引用本文： 黄江, 李翊, 肖建江, 徐国旭, 卜曙旸, 罗蔚锋. 姜黄素对高糖诱导的大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡的影响. 中华眼底病杂志, 2017, 33(5): 513-517. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.017 复制
氧化应激是糖尿病视网膜病变（DR）发病的关键机制[1-3]。核因子（NF）-κB作为一类关键性核转录因子，可以在多种细胞中激活，并通过调节许多细胞基因的表达，在细胞调控、氧化应激反应中发挥极其重要的作用；激活NF-κB信号通路，可以导致细胞凋亡[4-7]。姜黄素是从植物姜黄的块茎中提取出来的一种黄色粉末，具有明显抗炎、抗肿瘤及抗氧化等作用[8-11]。已有研究表明，姜黄素对视网膜色素上皮细胞具有明显的抗氧化作用，且其作用可能与选择性抑制NF-κB信号通路有关[12-14]。但目前关于姜黄素对大鼠视网膜血管内皮细胞（RRVEC）是否具有抗氧化作用及其可能的作用机制尚不清楚。为此，本研究观察了姜黄素对高糖诱导的RRVEC凋亡的影响，初步分析了姜黄素与NF-κB、RRVEC凋亡三者之间的关系。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
Sprague-Dawley雄性大鼠60只，体重约100 g，由苏州大学实验动物中心提供。姜黄素[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]，胰蛋白酶（美国Invitrogen公司），Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝、浓度0.04%的锥虫蓝（美国Sigma公司），血管性假性血友病因子（vWF）免疫多克隆抗体（1:200，美国Abcam公司），内皮细胞培养基、荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物有限公司），兔抗磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，杭州贤至生物有限公司），兔抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体、兔抗大鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、兔抗大鼠Bcl-2相关x蛋白（Bax）（武汉三鹰生物技术有限公司）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、细胞活性氧（ROS）检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），二氨基联苯胺显色试剂盒（北京索莱宝科技公司），细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。IX51型倒置显微镜、Eppendorf低速离心机、BX53荧光显微镜（日本Olymbus公司），尼康E100型生物显微镜（日本Nikon公司），酶标仪（美国热电公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 RRVEC培养及鉴定
实验动物使用遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。参照文献[15]的方法进行细胞分离培养。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，脱颈处死，头部常规消毒后完整摘除眼球，75%乙醇浸泡30 s，取出后放入含200 U/ml青霉素和链霉素的冰磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗3遍，洗净血污后置于含有冰PBS纱布的培养皿中，获取视网膜组织并剪碎，直接加入培养液进行培养。使用0.1% Ⅰ型胶原酶将视网膜组织置于37 ℃条件下消化30 min，吸收消化液，再经网孔100 μm的两层不锈钢细胞筛网过滤，收集洗脱液，室温下以离心半径13 cm、转速1500 r/m离心5 min，去除上清液。取离心后的沉淀物加入含有肝素钠、胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基，接种于24孔培养板上，然后放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，定期换液。
取第4代近融合的RRVEC以密度1×104个/ml接种在预先涂有明胶的盖玻片上，继续培养24 h，待细胞贴壁后将盖玻片取出，采用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞，并对内皮细胞的特异性标志物vWF的表达进行检测。阴性对照组以PBS代替一抗，加入Cy3二抗工作液37 ℃孵育显色。荧光显微镜下观察，采集图像。以Cy3发出红色荧光为阳性表达。
1.3 细胞分组及流式细胞仪、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫组织化学染色检测
将RRVEC分为对照组、高糖组和姜黄素干预组。对照组细胞正常培养。高糖组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养。干预组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养24 h后，再加入30 μmol/L的姜黄素处理24 h。
