引用本文： 李光祖, 王晓莉, 李振, 张婷婷, 刘萍, 张帅, 赵岩松. 褪黑素对视网膜缺血再灌注损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响及机制探讨. 中华眼底病杂志, 2018, 34(1): 55-59. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.01.014 复制
褪黑素是松果体分泌的神经内分泌激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[1, 2]。近期研究发现，褪黑素可有效减轻细胞凋亡，提高视网膜神经节细胞（RGC）存活率，发挥对视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）的保护作用，但具体机制尚不明确[3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是细胞凋亡过程中的死亡蛋白，活化的Caspase-3是凋亡信号启动的重要标志。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）-抗氧化反应元件（ARE）信号通路是机体对抗氧化应激的关键，Nrf2活化后，可与细胞核内的ARE启动子部位结合，启动Nrf2下游靶基因血红素氧合酶（HO）-1的表达，进而表现出抗氧化、抗炎和抗凋亡的保护作用[4]。研究表明，肠缺血处理后Nrf2-ARE信号通路的激活可显著改善肠缺血再灌注引起的肺损伤和全身炎症反应[5]；褪黑素可通过激活Nrf2-ARE信号通路，减轻肝脏缺血再灌注损伤及氧化应激[6]。但目前关于褪黑素对RIRI中Nrf2-ARE信号通路的影响尚不清楚。为此，本研究通过观察褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞活性Caspase-3蛋白表达的影响，并从Nrf2-ARE信号通路探讨褪黑素减轻视网膜细胞凋亡的机制，以期为临床上采用褪黑素治疗RIRI提供科学的理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康无眼疾雄性Sprague-Dawley大鼠54只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。褪黑素（美国Sigma公司），兔抗活性Caspase-3（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗Nrf2、兔抗HO-1（武汉博士德生物工程有限公司）。兔抗二步法试剂盒（PV-9001）、二氨基联苯胺（DAB）显色剂试剂盒（ZLI-9018）（北京中杉金桥生物技术有限公司），正置荧光显微镜（BX-51，日本Olympus公司），石蜡切片机（Shandon Finesse325，美国Thermo公司），电子分析天平（AL-204，美国Mettler Toledo公司）。
采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组、RIRI组及褪黑素组，分别为6、24、24只。RIRI组及褪黑素组大鼠采用线栓法建立RIRI模型[7-9]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内外动脉并结扎右侧颈总动脉近心段、颈外动脉近分叉处。于颈总动脉插入直径0.2 mm的线栓，当线栓头进入颈内动脉且距颈总动脉与颈内动脉分叉处18 mm时停止进线，结扎固定，缝合组织皮肤。此时可见大鼠右侧眼球苍白，眼底血流中断，与左眼形成对比。缺血2 h后，在麻醉状态下完全拔出线栓。可见大鼠右侧眼球苍白消失，血流恢复。造模成功30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉褪黑素组大鼠，解开颈部正中切口缝线，分离右侧颈总、颈内、颈外动脉；静脉留置针经颈内动脉按1.25 ml/kg剂量注射4 mg/ml褪黑素。RIRI组大鼠注射等量的生理盐水。建模后6、24 h及3、7 d，RIRI组及褪黑素组分别取6只大鼠用于实验。
腹腔麻醉各组大鼠，常规心脏灌注取右侧眼球，置于4%多聚甲醛后固定过夜，去晶状体，常规石蜡包埋，以视神经矢状轴为平面进行切片，制成4 μm石蜡切片，苏木精伊红（HE）染色行非连续切片。连续取3张切片分别行Caspase-3、Nrf2、HO-1免疫组织化学染色；每隔4～5张，行3张连续切片。组织切片脱蜡至水，苏木精染色，双蒸水冲洗2次，体积分数1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，自来水冲洗，体积分数70%酒精、80%酒精脱水；伊红染色30 s，体积分数95%酒精分色；无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。采用Cellsens 1.6图像分析软件测量视网膜内层厚度，并计数RGC。于视盘外200 μm处100 μm长度内，随机取4点测量视网膜内界膜到外网状层内层内缘的距离，取平均值。计数距视盘边缘100 μm处RGC层100 μm长度内单位面积RGC数。
