引用本文： 田敏, 吴进川, 何薇, 余曦, 吕红彬. 叔丁基对苯二酚对高糖培养视网膜Müller细胞核因子E2相关因子2、血红素氧合酶1和磷脂酰肌醇-3激酶表达的影响. 中华眼底病杂志, 2018, 34(4): 382-387. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.015 复制
糖尿病视网膜病变（DR）发病机制包括氧化应激、细胞凋亡等多方面[1]。核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，其可转入细胞核内与抗氧化反应元件（ARE）结合并启动血红素氧合酶1（HO-1）等下游抗氧化因子转录，减轻氧化应激损伤[2]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路在DR中发挥重要作用[3]，是细胞存活途径的主要调节因子[4]，其激活可以导致抗凋亡成员B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）增加和促凋亡蛋白Bax的水平降低[5-7]。叔丁基对苯二酚（tBHQ）为Ⅱ相酶诱导剂，是Nrf2/ARE信号通路的强诱导剂。并且也有研究发现tBHQ可以刺激PI3K依赖性Akt磷酸化，上调Nrf2介导的抗氧化应答元件的活性[8, 9]。我们前期研究发现，tBHQ能通过激活Nrf2/ARE信号通路，减轻2型糖尿病大鼠模型视网膜氧化应激损伤，减少视网膜血管增生，抑制视网膜细胞凋亡[10-13]。为此，本研究应用tBHQ预处理高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞，观察tBHQ对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax表达的影响，初步探讨Ⅱ相酶诱导剂tBHQ对大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及相关机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠视网膜Müller细胞由武汉生命科技股份有限公司提供。兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）单克隆抗体、兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（英国Abcam公司）；异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的山羊抗兔二抗、RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（武汉阿斯本生物技术有限公司）；兔抗HO-1多克隆抗体（美国Affbiotech公司）；兔抗PI3K多克隆抗体（美国CST公司），兔抗Bax多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT试剂盒（日本TaKaRa公司）；锚定蛋白（Annexin V）-FITC细胞凋亡检测试剂盒（天津三箭生物技术有限公司）。
参照文献[14]的方法培养并鉴定Müller细胞，取第2～4代细胞进行实验。按照培养液的葡萄糖浓度分为正常糖组（N组，5.5 mmol/L葡萄糖），高糖组（HG组，45.0 mmol/L葡萄糖）及tBHQ干预组（HG+tBHQ组）。参照文献[15]方法在HG+tBHQ组视网膜Müller细胞培养48 h后，加入tBHQ 20 μmol/L干预处理48 h。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞，GS抗体和DAPI染色观察Müller细胞形态。采用胰蛋白酶消化第2代对数生长期的Müller细胞，将Müller细胞用4%多聚甲醛固定在盖玻片上15 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5 min。室温下封闭工作流体处理盖玻片10 min。PBS洗涤5 min，山羊血清室温下封闭15 min。细胞与GS抗体在4℃温育过夜。PBS洗涤盖玻片，与FITC偶联的山羊抗兔二抗在室温下孵育50 min。PBS洗涤后，DAPI染色5 min，PBS洗涤3次，滴加适量的抗荧光淬灭剂于Müller细胞上，荧光显微镜下观察。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白的表达。胰蛋白酶消化第2代对数生长期的Müller细胞，低速离心收集细胞，裂解液冲洗抽提蛋白，4 ℃ 13 000 g离心5 min，收集上清，每孔40 μg蛋白加上样缓冲液后煮沸5 min，12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，封闭。加入兔抗鼠Nrf2一抗（1∶1000），HO-1一抗（1∶2000），PI3K一抗（1∶3000），Bcl-2一抗（1∶1000）和Bax一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜，洗涤后加羊抗兔二抗（1∶3000），室温孵育30 min，洗涤后加入新鲜配制的增强化学发光混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标条带的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。以Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax和GAPDH的比值作为各蛋白的相对表达量。
