引用本文： 秦廷玉, 高莎莎, 王文战. 雷公藤红素对交感性眼炎患者外周血单个核细胞分泌白细胞介素17的抑制作用. 中华眼底病杂志, 2018, 34(1): 51-54. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.01.013 复制
交感性眼炎（SO）是发生于单眼穿通伤或眼内手术后的一种双眼肉芽肿性葡萄膜炎，属于自身免疫性疾病，其病因与发病机制尚不完全清楚[1, 2]。研究表明，SO与体内CD4+ T细胞分泌的白细胞介素（IL）-17 增多密切相关[2-6]。IL-17与IL-23组成IL-23/IL-17通路在自身免疫性疾病中发挥重要作用[7-11]。Chi等[12, 13]研究发现，Vogt-Koyanagi-Harada综合征和Behçet病等葡萄膜炎患者的外周血单个核细胞（PBMCs）培养上清液中IL-23、IL-17含量较正常人明显升高，且IL-23可以明显促进IL-17产生。但目前有关IL-23/IL-17通路在SO发生发展中的作用及机制不明确，因此也缺乏抑制该通路在SO中发挥作用的有效药物。雷公藤红素属于醌甲基三萜，是从雷公藤根皮中分离得到的第一个天然活性产物；其具有免疫抑制作用，已被广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病[14]。但关于雷公藤红素对SO是否具有相同的治疗作用目前尚不清楚。为此，我们观察了雷公藤红素对SO患者PBMCs分泌IL-17的抑制作用，并初步探讨了其可能机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
淋巴细胞分离液（上海生物工程公司），1640细胞培养液（美国Gibcol BRL公司）。雷公藤红素、金黄色葡萄球菌CowanⅠ株（SAC）（美国Sigma-Aldrich公司）。抗CD3、抗CD28抗体（美国eBioscience公司），重组人IL-23（rIL-23，美国R&D Systems公司），人IL-23酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Bender MedSystems公司），人IL-17 Duoset ELISA检测试剂盒（美国R&D Systems公司）。96孔平底细胞培养板（美国Costar公司）。
在郑州大学第一附属医院眼科首次确诊为活动期SO的10例患者纳入本研究。其中，男性8例，女性2例；年龄19～62岁，平均年龄（38.60±12.68）岁。所有患者病程＜2个月，均符合活动期SO的诊断标准[15, 16]。患者均未使用过糖皮质激素和其他免疫抑制剂治疗。选取患者家属或健康志愿者10名作为对照。其中，男性7例，女性3例；年龄24～69岁，平均年龄（41.90±14.22）岁。两组患者年龄（t=0.55，P=0.59）、性别分布比较（χ2=0.27，P=0.61）比较，差异均无统计学意义。所有参与者均签署知情同意书。
采用密度梯度离心法分离PBMCs。取参与者静脉血15～20 ml，加入10～25 U/ml肝素抗凝离心管内。将抗凝血缓慢加入淋巴细胞分离液面上（分离液：抗凝血=1.0:1.5）。室温800×g离心20 min。沿离心管管壁周围吸出细胞层，移入另一试管。磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞2次，以离心半径12 cm、转速800 r/min离心8 min。加入1 ml 1640细胞培养液，混匀，计数细胞。置于完全1640细胞培养液中，放入5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。
调整PBMCs细胞浓度至2×106个/m1，200 μl/孔，置于96孔板中培养。将细胞分为A～D组。A组为正常人PBMCs；B组为SO患者PBMCs；C组为SO患者PBMCs，并在其培养液中加入0.5 μmol/L的雷公藤红素；D组为SO患者PBMCs，并在其培养液中加入1.0 μmol/L的雷公藤红素。每组设3个复孔，每孔加入SAC（1:500）刺激3 d，用于检测IL-23含量；每孔加入抗CD3抗体（5 mg/ml）和抗CD28抗体（1 mg/ml）刺激3 d，用于检测IL-17含量。重新取细胞培养后，向A、B组加入50 ng/ml rIL-23分别作为A1、B1组。再重新取细胞培养后，向A、B组加入50 ng/ml rIL-23+1 μmol/L雷公藤红素分别作为A2、B2组。每组设3个复孔，每孔加入抗CD3抗体（5 mg/ml）和抗CD28抗体（1 mg/ml）刺激3 d，用于检测IL-17含量。将96孔板置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养72 h。终止培养后收集上清液，−70℃保存。用ELISA检测血清和PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17的含量。用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。
采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。数据资料经W检验呈正态分布，以均数±标准差（
）表示。组间比较采用方差分析，组间两两比较采用独立样本 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
