引用本文： 金姬, 卢一, 冯佳, 任艳红, 杨莉丽, 顾伟忠. 视网膜Müller细胞条件性基因敲除血管内皮生长因子对氧诱导视网膜病变小鼠的影响. 中华眼底病杂志, 2017, 33(5): 508-512. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.016 复制
早产儿视网膜病变（ROP）的发病机制是相对高浓度氧抑制正常视网膜血管发育并伴随血管内皮生长因子（VEGF）低表达，而后因缺氧，VEGF、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达增高，导致视网膜新生血管增生；视网膜神经纤维层中的Müller细胞参与其病理过程[1-4]。玻璃体腔注射抗VEGF药物是治疗ROP的一种有效方法，但存在ROP复发时间延后、视网膜纤维化、视网膜脱离等并发症，甚至可能因为注射时机及剂量不当而引起患儿死亡[5-8]。我们应用Cre-Loxp重组酶技术建立Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠来模拟玻璃体腔早期、大量注射抗VEGF药物治疗环境，再将小鼠置于氧诱导视网膜病变（OIR）环境中观察其生存情况及视网膜血管形态、组织结构的变化，以期为临床玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗ROP的安全性研究提供实验理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠建立与鉴定、OIR模型建立与分组
所有动物实验均遵循美国眼科和视觉科学研究协会声明的“眼科和视觉研究动物使用指南”。应用Cre-Loxp重组酶技术建立Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠[9]。将转有卵黄样黄斑营养不良2启动子并表达反向四环素反式激活因子重组酶Müller细胞的FVB小鼠和两侧标有Loxp位点floxed-VEGF等位基因的C57/BL6小鼠杂交，两种小鼠均由美国Oklahoma大学生理系提供。孕母鼠从孕15 d至小鼠出生第1天持续服用强力霉素，采用逆转录聚合酶链反应对小鼠进行鉴定。Cre阳性为敲除VEGF（CKO）小鼠，Cre阴性为未敲除VEGF（NKO）小鼠。
选取7日龄CKO小鼠（CKO组）、NKO小鼠（NKO组）各20只与代哺乳母鼠一同置于75%氧舱喂养5 d，小鼠12日龄时移出氧舱在室内空气中喂养至17日龄，生长环境清洁无菌。观察两组小鼠建模过程中的死亡情况。同时选取在正常空气环境下饲养的17日龄野生型小鼠7只作为正常对照组。
1.2 视网膜铺片、视网膜石蜡切片及免疫荧光组织化学染色
小鼠17日龄时，3组各取5只小鼠10只眼行异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran，相对分子质量2×106，美国Sigma公司）荧光造影后视网膜铺片，荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察视网膜血管形态变化，并计算分析视网膜无血管区面积百分比。将FITC-Dextran溶于4%多聚甲醛中，浓度为50 mg/ml，震动，以离心半径10 cm、转速2000 r/min离心5 min，制备造影液备用。麻醉固定小鼠，打开胸腔，平衡盐溶液从左心室灌注5 min，并剪开右心耳放血，抽取配置的造影液1 ml，用2 ml注射器针头注入左心室，以口、鼻、耳廓变黄为灌注成功。迅速摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定30 min。在便携式显微镜（日本Olympus公司）下，沿角巩膜剪开眼球，去除角膜、晶状体，小心剜出视网膜，放射状剪开，置于干净载玻片上，铺平，滴甘油固定液1滴，盖上盖玻片。取490 nm激发光，520 nm滤过波，于荧光显微镜下观察拍片。测量全视网膜和视网膜无血管区面积，计算无血管区面积所占百分比。
小鼠17日龄时，3组各取2只小鼠4只眼行视网膜石蜡切片，计数突破内界膜的血管内皮细胞核数。摘取眼球，常规石蜡包埋，连续切片厚度为4 μm，每只眼球随机取出20张切片，常规苏木精-伊红（HE）染色。除外含视神经的切片，每组共80张切片。400倍光学显微镜下计数突破内界膜的血管内皮细胞核数，取平均数。