参照文献[16]方法，实时荧光定量聚合酶链（qRT-PCR）检测各组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA的表达。Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax、GAPDH引物长度分别为294、290、262、214、148、210碱基对（bp）。72～95 ℃，每上升0.5 ℃取1次荧光值，最后生成溶解曲线，所有的样本均重复检测3次，最后计算出Ct值。各因子的表达量采用△△Ct方法进行计算分析，即通过计算目的基因相对于参照因子的倍数来比较mRNA的表达差异，管家基因GAPDH作为内参基因。△△Ct=（待测样品目的基因的Ct平均值−待测样本内参基因的Ct平均值）−（对照样品目的基因的Ct平均值）。目的基因的相对拷贝量F=2−△△Ct。
参照文献[17]方法，流式细胞仪检测各组Müller细胞的凋亡率。采用15 mW氩离子激光，激发光波长为488 nm，发射波长530 nm，CEL LQuest软件自动获取1×104个细胞样品。流式细胞仪定量分析，计算Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）双染阳性细胞百分比含量。
SPSS17.0软件行统计学处理。结果以均数±标准差（
±s）表示。相同指标多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
荧光显微镜观察发现，95%以上Müller细胞GS染色阳性；细胞体大，细胞浆丰富，绿色荧光均匀一致；细胞核DAPI染色呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致（图1）。
Western blot检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（F=73.831）、HO-1（F=148.618）、PI3K（F=83.540）、Bcl-2（F=150.381）、Bax（F=234.459）蛋白表达比较，差异均有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG组Müller细胞中Nrf2（t=4.114）、HO-1（t=9.275）蛋白表达较N组升高，差异有统计学意义（P=0.006、0.000）。HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（t=7.847）、HO-1（t=7.947）、PI3K（t=5.397）、Bcl-2（t=6.825）蛋白表达较HG组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.002、0.000）；Bax蛋白表达较HG组降低，差异有统计学意义（t=14.998、P=0.000）（图2）。
图2
N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表达情况。2A. 电泳图；2B. Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表达结果。* HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
qRT-PCR检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（F=340.317）、HO-1（F=1 582.911）、PI3K（F=81.807）、Bcl-2（F=133.630）、Bax（F=283.850）mRNA比较，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG组Müller细胞中Nrf2（t=7.292）、HO-1（t=15.014）较N组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000）。HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（t=18.046）、HO-1（t=39.458）、PI3K（t=4.979）、Bcl-2（t=9.535）mRNA较HG组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.003、0.000）；Bax mRNA较HG组降低，差异有统计学意义（t=16.520、P=0.000）（图3）。
图3
N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA表达情况。 * HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