A～D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量分别为（228.43±17.27）、（513.85±36.46）、（381.07±20.93）、（237.14±17.97）pg/ml。4组间比较，差异有统计学意义（F=306.65，P=0.00）。A组与B组（t=22.37，P=0.00）、A组与C组（t=17.79，P=0.00）、B组与C组（t=9.99，P=0.00）、B组与D组（t=21.53，P=0.00）、C组与D组（t=16.50，P=0.00）PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量两两比较，差异均有统计学意义。A组与D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量比较，差异无统计学意义（t=1.11，P=0.28）（图1）。
图1
各组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量比较
A～D组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别为（220.55±31.15）、（866.77±72.92）、（517.43±54.87）、（242.89±34.09）pg/ml。4组间比较，差异有统计学意义（F=348.24，P=0.00）。A组与B组（t=25.77，P=0.00）、A组与C组（t=14.88，P=0.00）、B组与C组（t=12.11，P=0.00）、B组与D组（t=24.51，P=0.00）、C组与D组（t=13.44，P=0.00）PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量两两比较，差异均有统计学意义。A组与D组PBMCs细胞培养上清液中IL-17的含量比较，差异无统计学意义（t=1.53，P=0.14）（图2）。
图2
各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
重新取细胞培养后，A、A1、B、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量为（215.63±20.31）、（417.33±22.05）、（865.47±74.89）、（1373.13±92.95）pg/ml。A1、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别较A、B组增加，差异均有统计学意义（t=21.28、13.45，P=0.00、0.00）（图3）。
图3
重新取细胞培养后各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
再次取细胞培养后，A1、A2、B1、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别为（428.43±24.53）、（229.15±23.28）、（1373.39±89.51）、（571.01±94.88）pg/ml。A2、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别较A1、B1组明显降低，差异均有统计学意义（t=18.63、19.45，P=0.00、0.00）（图4）。
图4
再次取细胞培养后各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
3 讨论
本研究结果显示，B组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量均高于A组；A1组、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量分别高于A、B组。说明SO患者PBMCs分泌的IL-17较正常健康者更多，而IL-23能促进正常健康者或SO患者的PBMCs分泌更多的IL-17；这与以往其他类型葡萄膜炎的研究结果相似，提示IL-23/IL-17通路在SO的发生发展中可能发挥重要作用。
雷公藤红素具有抗炎及免疫抑制、诱导细胞凋亡和抗肿瘤等作用，已被广泛应用于一些自身免疫性疾病的治疗[14, 17]。本研究结果显示，C、D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量均较B组明显降低，且D组与A组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量无明显差异；A2、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量分别较A1、B1组明显降低。说明雷公藤红素不仅可以明显抑制SO患者PBMCs分泌IL-23和IL-17，而且可以抑制rIL-23刺激正常健康者和SO患者PBMCs分泌IL-17。提示雷公藤红素抑制PBMCs分泌IL-17可能是通过抑制IL-23的分泌而发挥作用，为今后更深入的研究指明了方向。