采用免疫荧光组织化学染色检测CKO组、NKO组小鼠视网膜中HIF-1α的表达。取视网膜石蜡切片，经常规脱蜡水化后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，正常山羊血清室温封闭1 h，加入山羊抗鼠HIF-1α单克隆抗体一抗（1:100），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，山羊抗兔IgG绿色DyLight488荧光标记二抗（美国Invitrogen公司）37 ℃孵育1 h，苯基吲哚（DAPI）复染细胞核5 min，PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜拍片。PBS替代一抗设为阴性对照。
1.3 统计学分析
采用SPSS 12.0统计学软件进行统计处理。实验数据计数资料以百分比表示，组间比较采用卡方检验。计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用非配对 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
OIR建模过程中，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为65.00%、30.00%。CKO组小鼠总死亡率是NKO组小鼠的2.17倍，差异有统计学意义（χ2=4.912，P=0.027）。在高氧环境中，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为40.00%、20.00%；CKO组小鼠死亡率是NKO组的2.00倍。出氧舱后，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为41.67%、12.50%；CKO组小鼠死亡率是NKO组的3.30倍。CKO组、NKO组在高氧舱内及出氧舱后的小鼠死亡率比较，差异均无统计学意义（χ2=1.905、1.764，P=0.166、0.078）。
表1
OIR建模过程中CKO组、NKO组小鼠死亡率比较
荧光显微镜观察发现，正常对照组小鼠视盘及视网膜血管发育完全至边缘，血管网分布均匀厚实，没有无血管区（图1）。CKO组小鼠视盘周围毛细血管闭塞，视网膜血管扩张、纡曲，可见大片无血管区，新生血管丛较少；荧光素渗漏情况不明显；中周部正常毛细血管网少、密度低且分布紊乱，血管未发育到边缘；整个视网膜单薄、无层次感（图2）。NKO组小鼠视盘周围无血管区较少，血管纡曲、扩张较轻，视网膜正常血管网状结构可见范围较大，血管密度高且分布紊乱，新生血管丛较多，荧光素渗漏较明显（图3）。CKO组、NKO组小鼠视网膜无血管区面积所占全视网膜面积的百分比分别为（28.31±11.15）%、（16.82±7.23）%；两者比较，差异有统计学意义（t=2.734，P=0.014）。
光学显微镜观察发现，正常对照组小鼠未见突破内界膜的内皮细胞核，CKO组、NKO组小鼠均可见大量突破内界膜的血管内皮细胞核（图4）。CKO组、NKO组小鼠平均每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为（26.10±6.37）、（28.80±7.59）个；两者比较，差异有统计学意义（t=2.437，P=0.016）。
荧光显微镜观察发现，CKO组、NKO组小鼠视网膜均可见HIF-1α呈阳性表达，主要位于神经节细胞层（GCL）和光感受器细胞层。CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组（图5）。
图5
小鼠视网膜石蜡切片荧光显微镜像。5A.CKO组；5B.NKO组。两组小鼠视网膜可见HIF-1α阳性表达主要位于GCL和光感受器细胞层（白箭），CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组 DAPI ×400
3 讨论
