Ras同源蛋白（Rho）/Rho激酶（ROCK）通路是广泛存在于人和哺乳动物细胞内的一种信号传导通路，与视神经损害后修复受抑制密切相关。视神经损伤后，活化的Rho水平升高，ROCK表达上调，并激活其下游一系列串联反应产生抑制轴突延伸和神经修复的效应；而ROCK抑制剂可阻断这一过程，促进损伤视神经的修复，保护受损视网膜神经节细胞并促进轴突再生和延伸，还能抑制瘢痕形成、降低眼压以及可能存在一定的抗炎作用。目前，部分种类的ROCK抑制剂已投入临床使用，其应用价值日益凸显，有望成为视神经疾病的新一代治疗药物。
引用本文： 王晓玲, 陈长征. Ras同源蛋白/ras同源蛋白激酶通路及其抑制剂在视神经疾病中的作用研究现状. 中华眼底病杂志, 2017, 33(5): 548-550. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2017.05.031 复制
Ras同源蛋白（Rho）是鸟苷酸结合蛋白偶联受体膜受体超家族的一员，与视网膜炎症反应、新生血管生成、神经元和神经胶质细胞损伤等有关[1]。Rho/Rho激酶（ROCK）通路是广泛存在于人和哺乳动物细胞内的一种信号传导通路，与视神经损害后修复受抑制密切相关[2]。目前国内针对Rho/ROCK的研究多集中在视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变等视网膜变性性疾病和血管性疾病[1, 3]，而对其在视神经疾病中的作用并不清楚。现就Rho/ROCK通路及其抑制剂在视神经疾病中的作用研究现状进行综述，为临床探寻Rho/ROCK通路抑制损害后视神经修复困难的机制及ROCK抑制剂的神经保护作用提供理论依据。
1 Rho/ROCK通路与ROCK抑制剂
Rho是一种存在于细胞质内的三磷酸鸟苷（GTP）磷酸酶，其与GTP结合，催化GTP水解为二磷酸鸟苷，产生的高能磷酸键激活ROCK，随后继续磷酸化其下游信号分子[4]。ROCK属于丝氨酸-苏氨酸家族的蛋白，包括ROCK-Ⅰ（p160 ROCK或ROCKβ）和ROCK-Ⅱ（ROCKα）两种亚型。Fujisawa等[5]发现，ROCK-Ⅰ在人类除脑组织外的包括心脏、胰腺、肺、肝、骨骼肌以及肾脏在内的绝大多脏器中均有表达。Takahashi等[6]于1999年成功从人脑组织的cDNA库中分离出ROCK-Ⅱ亚型。Nakagawa等[7]在动物实验中发现，ROCK-Ⅰ和ROCK-Ⅱ在鼠体内包括脑在内的所有组织均有表达，但ROCK-Ⅰ优先表达在肝、脾和肾，而ROCK-Ⅱ优先表达在脑和骨骼肌。ROCK表达受其上游信号分子的调节，其上游信号分子有髓磷脂相关性糖蛋白（MAG）、神经突增生抑制剂（Nogo）、少突细胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）、硫酸软骨素蛋白聚糖等4种髓磷脂相关蛋白[8-10]。ROCK下游效应器包括肌球蛋白轻链（MLC）及MLC磷酸酶、LIM激酶（LIMK）、ERM家族、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、核因子-κB、微管结合蛋白（MAPs）、脑衰蛋白调停蛋白2、张力蛋白同系物（PTEN）。其中，PTEN与神经元存活和轴突再生密切相关[11]；MAPs促进神经突延伸[12]。GFAP是一种中间丝状体蛋白，大量表达于星型胶质细胞，在修补神经系统损伤以及形成胶质瘢痕方面起重要作用[13]。