本研究结果表明，雷公藤红素可以抑制SO患者PBMCs分泌IL-17，其机制可能与抑制IL-23/IL-17通路发挥作用有关；但是否还有别的细胞因子参与其中或是雷公藤红素通过影响哪些细胞信号通路发挥作用尚不清楚。另外，目前只针对PBMCs进行研究还不够，今后研究应增加T细胞亚群流式检测和增生实验，测试雷公藤红素对T细胞亚群分泌细胞因子的影响。待体外实验研究较为完整时，再进行动物体内实验，观察雷公藤红素对动物体内T细胞分泌IL-23、IL-17等细胞因子的影响，并探讨其机制。
交感性眼炎（SO）是发生于单眼穿通伤或眼内手术后的一种双眼肉芽肿性葡萄膜炎，属于自身免疫性疾病，其病因与发病机制尚不完全清楚[1, 2]。研究表明，SO与体内CD4+ T细胞分泌的白细胞介素（IL）-17 增多密切相关[2-6]。IL-17与IL-23组成IL-23/IL-17通路在自身免疫性疾病中发挥重要作用[7-11]。Chi等[12, 13]研究发现，Vogt-Koyanagi-Harada综合征和Behçet病等葡萄膜炎患者的外周血单个核细胞（PBMCs）培养上清液中IL-23、IL-17含量较正常人明显升高，且IL-23可以明显促进IL-17产生。但目前有关IL-23/IL-17通路在SO发生发展中的作用及机制不明确，因此也缺乏抑制该通路在SO中发挥作用的有效药物。雷公藤红素属于醌甲基三萜，是从雷公藤根皮中分离得到的第一个天然活性产物；其具有免疫抑制作用，已被广泛用于治疗类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病[14]。但关于雷公藤红素对SO是否具有相同的治疗作用目前尚不清楚。为此，我们观察了雷公藤红素对SO患者PBMCs分泌IL-17的抑制作用，并初步探讨了其可能机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
淋巴细胞分离液（上海生物工程公司），1640细胞培养液（美国Gibcol BRL公司）。雷公藤红素、金黄色葡萄球菌CowanⅠ株（SAC）（美国Sigma-Aldrich公司）。抗CD3、抗CD28抗体（美国eBioscience公司），重组人IL-23（rIL-23，美国R&D Systems公司），人IL-23酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（美国Bender MedSystems公司），人IL-17 Duoset ELISA检测试剂盒（美国R&D Systems公司）。96孔平底细胞培养板（美国Costar公司）。
在郑州大学第一附属医院眼科首次确诊为活动期SO的10例患者纳入本研究。其中，男性8例，女性2例；年龄19～62岁，平均年龄（38.60±12.68）岁。所有患者病程＜2个月，均符合活动期SO的诊断标准[15, 16]。患者均未使用过糖皮质激素和其他免疫抑制剂治疗。选取患者家属或健康志愿者10名作为对照。其中，男性7例，女性3例；年龄24～69岁，平均年龄（41.90±14.22）岁。两组患者年龄（t=0.55，P=0.59）、性别分布比较（χ2=0.27，P=0.61）比较，差异均无统计学意义。所有参与者均签署知情同意书。
采用密度梯度离心法分离PBMCs。取参与者静脉血15～20 ml，加入10～25 U/ml肝素抗凝离心管内。将抗凝血缓慢加入淋巴细胞分离液面上（分离液：抗凝血=1.0:1.5）。室温800×g离心20 min。沿离心管管壁周围吸出细胞层，移入另一试管。磷酸盐缓冲液（PBS）洗细胞2次，以离心半径12 cm、转速800 r/min离心8 min。加入1 ml 1640细胞培养液，混匀，计数细胞。置于完全1640细胞培养液中，放入5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。
调整PBMCs细胞浓度至2×106个/m1，200 μl/孔，置于96孔板中培养。将细胞分为A～D组。A组为正常人PBMCs；B组为SO患者PBMCs；C组为SO患者PBMCs，并在其培养液中加入0.5 μmol/L的雷公藤红素；D组为SO患者PBMCs，并在其培养液中加入1.0 μmol/L的雷公藤红素。每组设3个复孔，每孔加入SAC（1:500）刺激3 d，用于检测IL-23含量；每孔加入抗CD3抗体（5 mg/ml）和抗CD28抗体（1 mg/ml）刺激3 d，用于检测IL-17含量。重新取细胞培养后，向A、B组加入50 ng/ml rIL-23分别作为A1、B1组。再重新取细胞培养后，向A、B组加入50 ng/ml rIL-23+1 μmol/L雷公藤红素分别作为A2、B2组。每组设3个复孔，每孔加入抗CD3抗体（5 mg/ml）和抗CD28抗体（1 mg/ml）刺激3 d，用于检测IL-17含量。将96孔板置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养72 h。终止培养后收集上清液，−70℃保存。用ELISA检测血清和PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17的含量。用酶标仪测定波长450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。
采用SPSS 18.0统计学软件进行统计分析。数据资料经W检验呈正态分布，以均数±标准差（
）表示。组间比较采用方差分析，组间两两比较采用独立样本 t 检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