应用Cre-Loxp重组酶技术建立的CKO小鼠可通过强力霉素调控Cre表达，这就赋予CKO小鼠视网膜VEGF缺失的时间可以人为调控，使进行性疾病及退行性疾病的研究更加方便[9]。本研究对孕母鼠从孕15 d至小鼠出生第1天持续服用强力霉素，调控Müller细胞在CKO小鼠出生第2天起不表达VEGF，模拟了早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物的效果。在这个模式下，我们建立与ROP极其相似的OIR动物模型观察小鼠视网膜血管的发生发展情况。结果显示，与NKO组比较，CKO组小鼠整个视网膜较单薄、贫瘠，血管化推迟，正常毛细血管网和新生血管丛均少，荧光素渗漏较不明显；视盘及后极部血管网发育不良，视网膜可见大片无血管区；视网膜无血管区所占面积更大。提示早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物有减少视网膜新生血管生长和降低血管通透性的作用，但也明显影响视网膜血管和神经正常发育。说明VEGF除了刺激病理性新生血管外，也是有效的神经保护和神经再生因子[10]。提示临床对于ROP发病早期及较早发生ROP的患儿，应用抗VEGF药物应谨慎。
我们还发现，CKO组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较NKO组少，但视网膜基质及内界膜的破坏程度两者没有分别。据此推测，抗VEGF药物治疗不能减轻或恢复ROP引起的血眼屏障功能的破坏，其他一些血管生长因子、纤维化因子等仍然会渗透入视网膜、玻璃体中，引起ROP复发、视网膜纤维化等。
HIF-1α是介导细胞对低氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子，可上调VEGF、胰岛素样生长因子-1、促红细胞生成素及其受体的表达，从而促进血管新生，在ROP的发生发展中也起到重要作用[3]。本研究结果显示，CKO组、NKO组小鼠视网膜GCL和光感受器细胞层均可见HIF-1α阳性表达，且CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组。证明Müller细胞条件性基因敲除VEGF不能阻止OIR的HIF-1α表达增高。HIF-1α是否可以成为ROP治疗的新靶点有待进一步研究揭示。
已有研究报道，玻璃体腔注射抗VEGF药物可通过渗透到达全身血液循环，这可能会增加早产儿发生全身并发症的风险[11]。Mintz-Hittner等[6]采用玻璃体腔注射贝伐单抗治疗3期以上的ROP患儿，其中4例发生死亡。说明VEGF可能在其他器官发育中也发挥着非常重要的作用，抗VEGF药物治疗可能对早产儿正常发育造成影响[12]。本研究中CKO小鼠总死亡率是NKO小鼠的2.17倍。推测视网膜局部VEGF基因敲除新生小鼠的生存能力下降可能还是因为VEGF缺乏，后者是生长发育过程中必需的生长因子。
本研究结果表明，Müller细胞条件性基因敲除VEGF模拟早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物的效果会明显减弱新生小鼠在OIR环境中的生存能力，抑制部分视网膜新生血管的同时推迟了视网膜正常血管化。但由于本研究存在样本量小、时间设计单一以及HIF-1α及其信息通路缺乏系统设计等缺陷，其结果有待进一步研究加以验证。
早产儿视网膜病变（ROP）的发病机制是相对高浓度氧抑制正常视网膜血管发育并伴随血管内皮生长因子（VEGF）低表达，而后因缺氧，VEGF、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）表达增高，导致视网膜新生血管增生；视网膜神经纤维层中的Müller细胞参与其病理过程[1-4]。玻璃体腔注射抗VEGF药物是治疗ROP的一种有效方法，但存在ROP复发时间延后、视网膜纤维化、视网膜脱离等并发症，甚至可能因为注射时机及剂量不当而引起患儿死亡[5-8]。我们应用Cre-Loxp重组酶技术建立Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠来模拟玻璃体腔早期、大量注射抗VEGF药物治疗环境，再将小鼠置于氧诱导视网膜病变（OIR）环境中观察其生存情况及视网膜血管形态、组织结构的变化，以期为临床玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗ROP的安全性研究提供实验理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠建立与鉴定、OIR模型建立与分组
所有动物实验均遵循美国眼科和视觉科学研究协会声明的“眼科和视觉研究动物使用指南”。应用Cre-Loxp重组酶技术建立Müller细胞条件性基因敲除VEGF小鼠[9]。将转有卵黄样黄斑营养不良2启动子并表达反向四环素反式激活因子重组酶Müller细胞的FVB小鼠和两侧标有Loxp位点floxed-VEGF等位基因的C57/BL6小鼠杂交，两种小鼠均由美国Oklahoma大学生理系提供。孕母鼠从孕15 d至小鼠出生第1天持续服用强力霉素，采用逆转录聚合酶链反应对小鼠进行鉴定。Cre阳性为敲除VEGF（CKO）小鼠，Cre阴性为未敲除VEGF（NKO）小鼠。