石蜡切片脱蜡至水，热修复抗原，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭后，分别加入兔抗活性Caspase-3（1:100）、兔抗Nrf2（1:100）、兔抗HO-1（1:150）一抗，4 ℃冰箱中过夜；次日，复温后 0.01 mol/L PBS冲洗，加兔抗大鼠二抗试剂盒，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。置于光学显微镜下观察，计数活性Caspase-3及Nrf2、HO-1 阳性细胞数量。
采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学分析，所有计量资料均以均数±标准差（
）表示。方差齐性资料采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。采用一般线性回归分析法分析建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常对照组大鼠视网膜各层结构清晰完整，细胞排列整齐规则（图1A）。RIRI组大鼠建模后6 h视网膜水肿明显，视网膜内层变厚；建模后24 h视网膜内层变薄、细胞数目减少（图1B）；建模后3、7 d视网膜内层变薄、细胞数目减少明显。褪黑素组大鼠建模后6 h视网膜细胞水肿；建模后24 h及3、7 d，大鼠视网膜各层细胞排列较整齐，形态较规则（图1C）。建模后6、24 h及3、7 d，与RIRI组比较，褪黑素组大鼠视网膜内层厚度增厚（F=16.710、62.303、68.389、57.132，P＜0.01），RGC数量增加（F=24.250、11.624、14.155、32.442，P＜0.05），差异均有统计学意义（图2，3）。
图2
各组大鼠视网膜内层厚度比较
图3
各组大鼠RGC数量比较
正常对照组大鼠视网膜各层偶见少量活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞。建模后6 h，RIRI组大鼠视网膜可见较多活性Caspase-3阳性细胞，少量Nrf2、HO-1阳性细胞，主要分布于视网膜内核层、RGC层；褪黑素组大鼠视网膜可见较少量活性Caspase-3阳性细胞，较多量Nrf2、HO-1阳性细胞，主要分布于视网膜内核层、RGC层。建模后24 h，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量明显增加（图4）。建模后3 d，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量开始下降但仍处于较高水平。建模后7 d，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量继续下降。建模后6、24 h及3、7 d，与RIRI组比较，褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3阳性细胞数量明显减少（F=49.118、134.173、76.225、18.385，P＜0.01），Nrf2（F=11.041、31.480、59.246、6.740，P＜0.05）、HO-1（F=128.993、21.606、51.349、8.244，P＜0.05）阳性细胞数量明显增加，差异均有统计学意义（图5）。
图5
各组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量比较。5A.活性Caspase-3阳性细胞数量比较；5B.Nrf2阳性细胞数量比较；5C.HO-1阳性细胞数量比较
相关性分析结果显示，建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值均呈直线相关（r2=0.810、0.730，P＜0.01）（图6）。
图6
褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值相关性分析散点图。6A.活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2阳性细胞数差值；6B.活性Caspase-3阳性细胞数差值与HO-1阳性细胞数差值
3 讨论