采用流式细胞仪检测各组RRVEC中ROS相对含量。将各组细胞制成单细胞悬液，以细胞密度2×105个/孔均匀接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养过夜。用不含乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后收集，离心去上清液，用PBS将细胞润洗2次。按照细胞ROS检测试剂盒操作说明进行，流式细胞仪检测。
采用Western blot检测各组RRVEC中Bcl-2、Bax的蛋白表达。提取总蛋白及检测目的蛋白，将PBS稀释过的蛋白样品及标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20 μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50:1比例将BCA蛋白浓度测定试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200 μl，37 ℃避光孵育30 min。用酶标仪测定波长568 nm处吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。根据标准蛋白浓度和相应的A值计算直线回归方程，根据蛋白样品A值，利用回归方程计算样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清与5倍蛋白上样缓冲液放入沸水中进行沸水浴10 min，进行蛋白变性。参照文献[16]的方法进行电泳、转膜，膜封闭，添加一抗4 ℃孵育过夜（GAPDH：1:1000；Bcl-2：1:2000；Bax：1:5000）。洗膜5～6次后添加相应二抗。洗膜后，以化学发光法显影、定影，并冲洗胶片。应用BandScan分析胶片灰度值，重复实验3次。
参考文献[17]的方法采用免疫组织化学染色法检测各组RRVEC中NF-κB p65的蛋白表达。取出细胞爬片，PBS冲洗3次，分别滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗体，按霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学染色试剂盒说明进行操作。以细胞质呈黄色或棕黄色染色为阳性细胞。每张切片选择10个高倍视野，显微镜下观察并照相，采用数码图像分析系统进行分析。以阳性细胞的平均A值计算目的蛋白的相对表达量。
采用流式细胞仪分析各组RRVEC的凋亡情况。将各组细胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培养72 h收集细胞，制备单细胞悬液，用PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×105个/L，制成单个细胞悬液，每样本加入5 μl膜联蛋白和1 μl碘化丙啶工作液，室温下避光孵育15 min，孵育完成后再加入400 μl的膜联蛋白结合缓冲液，流式细胞仪进行分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。数据资料经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，细胞凋亡率以百分数表示；其他实验数据以均数±标准差（
）表示。组间均数经Levene检验方差齐性，采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著差法 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
分离得到的RRVEC在1周后呈铺路石样单层贴壁生长。培养获得的细胞vWF表达呈强阳性（图1）。
图1
RRVEC倒置相差显微镜及免疫荧光显微镜像。1A. 倒置相差显微镜像，培养1周的RRVEC呈铺路石样生长 标尺：100 μm；1B. 免疫荧光显微镜像，vWF免疫荧光染色细胞质呈红色荧光 标尺：20 μm
对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量比较，差异有统计学意义（F=40.957，P=0.000）。与对照组比较，高糖组RRVEC中ROS相对含量明显增加，差异有统计学意义（t=8.677，P=0.000）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量明显降低，差异有统计学意义（t=6.568，P=0.000）（图2A）。
图2
各组RRVEC中ROS相对含量及细胞凋亡率比较。**P＜0.01
对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC凋亡率比较，差异有统计学意义（F=325.137，P=0.000）。与对照组比较，高糖组RRVEC凋亡率明显升高，差异有统计学意义（t=25.500，P=0.000）。姜黄素干预组RRVEC凋亡率较高糖组明显降低，差异有统计学意义（t=12.818，P=0.000）；但仍较对照组升高，差异有统计学意义（t=12.682，P=0.000）（图2B）。
图3
各组RRVEC中NF-κBp65蛋白表达比较。*P＜0.05；**P＜0.01
对照组RRVEC细胞质NF-κB p65蛋白呈阳性表达；高糖组RRVEC细胞核和细胞质均可见NF-κB p65蛋白呈强阳性表达；姜黄素干预组RRVEC细胞核和细胞质均可见NF-κB p65蛋白呈阳性表达。与对照组比较，高糖组RRVEC中NF-κB p65蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（t=8.322，P＜0.01）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中NF-κB p65蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（t=2.577，P＜0.05）（图3）。