选取7日龄CKO小鼠（CKO组）、NKO小鼠（NKO组）各20只与代哺乳母鼠一同置于75%氧舱喂养5 d，小鼠12日龄时移出氧舱在室内空气中喂养至17日龄，生长环境清洁无菌。观察两组小鼠建模过程中的死亡情况。同时选取在正常空气环境下饲养的17日龄野生型小鼠7只作为正常对照组。
1.2 视网膜铺片、视网膜石蜡切片及免疫荧光组织化学染色
小鼠17日龄时，3组各取5只小鼠10只眼行异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran，相对分子质量2×106，美国Sigma公司）荧光造影后视网膜铺片，荧光显微镜（日本Olympus公司）下观察视网膜血管形态变化，并计算分析视网膜无血管区面积百分比。将FITC-Dextran溶于4%多聚甲醛中，浓度为50 mg/ml，震动，以离心半径10 cm、转速2000 r/min离心5 min，制备造影液备用。麻醉固定小鼠，打开胸腔，平衡盐溶液从左心室灌注5 min，并剪开右心耳放血，抽取配置的造影液1 ml，用2 ml注射器针头注入左心室，以口、鼻、耳廓变黄为灌注成功。迅速摘除眼球，置于4%多聚甲醛固定30 min。在便携式显微镜（日本Olympus公司）下，沿角巩膜剪开眼球，去除角膜、晶状体，小心剜出视网膜，放射状剪开，置于干净载玻片上，铺平，滴甘油固定液1滴，盖上盖玻片。取490 nm激发光，520 nm滤过波，于荧光显微镜下观察拍片。测量全视网膜和视网膜无血管区面积，计算无血管区面积所占百分比。
小鼠17日龄时，3组各取2只小鼠4只眼行视网膜石蜡切片，计数突破内界膜的血管内皮细胞核数。摘取眼球，常规石蜡包埋，连续切片厚度为4 μm，每只眼球随机取出20张切片，常规苏木精-伊红（HE）染色。除外含视神经的切片，每组共80张切片。400倍光学显微镜下计数突破内界膜的血管内皮细胞核数，取平均数。
采用免疫荧光组织化学染色检测CKO组、NKO组小鼠视网膜中HIF-1α的表达。取视网膜石蜡切片，经常规脱蜡水化后，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，正常山羊血清室温封闭1 h，加入山羊抗鼠HIF-1α单克隆抗体一抗（1:100），4 ℃孵育过夜，PBS洗涤3次，山羊抗兔IgG绿色DyLight488荧光标记二抗（美国Invitrogen公司）37 ℃孵育1 h，苯基吲哚（DAPI）复染细胞核5 min，PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片液封片，荧光显微镜拍片。PBS替代一抗设为阴性对照。
1.3 统计学分析
采用SPSS 12.0统计学软件进行统计处理。实验数据计数资料以百分比表示，组间比较采用卡方检验。计量资料以均数±标准差（
）表示，组间比较采用非配对 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
OIR建模过程中，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为65.00%、30.00%。CKO组小鼠总死亡率是NKO组小鼠的2.17倍，差异有统计学意义（χ2=4.912，P=0.027）。在高氧环境中，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为40.00%、20.00%；CKO组小鼠死亡率是NKO组的2.00倍。出氧舱后，CKO组、NKO组小鼠总死亡率分别为41.67%、12.50%；CKO组小鼠死亡率是NKO组的3.30倍。CKO组、NKO组在高氧舱内及出氧舱后的小鼠死亡率比较，差异均无统计学意义（χ2=1.905、1.764，P=0.166、0.078）。
表1
OIR建模过程中CKO组、NKO组小鼠死亡率比较
荧光显微镜观察发现，正常对照组小鼠视盘及视网膜血管发育完全至边缘，血管网分布均匀厚实，没有无血管区（图1）。CKO组小鼠视盘周围毛细血管闭塞，视网膜血管扩张、纡曲，可见大片无血管区，新生血管丛较少；荧光素渗漏情况不明显；中周部正常毛细血管网少、密度低且分布紊乱，血管未发育到边缘；整个视网膜单薄、无层次感（图2）。NKO组小鼠视盘周围无血管区较少，血管纡曲、扩张较轻，视网膜正常血管网状结构可见范围较大，血管密度高且分布紊乱，新生血管丛较多，荧光素渗漏较明显（图3）。CKO组、NKO组小鼠视网膜无血管区面积所占全视网膜面积的百分比分别为（28.31±11.15）%、（16.82±7.23）%；两者比较，差异有统计学意义（t=2.734，P=0.014）。