Caspase-3是细胞凋亡途径的终末蛋白，当凋亡信号出现时，细胞质中无活性的Caspase-3在多种水解酶作用下裂解活化形成活性Caspase-3，而活性Caspase-3与细胞凋亡密切相关[10, 11]。因此，本实验通过对Caspase-3阳性细胞数量的观察，探讨褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的影响。本研究结果显示，随着RIRI时间的延长，RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数量逐渐增加，于建模后24 h达到高峰，此后逐渐下降；建模后各时间点褪黑素组活性Caspase-3阳性细胞数量均少于RIRI组。与Yue等[1]报道结果一致。提示褪黑素可以减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡作用。
Nrf2-ARE信号通路是体内重要的内源性抗氧化体系，激活Nrf2-ARE信号通路可通过抗凋亡、抗炎等机制减轻RIRI[12]。有研究报道，褪黑素可通过调节蛋白激酶C和Ca+信号，刺激Nrf2的磷酸化和核转位，进而上调HO-1基因的转录，促进HO-1蛋白的表达[13]。HO-1的代谢产物CO通过调节有丝分裂原激活的蛋白激酶信号途径或者抑制活化的单核巨噬细胞防止内皮细胞凋亡，发挥抗凋亡作用。褪黑素减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的机制是否与该信号通路有关目前尚不清楚。本研究通过Nrf2-ARE信号通路探讨褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的神经保护作用。结果发现，建模后不同时间点，褪黑素组Nrf2、HO-1阳性细胞数量均较RIRI组增加；活性Caspase-3阳性细胞数量均较RIRI组下降，但仍多于正常对照组。提示褪黑素可减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡，其机制可能与其促进Nrf2、HO-1蛋白的表达增加，即激活Nrf2信号通路有关，从而发挥其对视网膜神经细胞的神经保护作用。为了进一步验证这一推测，我们对建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值进行相关性分析。结果显示，建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值均呈直线相关。提示褪黑素可能通过促进Nrf2-ARE信号通路重要信号分子Nrf2、HO-1蛋白的表达，抑制RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡。
本研究结果表明，褪黑素可激活RIRI大鼠视网膜中Nrf2-ARE信号通路，促进Nrf2、HO-1蛋白表达，从而抑制活性Caspase-3蛋白表达，减轻视网膜细胞凋亡，发挥神经保护作用。但我们仅发现了褪黑素的神经保护作用与Nrf2-ARE信号通路有关，关于褪黑素调控Nrf2-ARE信号通路抑制视网膜细胞凋亡的具体机制尚有待进一步研究。
褪黑素是松果体分泌的神经内分泌激素，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡的作用[1, 2]。近期研究发现，褪黑素可有效减轻细胞凋亡，提高视网膜神经节细胞（RGC）存活率，发挥对视网膜缺血再灌注损伤（RIRI）的保护作用，但具体机制尚不明确[3]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3是细胞凋亡过程中的死亡蛋白，活化的Caspase-3是凋亡信号启动的重要标志。核转录因子E2相关因子2（Nrf2）-抗氧化反应元件（ARE）信号通路是机体对抗氧化应激的关键，Nrf2活化后，可与细胞核内的ARE启动子部位结合，启动Nrf2下游靶基因血红素氧合酶（HO）-1的表达，进而表现出抗氧化、抗炎和抗凋亡的保护作用[4]。研究表明，肠缺血处理后Nrf2-ARE信号通路的激活可显著改善肠缺血再灌注引起的肺损伤和全身炎症反应[5]；褪黑素可通过激活Nrf2-ARE信号通路，减轻肝脏缺血再灌注损伤及氧化应激[6]。但目前关于褪黑素对RIRI中Nrf2-ARE信号通路的影响尚不清楚。为此，本研究通过观察褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞活性Caspase-3蛋白表达的影响，并从Nrf2-ARE信号通路探讨褪黑素减轻视网膜细胞凋亡的机制，以期为临床上采用褪黑素治疗RIRI提供科学的理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