图4
各组RRVEC中Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表达比较。*P＜0.05；**P＜0.01
与对照组比较，高糖组RRVEC中Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，Bcl-2/Bax比值降低，差异均有统计学意义（t=4.362、3.813、6.449，P=0.005、0.009、0.001）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中Bcl-2蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（t=2.148，P=0.075）；Bax蛋白表达明显降低（t=3.059，P=0.022），Bcl-2/Bax比值明显升高（t=3.831，P=0.009），差异均有统计学意义（图4）。
3 讨论
本研究经预实验筛选出葡萄糖及姜黄素对RRVEC增生影响的最佳浓度为30 mmol/L、30 μmol/L。进一步实验结果显示，30 mmol/L高糖作用RRVEC 24 h后细胞内即开始产生大量ROS，而经过30 μmol/L姜黄素作用24 h后，细胞内ROS相对含量显著降低。说明姜黄素可以明显抵抗高糖引起的氧化应激反应。而流式细胞仪检测结果显示，姜黄素对于氧化应激引起的RRVEC凋亡具有明显的抑制作用，从细胞功能学角度证实姜黄素能够保护RRVEC。
Bcl-2、Bax是细胞凋亡的重要相关基因。Bcl-2为抑凋亡基因，Bax为促凋亡基因，且NF-κB调控的下游基因包括Bcl-2、Bax。Bcl-2基因启动子区含有NF-κB的结合位点，NF-κB能够直接上调Bcl-2的表达或通过其他途径促进Bcl-2的表达[18, 19]。为了进一步研究姜黄素抗氧化应激的具体分子机制，我们观察了高糖作用于RRVEC中NF-κB p65、Bcl-2、Bax的蛋白表达变化。免疫组织化学染色观察发现，高糖诱导RRVEC后，其细胞核中的NF-κB p65表达明显升高，而细胞质中NF-κB p65表达降低。说明高糖诱导下，RRVEC细胞质内的NF-κB p65进入细胞核明显增加，并发挥了转录活性；而在姜黄素的干预下，高糖诱导的RRVEC细胞质中NF-κB p65表达降低且进入细胞核明显受到抑制。提示姜黄素能够通过阻断NF-κB信号通路抑制高糖引起的RRVEC氧化应激反应。我们通过Western blot检测发现，经高糖诱导后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低；而姜黄素干预后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高。RRVEC中NF-κB p65蛋白与Bcl-2、Bax蛋白表达以及Bcl-2/Bax比值变化的一致性说明高糖诱导RRVEC可激活NF-κB，进而引起Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高。
本研究结果表明，姜黄素能够抑制高糖引起的RRVEC中ROS的产生以及细胞凋亡的发生，其可能机制是抑制NF-κB表达，上调下游抑凋亡基因Bcl-2表达，下调促凋亡基因Bax表达。提示姜黄素能够通过抑制NF-κB通路，对抗氧化应激从而起到保护视网膜血管内皮细胞的作用，而更确切深入的机制尚待进一步的分子生物学研究证实。
氧化应激是糖尿病视网膜病变（DR）发病的关键机制[1-3]。核因子（NF）-κB作为一类关键性核转录因子，可以在多种细胞中激活，并通过调节许多细胞基因的表达，在细胞调控、氧化应激反应中发挥极其重要的作用；激活NF-κB信号通路，可以导致细胞凋亡[4-7]。姜黄素是从植物姜黄的块茎中提取出来的一种黄色粉末，具有明显抗炎、抗肿瘤及抗氧化等作用[8-11]。已有研究表明，姜黄素对视网膜色素上皮细胞具有明显的抗氧化作用，且其作用可能与选择性抑制NF-κB信号通路有关[12-14]。但目前关于姜黄素对大鼠视网膜血管内皮细胞（RRVEC）是否具有抗氧化作用及其可能的作用机制尚不清楚。为此，本研究观察了姜黄素对高糖诱导的RRVEC凋亡的影响，初步分析了姜黄素与NF-κB、RRVEC凋亡三者之间的关系。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
Sprague-Dawley雄性大鼠60只，体重约100 g，由苏州大学实验动物中心提供。姜黄素[梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]，胰蛋白酶（美国Invitrogen公司），Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝、浓度0.04%的锥虫蓝（美国Sigma公司），血管性假性血友病因子（vWF）免疫多克隆抗体（1:200，美国Abcam公司），内皮细胞培养基、荧光（Cy3）标记羊抗兔IgG（武汉博士德生物有限公司），兔抗磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH，杭州贤至生物有限公司），兔抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体、兔抗大鼠B细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、兔抗大鼠Bcl-2相关x蛋白（Bax）（武汉三鹰生物技术有限公司）。二喹啉甲酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒、细胞活性氧（ROS）检测试剂盒（碧云天生物技术研究所），二氨基联苯胺显色试剂盒（北京索莱宝科技公司），细胞凋亡检测试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司），免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。IX51型倒置显微镜、Eppendorf低速离心机、BX53荧光显微镜（日本Olymbus公司），尼康E100型生物显微镜（日本Nikon公司），酶标仪（美国热电公司），流式细胞仪（美国BD公司）。
