引用本文： 周贤慧, 孟旭霞, 胡迭. 轴突导向因子-1对糖尿病大鼠视网膜Müller细胞活化的影响. 中华眼底病杂志, 2017, 33(5): 527-529. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.020 复制
研究发现，糖尿病（DM）视网膜病变（DR）在视网膜血管发生改变之前其视网膜神经胶质细胞即出现异常[1]。Müller细胞是视网膜最主要的胶质细胞。在DR进程中，异常活化的Müller细胞促进血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子释放，导致视网膜新生血管生成及纤维化[2, 3]。轴突导向因子（netrin-1）是目前已知的最主要神经生长导向因子。近年研究发现，netrin-1在新生血管生成中发挥重要作用[4, 5]。我们推测，如能通过外源性netrin-1早期干预Müller细胞，降低其异常活化，减少视网膜新生血管形成，可能减缓DR进程。为验证这一推测，本研究观察了外源性netrin-1对DM大鼠视网膜Müller细胞活化的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康清洁级成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，体重约250 g，由山东鲁抗医药公司提供。所有动物的饲养及管理均符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。采用随机数字表法将50只大鼠随机分为正常对照组（A组）、正常+平衡盐溶液（BSS）组（B组）、正常+netrin-1 100 μg/ml组（C组）、DM+BSS组（D组）、DM+netrin-1 100 μg/ml组（E组），每组10只。D、E组大鼠按60 mg/kg的剂量，左下腹腔注射链脲佐菌素诱导DM动物模型。以注射72 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM模型建立成功[6]。建模成功率为100%。建模3个月后，C、E组大鼠玻璃体腔分别注射100 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS。A组大鼠不做任何处理。
10%水合氯醛按0.3 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠，行前房穿刺，放出少量房水，微量加样器取5 μl netrin-1自大鼠颞上方角膜缘后1.5～2.0 mm处以45°角刺入玻璃体腔，缓慢注入netrin-1，注射完毕后按压穿刺口3 min，无渗出，涂氧氟沙星眼膏。所有实验大鼠均未出现注射相关的高眼压及巩膜口漏等并发症。
采用免疫组织化学染色法检测大鼠视网膜胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠，迅速摘除眼球作石蜡切片。常规脱蜡和水化后，5%山羊血清封闭，一抗用1:200兔抗大鼠GFAP多克隆抗体，二抗用生物素标记山羊抗兔IgG抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。光学显微镜下观察并照相，以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。采用Image pro plus 6.0软件对图像进行分析。以平均积分吸光度[A，旧称光密度（OD）]值表示视网膜中GFAP的表达量。
采用荧光定量聚合酶链反应检测大鼠视网膜GFAP mRNA表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠。视网膜称重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解视网膜，提取视网膜总RNA，去除RNA内残留的DNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。用GFAP引物SYBR GreenⅠ嵌合荧光法扩增相应基因。GFAP：上游引物5′-ACCGCATCACCATTCCTGTA-3′，下游引物5′-GCACACCTCACATCACATCC-3′。β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环阈值。将A组大鼠视网膜GFAP mRNA表达设定为1，计算其他各组大鼠视网膜GFAP mRNA表达。
采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。定量资料结果以均数±标准差（
）表示，两独立样本间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，A～C组大鼠视网膜仅在神经纤维层及神经节细胞层可见少量GFAP阳性表达。D组大鼠视网膜GFAP阳性表达增强。E组大鼠视网膜GFAP阳性表达较D组减少（图1）。
图1
大鼠视网膜GFAP免疫组织化学染色像。1A. B组；1B. C组；1C. D组；1D. E组。B、C组大鼠视网膜仅在神经纤维层及神经节细胞层可见少量GFAP阳性表达；D组大鼠视网膜GFAP阳性表达增多；E组大鼠视网膜GFAP阳性表达较D组减少 DAB ×40
