，二喹啉甲酸蛋白定量，加样前煮沸变性5 min；加样后聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移至聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入1∶1000鼠抗人一抗CD63、IL-1β、IL-18和caspase-1，4 ℃过夜；1倍硬酯酸铅（PBST）浸洗，加入稀释至1∶5000的二抗，室温下摇床1 h，PBST浸洗3次后应用超敏化学发光试剂盒显色2 min，X光显影后扫描分析。
将浓度为200 μg/ml的实验组、对照组细胞外泌体分别作用于12孔板中平铺的正常RPE细胞，据此分为蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组。37 ℃、5%CO2培养24 h，培养期间不更换培养液；24 h后MTT检测两组细胞增生活力。以正常细胞外泌体+对照组细胞增生率为1。
Western blot检测两组RPE细胞NLRP3炎性体相关细胞因子IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达。检测方法同前。免疫荧光法检测两组RPE细胞外沁体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达。将外泌体作用后的两组细胞平铺在24孔板上，浓度约5×104/ml，4%多聚甲醛固定爬片后加入0.5%Triton-100避光处理 20 min；PBS浸洗3次，加入1 ml 3%的牛血清白蛋白室温封闭1 h；加足量稀释一抗（1∶100），湿盒中4 ℃ 过夜；PBST浸洗3次后滴加荧光二抗（1∶100），避光室温孵育1 h，再次PBST浸洗3次，滴加4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核后PBST浸洗4次，抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜下观察并采集图像。应用Image Pro Plus软件将细胞荧光亮度转化为灰度值进行量化分析。
实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测两组RPE细胞内NLRP3 mRNA的表达。按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，−80 ℃保存。运用Primer Premier 5.0软件设计上下游引物。NLRP3:上游引物 5′-GGCATATCACAGTGGGATTC-3′，下游引物5′-GATCTTCGCTGCGATCAAC-3′。甘油醛脱氢酶（GAPDH）：上游引物5′-CGAGATCCCTCCAAAATCAA-3′，下游引物:5′-GGTGCTAAGCAGTTGGTGGT-3′。反应条件：94 ℃，30 s；50～60 ℃，30 s；72 ℃，60 s。变性、退火、延伸重复35～40个循环。将得到的各组循环阈值（CT）数据以GAPDH为内参，采用2−△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。
采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析处理。数据以均数±标准差（
）表示。两组细胞免疫荧光检测结果行方差齐性检验，MTT检测结果采用配对t检验，其余两组间比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，对照组细胞呈单层生长，梭形或多角形，融合后呈铺路石样生长；实验组细胞肿胀，细胞胞体失去多角形态，部分胞体变长，呈成纤维细胞形态（图1）。MTT检测结果显示，实验组细胞增生率为66.0%，低于对照组细胞，差异有统计学意义（t=3.92，P＜0.050）。
图1
培养的RPE细胞光学显微镜像。1A. 正常组，细胞呈单层生长，梭形或多角形，融合后呈铺路石样生长；1B. 实验组，细胞肿胀，细胞胞体失去多角形态，部分胞体变长，呈成纤维细胞形态 ×400
透射电子显微镜观察发现，实验组、对照组细胞外泌体形态无明显差异；直径约50～200 nm，呈双凹托盘状，有立体感，表面膜结构脂质双分子可见（图2）。
图2
外泌体透射电子显微镜像。2A. 实验组；2B. 对照组。两组细胞外泌体形态无明显差异；直径约50～200 nm，呈双凹托盘状，有立体感，表面膜结构脂质双分子可见 磷钨酸 标尺：2A. 400 nm；2B. 100 nm
Western blot检测发现，实验组、对照组细胞外泌体均表达CD63。两组细胞外泌体中IL-1β（t=18.04）、IL-18（t=12.55）、caspase-1（t=14.70）蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图3）。
图3
实验组、对照组细胞外泌体中IL-1β、1L-18、caspase-1蛋白表达比较。3A. 电泳图，1、2分别为对照组、实验组；3B. 统计结果。*与对照组比较，P＜0.050
MTT检测发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞增生率为76.5%，低于正常细胞外泌体+对照组，差异有统计学意义（t=3.49，P＜0.050）。
Western blot检测发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组细胞外泌体中IL-1β（t=18.59）、IL-18（t=23.95）、caspase-1（t=35.27）蛋白相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图4）。
图4