健康无眼疾雄性Sprague-Dawley大鼠54只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。褪黑素（美国Sigma公司），兔抗活性Caspase-3（美国Cell Signaling Technology公司），兔抗Nrf2、兔抗HO-1（武汉博士德生物工程有限公司）。兔抗二步法试剂盒（PV-9001）、二氨基联苯胺（DAB）显色剂试剂盒（ZLI-9018）（北京中杉金桥生物技术有限公司），正置荧光显微镜（BX-51，日本Olympus公司），石蜡切片机（Shandon Finesse325，美国Thermo公司），电子分析天平（AL-204，美国Mettler Toledo公司）。
采用随机数字表法将大鼠随机分为正常对照组、RIRI组及褪黑素组，分别为6、24、24只。RIRI组及褪黑素组大鼠采用线栓法建立RIRI模型[7-9]。腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，颈部正中切口，分离右侧颈总、颈内外动脉并结扎右侧颈总动脉近心段、颈外动脉近分叉处。于颈总动脉插入直径0.2 mm的线栓，当线栓头进入颈内动脉且距颈总动脉与颈内动脉分叉处18 mm时停止进线，结扎固定，缝合组织皮肤。此时可见大鼠右侧眼球苍白，眼底血流中断，与左眼形成对比。缺血2 h后，在麻醉状态下完全拔出线栓。可见大鼠右侧眼球苍白消失，血流恢复。造模成功30 min后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉褪黑素组大鼠，解开颈部正中切口缝线，分离右侧颈总、颈内、颈外动脉；静脉留置针经颈内动脉按1.25 ml/kg剂量注射4 mg/ml褪黑素。RIRI组大鼠注射等量的生理盐水。建模后6、24 h及3、7 d，RIRI组及褪黑素组分别取6只大鼠用于实验。
腹腔麻醉各组大鼠，常规心脏灌注取右侧眼球，置于4%多聚甲醛后固定过夜，去晶状体，常规石蜡包埋，以视神经矢状轴为平面进行切片，制成4 μm石蜡切片，苏木精伊红（HE）染色行非连续切片。连续取3张切片分别行Caspase-3、Nrf2、HO-1免疫组织化学染色；每隔4～5张，行3张连续切片。组织切片脱蜡至水，苏木精染色，双蒸水冲洗2次，体积分数1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，自来水冲洗，体积分数70%酒精、80%酒精脱水；伊红染色30 s，体积分数95%酒精分色；无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。采用Cellsens 1.6图像分析软件测量视网膜内层厚度，并计数RGC。于视盘外200 μm处100 μm长度内，随机取4点测量视网膜内界膜到外网状层内层内缘的距离，取平均值。计数距视盘边缘100 μm处RGC层100 μm长度内单位面积RGC数。
石蜡切片脱蜡至水，热修复抗原，3% H2O2消除内源性过氧化物酶，正常山羊血清封闭后，分别加入兔抗活性Caspase-3（1:100）、兔抗Nrf2（1:100）、兔抗HO-1（1:150）一抗，4 ℃冰箱中过夜；次日，复温后 0.01 mol/L PBS冲洗，加兔抗大鼠二抗试剂盒，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。置于光学显微镜下观察，计数活性Caspase-3及Nrf2、HO-1 阳性细胞数量。
采用SPSS 16.0 统计软件进行统计学分析，所有计量资料均以均数±标准差（
）表示。方差齐性资料采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05。采用一般线性回归分析法分析建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常对照组大鼠视网膜各层结构清晰完整，细胞排列整齐规则（图1A）。RIRI组大鼠建模后6 h视网膜水肿明显，视网膜内层变厚；建模后24 h视网膜内层变薄、细胞数目减少（图1B）；建模后3、7 d视网膜内层变薄、细胞数目减少明显。褪黑素组大鼠建模后6 h视网膜细胞水肿；建模后24 h及3、7 d，大鼠视网膜各层细胞排列较整齐，形态较规则（图1C）。建模后6、24 h及3、7 d，与RIRI组比较，褪黑素组大鼠视网膜内层厚度增厚（F=16.710、62.303、68.389、57.132，P＜0.01），RGC数量增加（F=24.250、11.624、14.155、32.442，P＜0.05），差异均有统计学意义（图2，3）。
图2
各组大鼠视网膜内层厚度比较
图3
各组大鼠RGC数量比较