流式细胞仪检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞的凋亡率分别为（3.95±0.68）%、（39.77±1.76）%、（20.84±0.23）%。三组Müller细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=797.079、P=0.000）。HG组Müller细胞凋亡率较N组增高，差异有统计学意义（t=39.905、P=0.000）；HG+tBHQ组Müller细胞凋亡率较HG组降低，差异均有统计学意义（t=21.083、P=0.000）（图4）。
图4
Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞凋亡情况。4A.三组Müller细胞凋亡结果；4B.三组Müller细胞凋亡率比较。* HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
3 讨论
目前已经发现Nrf2在人视网膜Müller细胞中表达[18]，同时也发现DR患者视网膜中Nrf2表达增加[19]。本研究结果发现，N组Müller细胞中Nrf2表达，HG组Nrf2表达增加。Nrf2可调节直接和间接抗氧化，间接酶包括HO-1[20-22]。本研究结果表明，高糖条件下，Müller细胞中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的表达增加，说明此时Müller细胞有助于维持细胞氧化还原状态并防止氧化。既往部分研究发现，尽管糖尿病环境中Nrf2表达增加，但其在细胞核中的表达水平和DNA结合活性却低于正常水平[19]。表明虽然在糖尿病环境中细胞产生更多的Nrf2，导致Nrf2产量增加，但是不能到达细胞核以增强转录机制。
本研究结果发现，tBHQ干预进一步增加了Nrf2和HO-1在Müller细胞中的表达，与Zhong等[19]结果一致。Zhong等[19]发现，tBHQ在高糖条件下干预牛视网膜内皮细胞，可以激活Nrf2活性。其他一些研究也发现，tBHQ在体内通过促进Nrf2蛋白入细胞核，继而激活Nrf2-ARE信号通路，启动HO-1基因的表达[23,24]。上述结果均表明，tBHQ可以通过增加Nrf2和HO-1的活性发挥Müller细胞的抗氧化功能。
PI3K/Akt通路在DR中发挥重要作用，糖尿病大鼠视网膜中PI3K，Akt-1和Akt-3活性丧失[3]。本研究结果也发现高糖环境下，大鼠Müller细胞中PI3K表达降低。PI3K/Akt途径是细胞存活途径的主要调节因子[4]。该途径的激活可以导致Bcl-2家族的抗凋亡成员增加和促凋亡蛋白的水平降低[5-7]。作为Bcl-2家族成员，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在线粒体途径中天生平衡，并且这种平衡可以决定糖尿病刺激后Müller细胞的存活或死亡[25-29]。越来越多的证据表明，高血糖导致Müller细胞死亡是通过细胞凋亡实现[30,31]。本研究结果显示，高糖条件下Müller细胞Bcl-2表达下降，Bax表达增加；表明高糖环境下Müller细胞凋亡程序激活。 PI3K/Akt途径也调控Nrf2介导的抗氧化功能[32,33]。已经有研究发现，PI3K参与Nrf2的解离和核转运以影响其下游的氧化应激产物[34]。tBHQ可以刺激PI3k依赖性Akt磷酸化，上调Nrf2介导的抗氧化应答元件的活性[8,9]。本研究结果显示，tBHQ诱导干预后，PI3K，Nrf2和Bcl- 2表达升高，Bax表达降低；提示tBHQ可能通过激活PI3K-Nrf2途径抑制Müller细胞的凋亡。既往有研究发现，褪黑激素是一种理想的抗氧化药物，褪黑激素在DR中通过激活Müller细胞中的PI3K/Akt-Nrf2信号通路，通过诱导HO-1的表达增强细胞抗氧化防御能力[35]。同时，我们的研究也发现，tBHQ干预后，HO-1随着Nrf2表达的增加而增加；表明tBHQ可能通过激活PI3K-Nrf2途径诱导HO-1的分泌，从而导致抗氧化应激和抗凋亡。同时有研究发现，tBHQ也可激活Nrf2-AREr3通路，诱导Bcl-2基因转录，下调Bax蛋白表达，起到抗氧化和抗凋亡的作用[36]。然而，也有部分研究发现，tBHQ确实能有效阻止肝细胞的死亡并抑制心肌细胞凋亡，但tBHQ的保护作用与Nrf2的激活无关，而与Akt的急性激活有关[37,38]。说明tBHQ的抗凋亡保护作用有可能是通过激活PI3K/Akt信号通路而起作用，而与Nrf2的激活无关。以上这些发现还需要进一步实验进行验证。
本研究参照文献[15]的方法使用浓度为20 μmol/L tBHQ对高糖培养的Müller细胞干预48 h，发现tBHQ可诱导Müller细胞中各因子的变化。然而不同浓度的tBHQ及干预不同时间点可能会诱发各因子不一样的表达，后期将进行进一步的研究。
本研究结果发现，高糖环境下Müller细胞产生更多的Nrf2和HO-1，虽然其产量增加，但不能到达细胞核以增强转录机制。tBHQ不仅能激活Nrf2和HO-1在Müller细胞中的表达以抗氧化反应，而且还通过激活PI3K信号通路来抑制Müller细胞的凋亡。 tBHQ也可能是通过激活PI3K-Nrf2途径诱导HO-1分泌，从而抗氧化应激，抗凋亡作用。tBHQ在高糖环境下诱导Müller细胞中Nrf2、HO-1及PI3K的表达具有巨大的潜力，以保护Müller细胞免受氧化应激和凋亡的损伤，并且可能对未来治疗DR具有重要的作用。