光学显微镜观察发现，正常对照组小鼠未见突破内界膜的内皮细胞核，CKO组、NKO组小鼠均可见大量突破内界膜的血管内皮细胞核（图4）。CKO组、NKO组小鼠平均每张切片突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为（26.10±6.37）、（28.80±7.59）个；两者比较，差异有统计学意义（t=2.437，P=0.016）。
荧光显微镜观察发现，CKO组、NKO组小鼠视网膜均可见HIF-1α呈阳性表达，主要位于神经节细胞层（GCL）和光感受器细胞层。CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组（图5）。
图5
小鼠视网膜石蜡切片荧光显微镜像。5A.CKO组；5B.NKO组。两组小鼠视网膜可见HIF-1α阳性表达主要位于GCL和光感受器细胞层（白箭），CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组 DAPI ×400
3 讨论
应用Cre-Loxp重组酶技术建立的CKO小鼠可通过强力霉素调控Cre表达，这就赋予CKO小鼠视网膜VEGF缺失的时间可以人为调控，使进行性疾病及退行性疾病的研究更加方便[9]。本研究对孕母鼠从孕15 d至小鼠出生第1天持续服用强力霉素，调控Müller细胞在CKO小鼠出生第2天起不表达VEGF，模拟了早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物的效果。在这个模式下，我们建立与ROP极其相似的OIR动物模型观察小鼠视网膜血管的发生发展情况。结果显示，与NKO组比较，CKO组小鼠整个视网膜较单薄、贫瘠，血管化推迟，正常毛细血管网和新生血管丛均少，荧光素渗漏较不明显；视盘及后极部血管网发育不良，视网膜可见大片无血管区；视网膜无血管区所占面积更大。提示早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物有减少视网膜新生血管生长和降低血管通透性的作用，但也明显影响视网膜血管和神经正常发育。说明VEGF除了刺激病理性新生血管外，也是有效的神经保护和神经再生因子[10]。提示临床对于ROP发病早期及较早发生ROP的患儿，应用抗VEGF药物应谨慎。
我们还发现，CKO组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较NKO组少，但视网膜基质及内界膜的破坏程度两者没有分别。据此推测，抗VEGF药物治疗不能减轻或恢复ROP引起的血眼屏障功能的破坏，其他一些血管生长因子、纤维化因子等仍然会渗透入视网膜、玻璃体中，引起ROP复发、视网膜纤维化等。
HIF-1α是介导细胞对低氧微环境进行适应性反应的关键性转录调控因子，可上调VEGF、胰岛素样生长因子-1、促红细胞生成素及其受体的表达，从而促进血管新生，在ROP的发生发展中也起到重要作用[3]。本研究结果显示，CKO组、NKO组小鼠视网膜GCL和光感受器细胞层均可见HIF-1α阳性表达，且CKO组小鼠视网膜HIF-1α阳性表达明显强于NKO组。证明Müller细胞条件性基因敲除VEGF不能阻止OIR的HIF-1α表达增高。HIF-1α是否可以成为ROP治疗的新靶点有待进一步研究揭示。
已有研究报道，玻璃体腔注射抗VEGF药物可通过渗透到达全身血液循环，这可能会增加早产儿发生全身并发症的风险[11]。Mintz-Hittner等[6]采用玻璃体腔注射贝伐单抗治疗3期以上的ROP患儿，其中4例发生死亡。说明VEGF可能在其他器官发育中也发挥着非常重要的作用，抗VEGF药物治疗可能对早产儿正常发育造成影响[12]。本研究中CKO小鼠总死亡率是NKO小鼠的2.17倍。推测视网膜局部VEGF基因敲除新生小鼠的生存能力下降可能还是因为VEGF缺乏，后者是生长发育过程中必需的生长因子。
本研究结果表明，Müller细胞条件性基因敲除VEGF模拟早期、大量玻璃体腔注射抗VEGF药物的效果会明显减弱新生小鼠在OIR环境中的生存能力，抑制部分视网膜新生血管的同时推迟了视网膜正常血管化。但由于本研究存在样本量小、时间设计单一以及HIF-1α及其信息通路缺乏系统设计等缺陷，其结果有待进一步研究加以验证。