ROCK抑制剂通过抑制ROCK及其下游效应器的功能发挥神经元保护及促进轴突延伸的作用，且该作用已在青光眼、神经元变性等疾病中被证实[14-16]。目前用于研究的ROCK抑制剂包括Y-39983、Y-27632、二甲基法舒地尔（Dimethylfasudil或H-1152）、法舒地尔（fasudil或HA-1077）和K-115（ripasudil）等。并非所有ROCK抑制剂均有促进轴突延伸的作用；其中，法舒地尔仅促进神经胶质细胞的活动，保护幸存神经元，但无促进轴突延伸的作用[17]。
2 Rho/ROCK通路及其抑制剂在青光眼中的作用
青光眼是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的慢性神经变性疾病[18]。高眼压的机械压迫或血管因素造成视网膜缺血、视网膜神经节细胞（RGC）能量供应不足，进而导致RGC死亡和轴突破坏[19]。青光眼患者的病情进展与视神经及RGC的损害密切相关。因此，对视神经及RGC进行保护可减缓青光眼患者的病情进展。青光眼患者RGC死亡机制推测与缺血损害、一氧化氮（NO）诱导的氧化损伤以及谷氨酸盐兴奋性中毒有关。其中，氧化应激损伤与ROCK通路密切相关[20]。Yamamoto等[21]研究表明，在青光眼的视神经损伤动物模型中，活化的Rho水平升高，ROCK表达加强，作为媒介的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平随之升高，氧化产物堆积，最终导致RGC死亡。
ROCK抑制剂可以抑制ROCK继续磷酸化其下游效应器MLC，重塑细胞骨架结构，降低小梁网的水密性，促进房水通过小梁网排入Schlemm’s管；同时，还可减小Schlemm’s管内壁细胞单层分子跨上皮电阻及管壁细胞内蛋白复合体的紧密连接，增加其通透性，促进房水排出进而达到降低眼压的效果[22, 23]。Kaneko等[23]发现，对于正常眼压的家兔和猴，Y-27632、fasudil和K-115等ROCK抑制剂与拉坦前列素、噻吗洛尔和布那唑嗪等降眼压药物能取得相同的降压效果；其中，K-115的有效药物浓度较Y-27632和fasudil更低，且为首个在日本获批应用于青光眼的ROCK抑制剂。因ROCK抑制剂降眼压机制与碳酸酐酶抑制剂、前列腺素类及β2肾上腺素受体阻滞剂等各不相同，ROCK抑制剂有望与以上各类药物协同降眼压。此外，ROCK抑制剂还可抑制纤维母细胞过度分化为肌成纤维细胞，抑制瘢痕形成，提高滤过手术效果[24, 25]。
ROCK抑制剂可通过抑制ROCK的表达阻断氧化应激过程，减少氧化产物堆积，提高RGC存活率。Yamamoto等[21]发现，K-115和法舒地尔两种ROCK抑制剂均能发挥间接抑制氧化产物堆积的作用，达到保护RGC的目的。Koch和Lingor[26]在实验中也得出了相同结论，即在青光眼动物模型和患者的视网膜内ROCK表达上调，而当抑制ROCK表达时，轴突变性速度减慢，RGC存活率增加。完整的RGC为轴突的延伸提供有利条件。此外，ROCK抑制剂还可解除受损视神经周围的抑制环境来达到促进轴突延伸的目的[27]。这些研究结果说明ROCK通路的表达与青光眼疾病进展有关，ROCK抑制剂具有保护RGC并促进轴突延伸的作用。提示ROCK抑制剂有望成为新一代青光眼治疗药物。
3 Rho/ROCK通路及其抑制剂在视神经机械性损伤中的作用