糖尿病视网膜病变（DR）发病机制包括氧化应激、细胞凋亡等多方面[1]。核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路是迄今为止发现的最为重要的内源性抗氧化应激通路，其可转入细胞核内与抗氧化反应元件（ARE）结合并启动血红素氧合酶1（HO-1）等下游抗氧化因子转录，减轻氧化应激损伤[2]。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）通路在DR中发挥重要作用[3]，是细胞存活途径的主要调节因子[4]，其激活可以导致抗凋亡成员B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）增加和促凋亡蛋白Bax的水平降低[5-7]。叔丁基对苯二酚（tBHQ）为Ⅱ相酶诱导剂，是Nrf2/ARE信号通路的强诱导剂。并且也有研究发现tBHQ可以刺激PI3K依赖性Akt磷酸化，上调Nrf2介导的抗氧化应答元件的活性[8, 9]。我们前期研究发现，tBHQ能通过激活Nrf2/ARE信号通路，减轻2型糖尿病大鼠模型视网膜氧化应激损伤，减少视网膜血管增生，抑制视网膜细胞凋亡[10-13]。为此，本研究应用tBHQ预处理高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞，观察tBHQ对高糖环境下大鼠视网膜Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax表达的影响，初步探讨Ⅱ相酶诱导剂tBHQ对大鼠视网膜Müller细胞的保护作用及相关机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
Sprague-Dawley大鼠视网膜Müller细胞由武汉生命科技股份有限公司提供。兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）单克隆抗体、兔抗Nrf2多克隆抗体、兔抗Bcl-2多克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（英国Abcam公司）；异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的山羊抗兔二抗、RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（武汉阿斯本生物技术有限公司）；兔抗HO-1多克隆抗体（美国Affbiotech公司）；兔抗PI3K多克隆抗体（美国CST公司），兔抗Bax多克隆抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT试剂盒（日本TaKaRa公司）；锚定蛋白（Annexin V）-FITC细胞凋亡检测试剂盒（天津三箭生物技术有限公司）。
参照文献[14]的方法培养并鉴定Müller细胞，取第2～4代细胞进行实验。按照培养液的葡萄糖浓度分为正常糖组（N组，5.5 mmol/L葡萄糖），高糖组（HG组，45.0 mmol/L葡萄糖）及tBHQ干预组（HG+tBHQ组）。参照文献[15]方法在HG+tBHQ组视网膜Müller细胞培养48 h后，加入tBHQ 20 μmol/L干预处理48 h。
免疫荧光染色法鉴定Müller细胞，GS抗体和DAPI染色观察Müller细胞形态。采用胰蛋白酶消化第2代对数生长期的Müller细胞，将Müller细胞用4%多聚甲醛固定在盖玻片上15 min，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤5 min。室温下封闭工作流体处理盖玻片10 min。PBS洗涤5 min，山羊血清室温下封闭15 min。细胞与GS抗体在4℃温育过夜。PBS洗涤盖玻片，与FITC偶联的山羊抗兔二抗在室温下孵育50 min。PBS洗涤后，DAPI染色5 min，PBS洗涤3次，滴加适量的抗荧光淬灭剂于Müller细胞上，荧光显微镜下观察。
蛋白免疫印迹法（Western blot）检测各组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白的表达。胰蛋白酶消化第2代对数生长期的Müller细胞，低速离心收集细胞，裂解液冲洗抽提蛋白，4 ℃ 13 000 g离心5 min，收集上清，每孔40 μg蛋白加上样缓冲液后煮沸5 min，12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酞胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，封闭。加入兔抗鼠Nrf2一抗（1∶1000），HO-1一抗（1∶2000），PI3K一抗（1∶3000），Bcl-2一抗（1∶1000）和Bax一抗（1∶1000）4 ℃孵育过夜，洗涤后加羊抗兔二抗（1∶3000），室温孵育30 min，洗涤后加入新鲜配制的增强化学发光混合溶液到膜的蛋白面侧，暗室中曝光。胶片进行扫描存档，AlphaEaseFC软件处理系统分析目标条带的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。以Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax和GAPDH的比值作为各蛋白的相对表达量。