A～E组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=203.43、72.91，P=0.00、0.00）（表1）。与A组比较，D组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达明显增多，差异有统计学意义（t=−26.01、22.26，P=0.00、0.00）。E组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达较D组明显下降（t=−10.78、3.93，P=0.00、0.00）；但仍高于A组（t=7.00、−9.82，P=0.00、0.00），差异均有统计学意义。A、C组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较，差异均无统计学意义（t=−0.29、0.50，P=0.77、0.62）。
表1
各组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较（
）
3 讨论
Müller细胞是视网膜最主要的胶质细胞，位于视网膜内界膜与外界膜之间，横跨整个视网膜；参与构成血视网膜屏障，支撑视网膜结构，释放神经递质和营养因子，保护及营养视神经细胞等重要作用[7]。GFAP是胶质细胞的特异性标记物。正常大鼠Müller细胞极少甚至不表达GFAP；而在DR中，Müller细胞异常活化，分泌生长因子和炎性介质，导致视网膜神经细胞和毛细血管内皮细胞功能障碍、周细胞凋亡，促进视网膜新生血管形成[8, 9]。Fu等[10]发现，Müller细胞在DM视神经细胞存活过程中也发挥重要作用。因此，保护DM大鼠Müller细胞，减少其异常活化显得尤为重要。
Netrin-1是目前已知的最主要神经导向因子，介导细胞迁移、黏附、分化和新生血管生成等作用[4, 5]。DR时，视网膜胶质细胞异常活化神经元细胞凋亡[11]，视网膜血管通透性改变，新生血管生成；而netrin-1具有介导突触生长，保护神经元及降低视网膜血管通透性的作用[12]。我们不禁假设netrin-1是否在两者之间存在某种共通性，是否在DR中起到“桥梁”作用，是否对胶质细胞的活化有影响，而Müller细胞作为主要的胶质细胞成为观察焦点。本研究结果显示，D、E组大鼠Müller细胞活化明显增加，其标志物GFAP阳性表达增多，GFAP mRNA随之升高；当给予外源性netrin-1干预时，视网膜GFAP表达降低，Müller细胞活性下降，但仍未能恢复至正常水平。而A、C组大鼠视网膜GFAP表达之间无明显差异。据此我们推测，100 μg/ml的外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller细胞的活化，减慢DR进程，但是不能阻止DR进展。此外，我们还发现外源性netrin-1对正常大鼠Müller细胞的活化无明显影响。
本研究结果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller细胞的活化，但其具体机制及信号转导通路目前尚不明确。我们前期研究发现，netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性[16]。但具体是netrin-1通过保护Müller细胞来降低视网膜血管通透性，抑或是通过降低视网膜血管通透性打破神经-血管环路的恶性循环来降低Müller细胞的活性，目前仍不清楚。这需要我们在分子生物学水平对Müller细胞进行干预以及进一步的实验数据支持。此外，本研究尚未对神经元细胞凋亡进行观察，这将是我们下一步的研究重点。
志谢 感谢烟台市业达医院眼科姜文科、刘晓玲医师对文稿撰写提供的帮助
研究发现，糖尿病（DM）视网膜病变（DR）在视网膜血管发生改变之前其视网膜神经胶质细胞即出现异常[1]。Müller细胞是视网膜最主要的胶质细胞。在DR进程中，异常活化的Müller细胞促进血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子释放，导致视网膜新生血管生成及纤维化[2, 3]。轴突导向因子（netrin-1）是目前已知的最主要神经生长导向因子。近年研究发现，netrin-1在新生血管生成中发挥重要作用[4, 5]。我们推测，如能通过外源性netrin-1早期干预Müller细胞，降低其异常活化，减少视网膜新生血管形成，可能减缓DR进程。为验证这一推测，本研究观察了外源性netrin-1对DM大鼠视网膜Müller细胞活化的影响。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康清洁级成年雄性Sprague-Dawley大鼠50只，体重约250 g，由山东鲁抗医药公司提供。所有动物的饲养及管理均符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。采用随机数字表法将50只大鼠随机分为正常对照组（A组）、正常+平衡盐溶液（BSS）组（B组）、正常+netrin-1 100 μg/ml组（C组）、DM+BSS组（D组）、DM+netrin-1 100 μg/ml组（E组），每组10只。D、E组大鼠按60 mg/kg的剂量，左下腹腔注射链脲佐菌素诱导DM动物模型。以注射72 h后空腹血糖≥16.5 mmol/L为DM模型建立成功[6]。建模成功率为100%。建模3个月后，C、E组大鼠玻璃体腔分别注射100 μg/ml netrin-1 5 μl。B、D组大鼠玻璃体腔注射等体积BSS。A组大鼠不做任何处理。
10%水合氯醛按0.3 ml/100 g剂量腹腔注射麻醉大鼠，行前房穿刺，放出少量房水，微量加样器取5 μl netrin-1自大鼠颞上方角膜缘后1.5～2.0 mm处以45°角刺入玻璃体腔，缓慢注入netrin-1，注射完毕后按压穿刺口3 min，无渗出，涂氧氟沙星眼膏。所有实验大鼠均未出现注射相关的高眼压及巩膜口漏等并发症。