蓝光诱导细胞外泌体+实验组、正常细胞外泌体+对照组细胞外泌体中IL-1β、1L-18、caspase-1蛋白表达比较。4A. 电泳图，1、2分别为正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组；4B. 统计结果。*与正常细胞外泌体+对照组比较，P＜0.050
荧光显微镜观察发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1的表达高于正常细胞外泌体+对照组（图5）；两组细胞外泌体中IL-18（t=6.11）、IL-1β（t=6.30）、caspase-1（t=12.77）蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.001）（图6）。
图5
正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达荧光显微镜像。5A～5C、5D～5F.分别为正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1的表达。蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1表达明显强于正常细胞外泌体+对照组 DAPI ×100
图6
正常细胞外泌体+对照组、蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞外泌体中IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达量比较。*与正常细胞外泌体+对照组比较，P＜0.050
RT-PCR检测发现，实验组、对照组细胞NLRP3 mRNA相对表达量分别为1.000±0.069、0.200±0.010；实验组细胞NLRP3 mRNA相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义（t=12.20，P＜0.001）。
3 讨论
光损伤机制在AMD发病中被广泛研究并证实，蓝光暴露与AMD之间存在相关性[5, 6]；波长440 nm蓝光可诱导体外培养的RPE细胞通过氧化应激反应或光氧化损伤发生细胞凋亡及坏死[7]。蔡善君等[8]认为，阈值上光照强度下蓝光照射6 h，光照后12 h为诱导体外培养人RPE细胞凋亡的最佳条件。本研究选择4组蓝光LED灯距离细胞35 cm处照射6 h后培养12 h作为实验组，辐射强度约为3.2 mW/cm2。光照后RPE细胞肿胀，失去多角形态，细胞体变长，且增生活力明显减弱，提示体外培养的ARPE-19细胞系在蓝光照射后发生了光氧化损伤作用。可应用光氧化损伤的RPE细胞近似模拟早期AMD的RPE细胞。
外泌体是一类直径在50～200 nm的具有脂质双分子层结构的小囊泡，由各种活细胞分泌，其蛋白组成与其分泌的细胞具有相关性，外泌体可携带核酸、蛋白质等生物活性小分子进行细胞间的信号传递，且具有免疫活化、免疫抑制功能，参与机体免疫平衡的维持[3, 4]。近年来外泌体与AMD发病之间的关系受到广泛关注。Biasutto等[9]在ARPE-19细胞分泌的外泌体中检测到13种蛋白质、38种磷酸化蛋白和3种裂解蛋白质，这些蛋白同时也在AMD患者玻璃体中被检测到，提示视网膜细胞通过外泌体向玻璃体腔分泌细胞内、非水溶性、受体蛋白质。此外，Wang等[10]研究发现，玻璃膜疣含有外泌体的标记物，而且这些标记物同样存在于老龄鼠Bruch膜中。在应激状态下，RPE细胞释放外泌体，其表面可包被补体，并与补体因子H结合，这一过程也可能参与了AMD发病。本研究结果发现，蓝光诱导细胞外泌体+实验组细胞中IL-1β、IL-18、caspase-1相对表达量均较正常细胞外泌体+对照组升高，提示RPE细胞受到光氧化损伤后分泌含有致病信息的外泌体，并且通过出胞作用分布在细胞外环境中，即这些致病信息可能通过人体内环境分布和扩散，在AMD发病过程中发挥了重要作用。
近年来NLRP3炎性体在AMD中发挥的作用被广泛研究，尤其玻璃膜疣中的补体调节成分、β淀粉样蛋白及氧化副产物对NLRP3炎性体激活作用[11-13]。作为先天免疫的一部分，补体系统首先对组织损伤做出反应并且能够被细胞凋亡激活[14]。Doyle等[15]研究发现，玻璃膜疣成分可以激活粘多糖预刺激过的巨噬细胞；另外，C1q作用于粘多糖预刺激小鼠骨髓来源的巨噬细胞和单核细胞系真核细胞后，可激发caspase-1切割和IL-1β分泌增多，提示补体成分C1q在激活NLRP3炎性体中的重要作用；另有研究结果则证明了其他补体成分如C3a和膜攻击复合物对于激活NLRP3炎性体的重要作用[16-18]。随着年龄的增长，RPE细胞对光感受器外节的吞噬能力下降，脂质过氧化物和脂褐素沉积在RPE细胞，因此有学者认为脂褐质在RPE细胞的沉积导致了溶酶体损伤并直接激活NLRP3炎性体[1, 19, 20]。其他脂质过氧化产物和成分如4-羟基壬烯醛和羟乙基吡咯，也能够刺激NLRP3炎性体的激活[15, 21]。Piippo等[22]发现，细胞分解自噬功能衰退后，不仅导致细胞内蛋白质聚积和氧化应激，还可以活化NLRP3炎性体，增加有生物活性的IL-1β产生，NLRP3炎性体的静止则将大大减少caspase-1的激活和炎症因子IL-18、IL-1β的释放。上述所有因素，包括脂质沉积、慢性促炎症反应、氧化应激都能诱导持续的RPE细胞应激反应，损伤线粒体并促进NLRP3炎性体通路的激活。本研究结果显示，蓝光诱导后RPE细胞分泌的外泌体中IL-18、IL-1β以及caspase-1蛋白表达明显增多，证明光氧化损伤RPE细胞后确能激活NLRP3炎性体，且外泌体很可能作为某种媒介在NLRP3的激活中发挥了作用。
本研究将ARPE-19细胞系作为研究对象，并采用蓝光诱导造模，成功提取了蓝光模型ARPE-19分泌的外泌体，并将其作用于正常RPE细胞，检测到实验组细胞分泌的外泌体上调了正常RPE细胞内NLRP3相关细胞因子IL-1β、IL-18和caspase-1以及NLRP3 mRNA水平，提示外泌体能够在蛋白水平和基因水平上影响RPE细胞的生理活动。而其具体机制途径及这一过程是否在AMD的发病中发挥作用，尚且需要进一步的研究。