视神经机械性损伤是指挤压、外伤或钳夹等机械因素造成血管营养障碍、急性压迫性损伤、视神经鞘内出血、视神经挫裂或离断，导致视神经功能部分或全部丧失，进而出现逆行性RGC死亡[28]。与此同时，机体自我修复机制启动，但受损神经的修复不仅与其自身细胞性能有关，还与细胞周围环境密切相关。MAG、Nogo、OMgp等ROCK上游信号分子广泛存在于病变位置的少突细胞胞膜和胶质瘢痕处，这些信号分子通过ROCK通路继续磷酸化其下游的LIMK，导致神经细胞的生长锥萎陷，轴突再生障碍，而这一串联效应可被ROCK通路抑制剂阻断[29, 30]。Yang等[14]在大鼠视神经钳夹伤（ONC）模型的实验中发现，ONC+Y-39983组存活RGC密度和轴突数目均明显高于ONC+磷酸盐缓冲液（PBS）组。正常对照组、ONC+PBS组以及ONC+Y-39983组各组间总的Rho蛋白水平不变；但ONC+PBS组视网膜和视神经内活化的Rho水平升高，ROCK mRNA表达上调；而ONC+Y-39983组活化的Rho水平降低，ROCK mRNA表达下调。说明Y-39983可通过抑制活化的Rho水平及ROCK mRNA表达发挥促进RGC存活及轴突生长的作用。Sagawa等[30]研究证实，Y-39983增加延伸轴突数目的作用强于Y-27632，前者效力约为后者的30倍；在各自促进轴突延长的最适浓度下，两组轴突延伸的长度无明显差异；同时，2周内重复或连续给药可以进一步促进轴突延伸，但过高的药物浓度会对轴突延伸产生抑制作用。
4 Rho/ROCK通路及其抑制剂在非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）中的作用
NAION是一种多发于老年人的视神经缺血、缺氧性损害，轴突损害后，神经细胞周围的抑制性环境强烈抑制轴突再生，随后导致RGC死亡，进而出现视神经功能障碍[31, 32]。视神经缺血梗死后，RGC层活化的Rho水平逐渐升高，下游后续反应与视神经挫伤具有一定的相似性，均出现神经损伤修复困难的现象；同时，伴随血视网膜屏障的破坏，多核白细胞迅速聚集、浸润，在梗死区域的视神经及RGC层内，巨噬细胞及小胶质细胞等炎性细胞水平随之升高，且与活化的Rho水平变化趋势及达峰时间呈现高度一致性。
ROCK抑制剂可促进NO合酶的表达，提高血管内皮中NO浓度，抑制其下游MLC的磷酸化，降低血管紧张度，从而增加视神经血流量，提高RGC存活率，同时为轴突修复提供有利条件。此外，ROCK抑制剂还参与介导炎性细胞的迁移，抑制炎症反应[33]。Hayreh和Zimmerman[34]在应用玻璃体腔注射法舒地尔治疗NAION的临床研究中发现，与NAION自然病程视力预后相比，玻璃体腔注射法舒地尔组视力预后更好。ROCK抑制剂对NAION有一定疗效，但具体机制尚缺乏相关研究，可能与ROCK抑制剂舒张血管、保护神经元及其抗炎作用有关[35-37]。
Ras同源蛋白（Rho）是鸟苷酸结合蛋白偶联受体膜受体超家族的一员，与视网膜炎症反应、新生血管生成、神经元和神经胶质细胞损伤等有关[1]。Rho/Rho激酶（ROCK）通路是广泛存在于人和哺乳动物细胞内的一种信号传导通路，与视神经损害后修复受抑制密切相关[2]。目前国内针对Rho/ROCK的研究多集中在视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变等视网膜变性性疾病和血管性疾病[1, 3]，而对其在视神经疾病中的作用并不清楚。现就Rho/ROCK通路及其抑制剂在视神经疾病中的作用研究现状进行综述，为临床探寻Rho/ROCK通路抑制损害后视神经修复困难的机制及ROCK抑制剂的神经保护作用提供理论依据。
1 Rho/ROCK通路与ROCK抑制剂