参照文献[16]方法，实时荧光定量聚合酶链（qRT-PCR）检测各组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA的表达。Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax、GAPDH引物长度分别为294、290、262、214、148、210碱基对（bp）。72～95 ℃，每上升0.5 ℃取1次荧光值，最后生成溶解曲线，所有的样本均重复检测3次，最后计算出Ct值。各因子的表达量采用△△Ct方法进行计算分析，即通过计算目的基因相对于参照因子的倍数来比较mRNA的表达差异，管家基因GAPDH作为内参基因。△△Ct=（待测样品目的基因的Ct平均值−待测样本内参基因的Ct平均值）−（对照样品目的基因的Ct平均值）。目的基因的相对拷贝量F=2−△△Ct。
参照文献[17]方法，流式细胞仪检测各组Müller细胞的凋亡率。采用15 mW氩离子激光，激发光波长为488 nm，发射波长530 nm，CEL LQuest软件自动获取1×104个细胞样品。流式细胞仪定量分析，计算Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）双染阳性细胞百分比含量。
SPSS17.0软件行统计学处理。结果以均数±标准差（
±s）表示。相同指标多组间比较行单因素方差分析，组间两两比较采用最小显著差法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
荧光显微镜观察发现，95%以上Müller细胞GS染色阳性；细胞体大，细胞浆丰富，绿色荧光均匀一致；细胞核DAPI染色呈圆形或卵圆形，边界清晰，蓝色荧光均匀一致（图1）。
Western blot检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（F=73.831）、HO-1（F=148.618）、PI3K（F=83.540）、Bcl-2（F=150.381）、Bax（F=234.459）蛋白表达比较，差异均有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG组Müller细胞中Nrf2（t=4.114）、HO-1（t=9.275）蛋白表达较N组升高，差异有统计学意义（P=0.006、0.000）。HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（t=7.847）、HO-1（t=7.947）、PI3K（t=5.397）、Bcl-2（t=6.825）蛋白表达较HG组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.002、0.000）；Bax蛋白表达较HG组降低，差异有统计学意义（t=14.998、P=0.000）（图2）。
图2
N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表达情况。2A. 电泳图；2B. Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax蛋白表达结果。* HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
qRT-PCR检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（F=340.317）、HO-1（F=1 582.911）、PI3K（F=81.807）、Bcl-2（F=133.630）、Bax（F=283.850）mRNA比较，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）。 HG组Müller细胞中Nrf2（t=7.292）、HO-1（t=15.014）较N组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000）。HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2（t=18.046）、HO-1（t=39.458）、PI3K（t=4.979）、Bcl-2（t=9.535）mRNA较HG组升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.003、0.000）；Bax mRNA较HG组降低，差异有统计学意义（t=16.520、P=0.000）（图3）。
图3
N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞中Nrf2、HO-1、PI3K、Bcl-2、Bax mRNA表达情况。 * HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