1.2 RRVEC培养及鉴定
实验动物使用遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。参照文献[15]的方法进行细胞分离培养。10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，脱颈处死，头部常规消毒后完整摘除眼球，75%乙醇浸泡30 s，取出后放入含200 U/ml青霉素和链霉素的冰磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗3遍，洗净血污后置于含有冰PBS纱布的培养皿中，获取视网膜组织并剪碎，直接加入培养液进行培养。使用0.1% Ⅰ型胶原酶将视网膜组织置于37 ℃条件下消化30 min，吸收消化液，再经网孔100 μm的两层不锈钢细胞筛网过滤，收集洗脱液，室温下以离心半径13 cm、转速1500 r/m离心5 min，去除上清液。取离心后的沉淀物加入含有肝素钠、胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基，接种于24孔培养板上，然后放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养，定期换液。
取第4代近融合的RRVEC以密度1×104个/ml接种在预先涂有明胶的盖玻片上，继续培养24 h，待细胞贴壁后将盖玻片取出，采用免疫细胞荧光染色法鉴定细胞，并对内皮细胞的特异性标志物vWF的表达进行检测。阴性对照组以PBS代替一抗，加入Cy3二抗工作液37 ℃孵育显色。荧光显微镜下观察，采集图像。以Cy3发出红色荧光为阳性表达。
1.3 细胞分组及流式细胞仪、蛋白免疫印迹法（Western blot）、免疫组织化学染色检测
将RRVEC分为对照组、高糖组和姜黄素干预组。对照组细胞正常培养。高糖组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养。干预组细胞经30 mmol/L的葡萄糖培养24 h后，再加入30 μmol/L的姜黄素处理24 h。
采用流式细胞仪检测各组RRVEC中ROS相对含量。将各组细胞制成单细胞悬液，以细胞密度2×105个/孔均匀接种于6孔板中，37 ℃、5%CO2饱和湿度条件培养过夜。用不含乙二胺四乙酸的0.25%胰蛋白酶消化细胞，终止消化后收集，离心去上清液，用PBS将细胞润洗2次。按照细胞ROS检测试剂盒操作说明进行，流式细胞仪检测。
采用Western blot检测各组RRVEC中Bcl-2、Bax的蛋白表达。提取总蛋白及检测目的蛋白，将PBS稀释过的蛋白样品及标准蛋白分别加入96孔板内，标准品各设2个平行孔，待测样品设3个平行孔，每孔加入体积20 μl。加入PBS的2个平行孔为空白对照。按50:1比例将BCA蛋白浓度测定试剂盒中A液和B液进行混合，将混合液加入96孔板内，每孔加入200 μl，37 ℃避光孵育30 min。用酶标仪测定波长568 nm处吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。根据标准蛋白浓度和相应的A值计算直线回归方程，根据蛋白样品A值，利用回归方程计算样品蛋白浓度。将提取的蛋白上清与5倍蛋白上样缓冲液放入沸水中进行沸水浴10 min，进行蛋白变性。参照文献[16]的方法进行电泳、转膜，膜封闭，添加一抗4 ℃孵育过夜（GAPDH：1:1000；Bcl-2：1:2000；Bax：1:5000）。洗膜5～6次后添加相应二抗。洗膜后，以化学发光法显影、定影，并冲洗胶片。应用BandScan分析胶片灰度值，重复实验3次。
参考文献[17]的方法采用免疫组织化学染色法检测各组RRVEC中NF-κB p65的蛋白表达。取出细胞爬片，PBS冲洗3次，分别滴加兔抗人NF-κB p65多克隆抗体，按霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学染色试剂盒说明进行操作。以细胞质呈黄色或棕黄色染色为阳性细胞。每张切片选择10个高倍视野，显微镜下观察并照相，采用数码图像分析系统进行分析。以阳性细胞的平均A值计算目的蛋白的相对表达量。
采用流式细胞仪分析各组RRVEC的凋亡情况。将各组细胞于37 ℃、5%CO2孵箱中培养72 h收集细胞，制备单细胞悬液，用PBS洗涤2次，调整细胞密度为1×105个/L，制成单个细胞悬液，每样本加入5 μl膜联蛋白和1 μl碘化丙啶工作液，室温下避光孵育15 min，孵育完成后再加入400 μl的膜联蛋白结合缓冲液，流式细胞仪进行分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS20.0统计软件进行统计学分析。数据资料经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，细胞凋亡率以百分数表示；其他实验数据以均数±标准差（