Rho是一种存在于细胞质内的三磷酸鸟苷（GTP）磷酸酶，其与GTP结合，催化GTP水解为二磷酸鸟苷，产生的高能磷酸键激活ROCK，随后继续磷酸化其下游信号分子[4]。ROCK属于丝氨酸-苏氨酸家族的蛋白，包括ROCK-Ⅰ（p160 ROCK或ROCKβ）和ROCK-Ⅱ（ROCKα）两种亚型。Fujisawa等[5]发现，ROCK-Ⅰ在人类除脑组织外的包括心脏、胰腺、肺、肝、骨骼肌以及肾脏在内的绝大多脏器中均有表达。Takahashi等[6]于1999年成功从人脑组织的cDNA库中分离出ROCK-Ⅱ亚型。Nakagawa等[7]在动物实验中发现，ROCK-Ⅰ和ROCK-Ⅱ在鼠体内包括脑在内的所有组织均有表达，但ROCK-Ⅰ优先表达在肝、脾和肾，而ROCK-Ⅱ优先表达在脑和骨骼肌。ROCK表达受其上游信号分子的调节，其上游信号分子有髓磷脂相关性糖蛋白（MAG）、神经突增生抑制剂（Nogo）、少突细胞髓磷脂糖蛋白（OMgp）、硫酸软骨素蛋白聚糖等4种髓磷脂相关蛋白[8-10]。ROCK下游效应器包括肌球蛋白轻链（MLC）及MLC磷酸酶、LIM激酶（LIMK）、ERM家族、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、核因子-κB、微管结合蛋白（MAPs）、脑衰蛋白调停蛋白2、张力蛋白同系物（PTEN）。其中，PTEN与神经元存活和轴突再生密切相关[11]；MAPs促进神经突延伸[12]。GFAP是一种中间丝状体蛋白，大量表达于星型胶质细胞，在修补神经系统损伤以及形成胶质瘢痕方面起重要作用[13]。
ROCK抑制剂通过抑制ROCK及其下游效应器的功能发挥神经元保护及促进轴突延伸的作用，且该作用已在青光眼、神经元变性等疾病中被证实[14-16]。目前用于研究的ROCK抑制剂包括Y-39983、Y-27632、二甲基法舒地尔（Dimethylfasudil或H-1152）、法舒地尔（fasudil或HA-1077）和K-115（ripasudil）等。并非所有ROCK抑制剂均有促进轴突延伸的作用；其中，法舒地尔仅促进神经胶质细胞的活动，保护幸存神经元，但无促进轴突延伸的作用[17]。
2 Rho/ROCK通路及其抑制剂在青光眼中的作用
青光眼是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的慢性神经变性疾病[18]。高眼压的机械压迫或血管因素造成视网膜缺血、视网膜神经节细胞（RGC）能量供应不足，进而导致RGC死亡和轴突破坏[19]。青光眼患者的病情进展与视神经及RGC的损害密切相关。因此，对视神经及RGC进行保护可减缓青光眼患者的病情进展。青光眼患者RGC死亡机制推测与缺血损害、一氧化氮（NO）诱导的氧化损伤以及谷氨酸盐兴奋性中毒有关。其中，氧化应激损伤与ROCK通路密切相关[20]。Yamamoto等[21]研究表明，在青光眼的视神经损伤动物模型中，活化的Rho水平升高，ROCK表达加强，作为媒介的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶mRNA水平随之升高，氧化产物堆积，最终导致RGC死亡。
ROCK抑制剂可以抑制ROCK继续磷酸化其下游效应器MLC，重塑细胞骨架结构，降低小梁网的水密性，促进房水通过小梁网排入Schlemm’s管；同时，还可减小Schlemm’s管内壁细胞单层分子跨上皮电阻及管壁细胞内蛋白复合体的紧密连接，增加其通透性，促进房水排出进而达到降低眼压的效果[22, 23]。Kaneko等[23]发现，对于正常眼压的家兔和猴，Y-27632、fasudil和K-115等ROCK抑制剂与拉坦前列素、噻吗洛尔和布那唑嗪等降眼压药物能取得相同的降压效果；其中，K-115的有效药物浓度较Y-27632和fasudil更低，且为首个在日本获批应用于青光眼的ROCK抑制剂。因ROCK抑制剂降眼压机制与碳酸酐酶抑制剂、前列腺素类及β2肾上腺素受体阻滞剂等各不相同，ROCK抑制剂有望与以上各类药物协同降眼压。此外，ROCK抑制剂还可抑制纤维母细胞过度分化为肌成纤维细胞，抑制瘢痕形成，提高滤过手术效果[24, 25]。