流式细胞仪检测结果显示，N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞的凋亡率分别为（3.95±0.68）%、（39.77±1.76）%、（20.84±0.23）%。三组Müller细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=797.079、P=0.000）。HG组Müller细胞凋亡率较N组增高，差异有统计学意义（t=39.905、P=0.000）；HG+tBHQ组Müller细胞凋亡率较HG组降低，差异均有统计学意义（t=21.083、P=0.000）（图4）。
图4
Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪检测N组、HG组、HG+tBHQ组Müller细胞凋亡情况。4A.三组Müller细胞凋亡结果；4B.三组Müller细胞凋亡率比较。* HG组与N组比较，P＜0.05；# HG+tBHQ组与HG组比较，P＜0.05
3 讨论
目前已经发现Nrf2在人视网膜Müller细胞中表达[18]，同时也发现DR患者视网膜中Nrf2表达增加[19]。本研究结果发现，N组Müller细胞中Nrf2表达，HG组Nrf2表达增加。Nrf2可调节直接和间接抗氧化，间接酶包括HO-1[20-22]。本研究结果表明，高糖条件下，Müller细胞中Nrf2及其下游抗氧化蛋白HO-1的表达增加，说明此时Müller细胞有助于维持细胞氧化还原状态并防止氧化。既往部分研究发现，尽管糖尿病环境中Nrf2表达增加，但其在细胞核中的表达水平和DNA结合活性却低于正常水平[19]。表明虽然在糖尿病环境中细胞产生更多的Nrf2，导致Nrf2产量增加，但是不能到达细胞核以增强转录机制。
本研究结果发现，tBHQ干预进一步增加了Nrf2和HO-1在Müller细胞中的表达，与Zhong等[19]结果一致。Zhong等[19]发现，tBHQ在高糖条件下干预牛视网膜内皮细胞，可以激活Nrf2活性。其他一些研究也发现，tBHQ在体内通过促进Nrf2蛋白入细胞核，继而激活Nrf2-ARE信号通路，启动HO-1基因的表达[23,24]。上述结果均表明，tBHQ可以通过增加Nrf2和HO-1的活性发挥Müller细胞的抗氧化功能。
PI3K/Akt通路在DR中发挥重要作用，糖尿病大鼠视网膜中PI3K，Akt-1和Akt-3活性丧失[3]。本研究结果也发现高糖环境下，大鼠Müller细胞中PI3K表达降低。PI3K/Akt途径是细胞存活途径的主要调节因子[4]。该途径的激活可以导致Bcl-2家族的抗凋亡成员增加和促凋亡蛋白的水平降低[5-7]。作为Bcl-2家族成员，抗凋亡因子Bcl-2和促凋亡因子Bax在线粒体途径中天生平衡，并且这种平衡可以决定糖尿病刺激后Müller细胞的存活或死亡[25-29]。越来越多的证据表明，高血糖导致Müller细胞死亡是通过细胞凋亡实现[30,31]。本研究结果显示，高糖条件下Müller细胞Bcl-2表达下降，Bax表达增加；表明高糖环境下Müller细胞凋亡程序激活。 PI3K/Akt途径也调控Nrf2介导的抗氧化功能[32,33]。已经有研究发现，PI3K参与Nrf2的解离和核转运以影响其下游的氧化应激产物[34]。tBHQ可以刺激PI3k依赖性Akt磷酸化，上调Nrf2介导的抗氧化应答元件的活性[8,9]。本研究结果显示，tBHQ诱导干预后，PI3K，Nrf2和Bcl- 2表达升高，Bax表达降低；提示tBHQ可能通过激活PI3K-Nrf2途径抑制Müller细胞的凋亡。既往有研究发现，褪黑激素是一种理想的抗氧化药物，褪黑激素在DR中通过激活Müller细胞中的PI3K/Akt-Nrf2信号通路，通过诱导HO-1的表达增强细胞抗氧化防御能力[35]。同时，我们的研究也发现，tBHQ干预后，HO-1随着Nrf2表达的增加而增加；表明tBHQ可能通过激活PI3K-Nrf2途径诱导HO-1的分泌，从而导致抗氧化应激和抗凋亡。同时有研究发现，tBHQ也可激活Nrf2-AREr3通路，诱导Bcl-2基因转录，下调Bax蛋白表达，起到抗氧化和抗凋亡的作用[36]。然而，也有部分研究发现，tBHQ确实能有效阻止肝细胞的死亡并抑制心肌细胞凋亡，但tBHQ的保护作用与Nrf2的激活无关，而与Akt的急性激活有关[37,38]。说明tBHQ的抗凋亡保护作用有可能是通过激活PI3K/Akt信号通路而起作用，而与Nrf2的激活无关。以上这些发现还需要进一步实验进行验证。
本研究参照文献[15]的方法使用浓度为20 μmol/L tBHQ对高糖培养的Müller细胞干预48 h，发现tBHQ可诱导Müller细胞中各因子的变化。然而不同浓度的tBHQ及干预不同时间点可能会诱发各因子不一样的表达，后期将进行进一步的研究。
本研究结果发现，高糖环境下Müller细胞产生更多的Nrf2和HO-1，虽然其产量增加，但不能到达细胞核以增强转录机制。tBHQ不仅能激活Nrf2和HO-1在Müller细胞中的表达以抗氧化反应，而且还通过激活PI3K信号通路来抑制Müller细胞的凋亡。 tBHQ也可能是通过激活PI3K-Nrf2途径诱导HO-1分泌，从而抗氧化应激，抗凋亡作用。tBHQ在高糖环境下诱导Müller细胞中Nrf2、HO-1及PI3K的表达具有巨大的潜力，以保护Müller细胞免受氧化应激和凋亡的损伤，并且可能对未来治疗DR具有重要的作用。