正常对照组大鼠视网膜各层偶见少量活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞。建模后6 h，RIRI组大鼠视网膜可见较多活性Caspase-3阳性细胞，少量Nrf2、HO-1阳性细胞，主要分布于视网膜内核层、RGC层；褪黑素组大鼠视网膜可见较少量活性Caspase-3阳性细胞，较多量Nrf2、HO-1阳性细胞，主要分布于视网膜内核层、RGC层。建模后24 h，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量明显增加（图4）。建模后3 d，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量开始下降但仍处于较高水平。建模后7 d，RIRI组、褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量继续下降。建模后6、24 h及3、7 d，与RIRI组比较，褪黑素组大鼠视网膜活性Caspase-3阳性细胞数量明显减少（F=49.118、134.173、76.225、18.385，P＜0.01），Nrf2（F=11.041、31.480、59.246、6.740，P＜0.05）、HO-1（F=128.993、21.606、51.349、8.244，P＜0.05）阳性细胞数量明显增加，差异均有统计学意义（图5）。
图5
各组大鼠视网膜活性Caspase-3及Nrf2、HO-1阳性细胞数量比较。5A.活性Caspase-3阳性细胞数量比较；5B.Nrf2阳性细胞数量比较；5C.HO-1阳性细胞数量比较
相关性分析结果显示，建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值均呈直线相关（r2=0.810、0.730，P＜0.01）（图6）。
图6
褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值相关性分析散点图。6A.活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2阳性细胞数差值；6B.活性Caspase-3阳性细胞数差值与HO-1阳性细胞数差值
3 讨论
Caspase-3是细胞凋亡途径的终末蛋白，当凋亡信号出现时，细胞质中无活性的Caspase-3在多种水解酶作用下裂解活化形成活性Caspase-3，而活性Caspase-3与细胞凋亡密切相关[10, 11]。因此，本实验通过对Caspase-3阳性细胞数量的观察，探讨褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的影响。本研究结果显示，随着RIRI时间的延长，RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数量逐渐增加，于建模后24 h达到高峰，此后逐渐下降；建模后各时间点褪黑素组活性Caspase-3阳性细胞数量均少于RIRI组。与Yue等[1]报道结果一致。提示褪黑素可以减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡作用。
Nrf2-ARE信号通路是体内重要的内源性抗氧化体系，激活Nrf2-ARE信号通路可通过抗凋亡、抗炎等机制减轻RIRI[12]。有研究报道，褪黑素可通过调节蛋白激酶C和Ca+信号，刺激Nrf2的磷酸化和核转位，进而上调HO-1基因的转录，促进HO-1蛋白的表达[13]。HO-1的代谢产物CO通过调节有丝分裂原激活的蛋白激酶信号途径或者抑制活化的单核巨噬细胞防止内皮细胞凋亡，发挥抗凋亡作用。褪黑素减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的机制是否与该信号通路有关目前尚不清楚。本研究通过Nrf2-ARE信号通路探讨褪黑素对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的神经保护作用。结果发现，建模后不同时间点，褪黑素组Nrf2、HO-1阳性细胞数量均较RIRI组增加；活性Caspase-3阳性细胞数量均较RIRI组下降，但仍多于正常对照组。提示褪黑素可减轻RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡，其机制可能与其促进Nrf2、HO-1蛋白的表达增加，即激活Nrf2信号通路有关，从而发挥其对视网膜神经细胞的神经保护作用。为了进一步验证这一推测，我们对建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值进行相关性分析。结果显示，建模后不同时间点褪黑素组与RIRI组活性Caspase-3阳性细胞数差值与Nrf2、HO-1阳性细胞数差值均呈直线相关。提示褪黑素可能通过促进Nrf2-ARE信号通路重要信号分子Nrf2、HO-1蛋白的表达，抑制RIRI大鼠视网膜细胞的凋亡。
本研究结果表明，褪黑素可激活RIRI大鼠视网膜中Nrf2-ARE信号通路，促进Nrf2、HO-1蛋白表达，从而抑制活性Caspase-3蛋白表达，减轻视网膜细胞凋亡，发挥神经保护作用。但我们仅发现了褪黑素的神经保护作用与Nrf2-ARE信号通路有关，关于褪黑素调控Nrf2-ARE信号通路抑制视网膜细胞凋亡的具体机制尚有待进一步研究。