ROCK抑制剂可通过抑制ROCK的表达阻断氧化应激过程，减少氧化产物堆积，提高RGC存活率。Yamamoto等[21]发现，K-115和法舒地尔两种ROCK抑制剂均能发挥间接抑制氧化产物堆积的作用，达到保护RGC的目的。Koch和Lingor[26]在实验中也得出了相同结论，即在青光眼动物模型和患者的视网膜内ROCK表达上调，而当抑制ROCK表达时，轴突变性速度减慢，RGC存活率增加。完整的RGC为轴突的延伸提供有利条件。此外，ROCK抑制剂还可解除受损视神经周围的抑制环境来达到促进轴突延伸的目的[27]。这些研究结果说明ROCK通路的表达与青光眼疾病进展有关，ROCK抑制剂具有保护RGC并促进轴突延伸的作用。提示ROCK抑制剂有望成为新一代青光眼治疗药物。
3 Rho/ROCK通路及其抑制剂在视神经机械性损伤中的作用
视神经机械性损伤是指挤压、外伤或钳夹等机械因素造成血管营养障碍、急性压迫性损伤、视神经鞘内出血、视神经挫裂或离断，导致视神经功能部分或全部丧失，进而出现逆行性RGC死亡[28]。与此同时，机体自我修复机制启动，但受损神经的修复不仅与其自身细胞性能有关，还与细胞周围环境密切相关。MAG、Nogo、OMgp等ROCK上游信号分子广泛存在于病变位置的少突细胞胞膜和胶质瘢痕处，这些信号分子通过ROCK通路继续磷酸化其下游的LIMK，导致神经细胞的生长锥萎陷，轴突再生障碍，而这一串联效应可被ROCK通路抑制剂阻断[29, 30]。Yang等[14]在大鼠视神经钳夹伤（ONC）模型的实验中发现，ONC+Y-39983组存活RGC密度和轴突数目均明显高于ONC+磷酸盐缓冲液（PBS）组。正常对照组、ONC+PBS组以及ONC+Y-39983组各组间总的Rho蛋白水平不变；但ONC+PBS组视网膜和视神经内活化的Rho水平升高，ROCK mRNA表达上调；而ONC+Y-39983组活化的Rho水平降低，ROCK mRNA表达下调。说明Y-39983可通过抑制活化的Rho水平及ROCK mRNA表达发挥促进RGC存活及轴突生长的作用。Sagawa等[30]研究证实，Y-39983增加延伸轴突数目的作用强于Y-27632，前者效力约为后者的30倍；在各自促进轴突延长的最适浓度下，两组轴突延伸的长度无明显差异；同时，2周内重复或连续给药可以进一步促进轴突延伸，但过高的药物浓度会对轴突延伸产生抑制作用。
4 Rho/ROCK通路及其抑制剂在非动脉炎性前部缺血性视神经病变（NAION）中的作用
NAION是一种多发于老年人的视神经缺血、缺氧性损害，轴突损害后，神经细胞周围的抑制性环境强烈抑制轴突再生，随后导致RGC死亡，进而出现视神经功能障碍[31, 32]。视神经缺血梗死后，RGC层活化的Rho水平逐渐升高，下游后续反应与视神经挫伤具有一定的相似性，均出现神经损伤修复困难的现象；同时，伴随血视网膜屏障的破坏，多核白细胞迅速聚集、浸润，在梗死区域的视神经及RGC层内，巨噬细胞及小胶质细胞等炎性细胞水平随之升高，且与活化的Rho水平变化趋势及达峰时间呈现高度一致性。
ROCK抑制剂可促进NO合酶的表达，提高血管内皮中NO浓度，抑制其下游MLC的磷酸化，降低血管紧张度，从而增加视神经血流量，提高RGC存活率，同时为轴突修复提供有利条件。此外，ROCK抑制剂还参与介导炎性细胞的迁移，抑制炎症反应[33]。Hayreh和Zimmerman[34]在应用玻璃体腔注射法舒地尔治疗NAION的临床研究中发现，与NAION自然病程视力预后相比，玻璃体腔注射法舒地尔组视力预后更好。ROCK抑制剂对NAION有一定疗效，但具体机制尚缺乏相关研究，可能与ROCK抑制剂舒张血管、保护神经元及其抗炎作用有关[35-37]。