）表示。组间均数经Levene检验方差齐性，采用单因素方差分析，多重比较采用最小显著差法 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
分离得到的RRVEC在1周后呈铺路石样单层贴壁生长。培养获得的细胞vWF表达呈强阳性（图1）。
图1
RRVEC倒置相差显微镜及免疫荧光显微镜像。1A. 倒置相差显微镜像，培养1周的RRVEC呈铺路石样生长 标尺：100 μm；1B. 免疫荧光显微镜像，vWF免疫荧光染色细胞质呈红色荧光 标尺：20 μm
对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量比较，差异有统计学意义（F=40.957，P=0.000）。与对照组比较，高糖组RRVEC中ROS相对含量明显增加，差异有统计学意义（t=8.677，P=0.000）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中ROS相对含量明显降低，差异有统计学意义（t=6.568，P=0.000）（图2A）。
图2
各组RRVEC中ROS相对含量及细胞凋亡率比较。**P＜0.01
对照组、高糖组及姜黄素干预组RRVEC凋亡率比较，差异有统计学意义（F=325.137，P=0.000）。与对照组比较，高糖组RRVEC凋亡率明显升高，差异有统计学意义（t=25.500，P=0.000）。姜黄素干预组RRVEC凋亡率较高糖组明显降低，差异有统计学意义（t=12.818，P=0.000）；但仍较对照组升高，差异有统计学意义（t=12.682，P=0.000）（图2B）。
图3
各组RRVEC中NF-κBp65蛋白表达比较。*P＜0.05；**P＜0.01
对照组RRVEC细胞质NF-κB p65蛋白呈阳性表达；高糖组RRVEC细胞核和细胞质均可见NF-κB p65蛋白呈强阳性表达；姜黄素干预组RRVEC细胞核和细胞质均可见NF-κB p65蛋白呈阳性表达。与对照组比较，高糖组RRVEC中NF-κB p65蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（t=8.322，P＜0.01）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中NF-κB p65蛋白表达明显降低，差异有统计学意义（t=2.577，P＜0.05）（图3）。
图4
各组RRVEC中Bcl-2、Bax及Bcl-2/Bax蛋白表达比较。*P＜0.05；**P＜0.01
与对照组比较，高糖组RRVEC中Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，Bcl-2/Bax比值降低，差异均有统计学意义（t=4.362、3.813、6.449，P=0.005、0.009、0.001）。与高糖组比较，姜黄素干预组RRVEC中Bcl-2蛋白表达无明显变化，差异无统计学意义（t=2.148，P=0.075）；Bax蛋白表达明显降低（t=3.059，P=0.022），Bcl-2/Bax比值明显升高（t=3.831，P=0.009），差异均有统计学意义（图4）。
3 讨论
本研究经预实验筛选出葡萄糖及姜黄素对RRVEC增生影响的最佳浓度为30 mmol/L、30 μmol/L。进一步实验结果显示，30 mmol/L高糖作用RRVEC 24 h后细胞内即开始产生大量ROS，而经过30 μmol/L姜黄素作用24 h后，细胞内ROS相对含量显著降低。说明姜黄素可以明显抵抗高糖引起的氧化应激反应。而流式细胞仪检测结果显示，姜黄素对于氧化应激引起的RRVEC凋亡具有明显的抑制作用，从细胞功能学角度证实姜黄素能够保护RRVEC。
Bcl-2、Bax是细胞凋亡的重要相关基因。Bcl-2为抑凋亡基因，Bax为促凋亡基因，且NF-κB调控的下游基因包括Bcl-2、Bax。Bcl-2基因启动子区含有NF-κB的结合位点，NF-κB能够直接上调Bcl-2的表达或通过其他途径促进Bcl-2的表达[18, 19]。为了进一步研究姜黄素抗氧化应激的具体分子机制，我们观察了高糖作用于RRVEC中NF-κB p65、Bcl-2、Bax的蛋白表达变化。免疫组织化学染色观察发现，高糖诱导RRVEC后，其细胞核中的NF-κB p65表达明显升高，而细胞质中NF-κB p65表达降低。说明高糖诱导下，RRVEC细胞质内的NF-κB p65进入细胞核明显增加，并发挥了转录活性；而在姜黄素的干预下，高糖诱导的RRVEC细胞质中NF-κB p65表达降低且进入细胞核明显受到抑制。提示姜黄素能够通过阻断NF-κB信号通路抑制高糖引起的RRVEC氧化应激反应。我们通过Western blot检测发现，经高糖诱导后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表达明显升高，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显降低；而姜黄素干预后RRVEC中NF-κB p65、Bax蛋白表达明显降低，Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax比值明显升高。RRVEC中NF-κB p65蛋白与Bcl-2、Bax蛋白表达以及Bcl-2/Bax比值变化的一致性说明高糖诱导RRVEC可激活NF-κB，进而引起Bcl-2蛋白表达降低、Bax蛋白表达升高。
本研究结果表明，姜黄素能够抑制高糖引起的RRVEC中ROS的产生以及细胞凋亡的发生，其可能机制是抑制NF-κB表达，上调下游抑凋亡基因Bcl-2表达，下调促凋亡基因Bax表达。提示姜黄素能够通过抑制NF-κB通路，对抗氧化应激从而起到保护视网膜血管内皮细胞的作用，而更确切深入的机制尚待进一步的分子生物学研究证实。