采用免疫组织化学染色法检测大鼠视网膜胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠，迅速摘除眼球作石蜡切片。常规脱蜡和水化后，5%山羊血清封闭，一抗用1:200兔抗大鼠GFAP多克隆抗体，二抗用生物素标记山羊抗兔IgG抗体，二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木精复染，中性树胶封片。光学显微镜下观察并照相，以血管内皮细胞膜呈棕黄色为阳性表达。采用Image pro plus 6.0软件对图像进行分析。以平均积分吸光度[A，旧称光密度（OD）]值表示视网膜中GFAP的表达量。
采用荧光定量聚合酶链反应检测大鼠视网膜GFAP mRNA表达。玻璃体腔注射netrin-1后1个月，过量麻醉处死大鼠。视网膜称重，按照每50～l00 mg加1 ml RNAiso Plus裂解视网膜，提取视网膜总RNA，去除RNA内残留的DNA，逆转录成cDNA，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参照。用GFAP引物SYBR GreenⅠ嵌合荧光法扩增相应基因。GFAP：上游引物5′-ACCGCATCACCATTCCTGTA-3′，下游引物5′-GCACACCTCACATCACATCC-3′。β-actin：上游引物5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游引物5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。退火温度60℃，40个循环后形成扩增曲线，记录荧光值到达阈值时所经历的循环阈值。将A组大鼠视网膜GFAP mRNA表达设定为1，计算其他各组大鼠视网膜GFAP mRNA表达。
采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。定量资料结果以均数±标准差（
）表示，两独立样本间比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，A～C组大鼠视网膜仅在神经纤维层及神经节细胞层可见少量GFAP阳性表达。D组大鼠视网膜GFAP阳性表达增强。E组大鼠视网膜GFAP阳性表达较D组减少（图1）。
图1
大鼠视网膜GFAP免疫组织化学染色像。1A. B组；1B. C组；1C. D组；1D. E组。B、C组大鼠视网膜仅在神经纤维层及神经节细胞层可见少量GFAP阳性表达；D组大鼠视网膜GFAP阳性表达增多；E组大鼠视网膜GFAP阳性表达较D组减少 DAB ×40
A～E组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=203.43、72.91，P=0.00、0.00）（表1）。与A组比较，D组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达明显增多，差异有统计学意义（t=−26.01、22.26，P=0.00、0.00）。E组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达较D组明显下降（t=−10.78、3.93，P=0.00、0.00）；但仍高于A组（t=7.00、−9.82，P=0.00、0.00），差异均有统计学意义。A、C组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较，差异均无统计学意义（t=−0.29、0.50，P=0.77、0.62）。
表1
各组大鼠视网膜GFAP阳性表达、mRNA表达比较（
）
3 讨论
Müller细胞是视网膜最主要的胶质细胞，位于视网膜内界膜与外界膜之间，横跨整个视网膜；参与构成血视网膜屏障，支撑视网膜结构，释放神经递质和营养因子，保护及营养视神经细胞等重要作用[7]。GFAP是胶质细胞的特异性标记物。正常大鼠Müller细胞极少甚至不表达GFAP；而在DR中，Müller细胞异常活化，分泌生长因子和炎性介质，导致视网膜神经细胞和毛细血管内皮细胞功能障碍、周细胞凋亡，促进视网膜新生血管形成[8, 9]。Fu等[10]发现，Müller细胞在DM视神经细胞存活过程中也发挥重要作用。因此，保护DM大鼠Müller细胞，减少其异常活化显得尤为重要。
Netrin-1是目前已知的最主要神经导向因子，介导细胞迁移、黏附、分化和新生血管生成等作用[4, 5]。DR时，视网膜胶质细胞异常活化神经元细胞凋亡[11]，视网膜血管通透性改变，新生血管生成；而netrin-1具有介导突触生长，保护神经元及降低视网膜血管通透性的作用[12]。我们不禁假设netrin-1是否在两者之间存在某种共通性，是否在DR中起到“桥梁”作用，是否对胶质细胞的活化有影响，而Müller细胞作为主要的胶质细胞成为观察焦点。本研究结果显示，D、E组大鼠Müller细胞活化明显增加，其标志物GFAP阳性表达增多，GFAP mRNA随之升高；当给予外源性netrin-1干预时，视网膜GFAP表达降低，Müller细胞活性下降，但仍未能恢复至正常水平。而A、C组大鼠视网膜GFAP表达之间无明显差异。据此我们推测，100 μg/ml的外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller细胞的活化，减慢DR进程，但是不能阻止DR进展。此外，我们还发现外源性netrin-1对正常大鼠Müller细胞的活化无明显影响。
本研究结果表明，外源性netrin-1可降低DM大鼠Müller细胞的活化，但其具体机制及信号转导通路目前尚不明确。我们前期研究发现，netrin-1可降低DM大鼠视网膜血管通透性[16]。但具体是netrin-1通过保护Müller细胞来降低视网膜血管通透性，抑或是通过降低视网膜血管通透性打破神经-血管环路的恶性循环来降低Müller细胞的活性，目前仍不清楚。这需要我们在分子生物学水平对Müller细胞进行干预以及进一步的实验数据支持。此外，本研究尚未对神经元细胞凋亡进行观察，这将是我们下一步的研究重点。
志谢 感谢烟台市业达医院眼科姜文科、刘晓玲医师对文稿撰写提供的帮助