A～D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量分别为（228.43±17.27）、（513.85±36.46）、（381.07±20.93）、（237.14±17.97）pg/ml。4组间比较，差异有统计学意义（F=306.65，P=0.00）。A组与B组（t=22.37，P=0.00）、A组与C组（t=17.79，P=0.00）、B组与C组（t=9.99，P=0.00）、B组与D组（t=21.53，P=0.00）、C组与D组（t=16.50，P=0.00）PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量两两比较，差异均有统计学意义。A组与D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量比较，差异无统计学意义（t=1.11，P=0.28）（图1）。
图1
各组PBMCs细胞培养上清液中IL-23含量比较
A～D组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别为（220.55±31.15）、（866.77±72.92）、（517.43±54.87）、（242.89±34.09）pg/ml。4组间比较，差异有统计学意义（F=348.24，P=0.00）。A组与B组（t=25.77，P=0.00）、A组与C组（t=14.88，P=0.00）、B组与C组（t=12.11，P=0.00）、B组与D组（t=24.51，P=0.00）、C组与D组（t=13.44，P=0.00）PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量两两比较，差异均有统计学意义。A组与D组PBMCs细胞培养上清液中IL-17的含量比较，差异无统计学意义（t=1.53，P=0.14）（图2）。
图2
各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
重新取细胞培养后，A、A1、B、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量为（215.63±20.31）、（417.33±22.05）、（865.47±74.89）、（1373.13±92.95）pg/ml。A1、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别较A、B组增加，差异均有统计学意义（t=21.28、13.45，P=0.00、0.00）（图3）。
图3
重新取细胞培养后各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
再次取细胞培养后，A1、A2、B1、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别为（428.43±24.53）、（229.15±23.28）、（1373.39±89.51）、（571.01±94.88）pg/ml。A2、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量分别较A1、B1组明显降低，差异均有统计学意义（t=18.63、19.45，P=0.00、0.00）（图4）。
图4
再次取细胞培养后各组PBMCs细胞培养上清液中IL-17含量比较
3 讨论
本研究结果显示，B组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量均高于A组；A1组、B1组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量分别高于A、B组。说明SO患者PBMCs分泌的IL-17较正常健康者更多，而IL-23能促进正常健康者或SO患者的PBMCs分泌更多的IL-17；这与以往其他类型葡萄膜炎的研究结果相似，提示IL-23/IL-17通路在SO的发生发展中可能发挥重要作用。
雷公藤红素具有抗炎及免疫抑制、诱导细胞凋亡和抗肿瘤等作用，已被广泛应用于一些自身免疫性疾病的治疗[14, 17]。本研究结果显示，C、D组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量均较B组明显降低，且D组与A组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量无明显差异；A2、B2组PBMCs细胞培养上清液中IL-23、IL-17含量分别较A1、B1组明显降低。说明雷公藤红素不仅可以明显抑制SO患者PBMCs分泌IL-23和IL-17，而且可以抑制rIL-23刺激正常健康者和SO患者PBMCs分泌IL-17。提示雷公藤红素抑制PBMCs分泌IL-17可能是通过抑制IL-23的分泌而发挥作用，为今后更深入的研究指明了方向。
本研究结果表明，雷公藤红素可以抑制SO患者PBMCs分泌IL-17，其机制可能与抑制IL-23/IL-17通路发挥作用有关；但是否还有别的细胞因子参与其中或是雷公藤红素通过影响哪些细胞信号通路发挥作用尚不清楚。另外，目前只针对PBMCs进行研究还不够，今后研究应增加T细胞亚群流式检测和增生实验，测试雷公藤红素对T细胞亚群分泌细胞因子的影响。待体外实验研究较为完整时，再进行动物体内实验，观察雷公藤红素对动物体内T细胞分泌IL-23、IL-17等细胞因子的影响，并探讨其机制。
