目前关于糖尿病视网膜病变（DR）发病机制有多种观点，主要包括高糖所致视网膜微环境改变、糖基化终末产物形成、氧化应激损伤、炎症反应、促血管新生因子产生等。这些机制产生的共同通路是导致视网膜出现神经退行性病变及微血管损伤。近年来，细胞再生疗法在疾病的修复作用过程中起到越来越重要的作用。不同种类的干细胞对于视网膜均有神经及血管保护作用，但是作用的靶点侧重点不同。干细胞既可以通过旁分泌产生营养因子起到调节视网膜微环境及保护视网膜神经细胞的作用，又可以通过潜在的免疫调节来减少免疫损伤，还可以通过再生功能向受损伤的细胞定向分化。结合以上特点，干细胞显示了对DR的修复潜能，这种基于干细胞的再生疗法对于临床的应用提供了前期依据。但是在干细胞移植过程中，关于干细胞的异质性、细胞传送、向受损伤组织有效的归巢及移植仍是细胞疗法的难题。
引用本文： 曹博雯, 孟旭霞. 不同类型的干细胞在糖尿病视网膜病变中的作用研究进展. 中华眼底病杂志, 2018, 34(4): 415-421. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.04.026 复制
目前对于糖尿病视网膜病变（DR）的治疗手段主要有激光光凝、玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（VEGF）药物和玻璃体切割手术，均以延缓或阻止持续的退行性病变为治疗目的，而不是针对该疾病的发病机制展开治疗。近年来，包括细胞特异性内生干细胞、内皮祖细胞（EPCs）、胚胎干细胞（ESC）、诱导多功能干细胞（iPSC）及间充质干细胞（MSCs）在内的细胞再生疗法在临床前期的疾病治疗研究中占据着越来越重要的地位。不同种类的干细胞对于视网膜均有神经及血管保护作用，但是作用的靶点侧重点不同。了解不同种类干细胞在DR中的作用，有利于干细胞再生疗法在DR临床治疗研究中的应用开展。现针对不同类别的干细胞在DR中的作用作一综述。
1 DR的发病机制
视网膜是体内代谢活动最活跃的组织，它的这种高代谢率需要一个结构和功能完整的血管系统及血管周围起到支撑和营养作用的神经系统支撑。眼动脉20%的血液供应到视网膜，视网膜中央动脉又分支成密集的毛细血管网组成血视网膜屏障（BRB）。这种高度选择性的屏障由相互接壤的内皮细胞连接及内皮细胞外包绕的周细胞和胶质细胞组成，周细胞和胶质细胞可以根据视网膜内层的代谢负荷来调节血流。高度敏感的神经视网膜依赖这种控制氧化和小血管多余产能，所以一旦视网膜产生缺血而致组织灌注受损，受影响区域的神经元就会立即死亡[1]。DR作为一种视网膜缺血性病变，亦将产生上述病变过程，最终导致无细胞毛细血管区域形成、视网膜神经元的死亡、继发性炎症反应以及代偿性新生血管所致的视网膜损伤[2-8]。
DR历来被视为血管性疾病，或者更具体的来说，是一种视网膜内层微血管性的血管内皮细胞疾病。然而近年来，越来越多的研究认为，糖尿病相关的神经退行性病变的出现要明显早于内皮细胞的改变[9-14]。这就揭示了DR其实是一种神经血管退行性疾病。
1.1 糖尿病诱导视网膜神经退行性病变
DR不仅仅是一种单独的血管病变，视网膜神经元和神经胶质细胞也在整个疾病的进展过程中扮演着极其重要的地位。神经胶质细胞功能异常与视网膜病变是相关的。在视网膜出现血管病变之前，已经有可见的视网膜神经退行性病变出现，即神经细胞凋亡和胶质细胞活化，目前二者被认为是DR的重要组织学特征。神经元细胞位于视网膜的最内层，是糖尿病相关凋亡过程发生最早的部位。最近的研究证明，DR早期的神经视网膜即存在促凋亡和促生长信号的不平衡[9]。视网膜星形胶质细胞和Müller细胞参与胶质细胞活化。糖尿病同样与小胶质细胞活化有关，小胶质细胞是位于视网膜内层的自身监控免疫细胞，可以释放化学因子促进神经细胞死亡[10]。此外由于新陈代谢的加剧恶化而导致的高糖血症和活性氧（ROS）产物的增加会影响视网膜神经细胞的功能和活性[11-13]。过量的ROS产物会导致一些生物分子，如脂质、蛋白质、DNA的氧化性损伤。视网膜神经节细胞和胶质细胞对氧化应激诱导的损伤尤为敏感，从而导致这些细胞较早产生凋亡[14]。视网膜神经保护因子水平也明显减少，进一步加速神经元死亡[11-13]。
神经退行性病变的确在DR发生发展中起重要作用，值得注意的是Müller细胞在此过程中产生的一些因子可以调节血流、血管通透性及细胞存活，且该细胞围绕在视网膜的整个血管外周，因此对于BRB也起到保护作用[15]。除了Müller细胞外，与血管相邻的小胶质细胞的活化同样对血管退行性病变起到重要作用，血管退行性病变是动物模型或糖尿病患者的早期糖尿病视网膜血管病变的一个标志性特征[16, 17]。由此可见，DR中神经退行性病变与血管病变存在一定的关联。
1.2 糖尿病诱导视网膜微血管病变
视网膜功能的正常维持，需要完整的血管壁及BRB。BRB由内皮细胞之间的连接、基底膜及血管外的周细胞组成。在糖尿病中，长期的高糖环境会导致内皮细胞、周细胞及血管平滑肌细胞的功能紊乱及死亡，内皮细胞及周细胞自我更新能力受损，它们的再生能力也被耗尽，BRB最终遭到破坏。在糖尿病患者及大鼠模型中可以观察到内皮细胞死亡出现在没有任何视网膜组织病理学改变之前，最终导致毛细血管幻影的出现[18]。糖尿病中高糖和缺氧的环境使得内皮细胞的增生率要比在正常环境下高，最终导致复制性衰老（一种不可逆的细胞周期阻滞）[19]。
除内皮细胞受损外，周细胞丢失也是DR的一个早期特征。视网膜血管处周细胞的缺失是先于其他血管病变的一个引发因素。动物实验表明，在糖尿病2个月时可出现周细胞的缺失，而在6个月时才可观察到无细胞毛细血管的形成[20]。周细胞的缺失会削弱BRB的功能且会导致毛细血管的不稳定和血管的渗透性增加。
此外，细胞旁路的微血管成分受损对于BRB的破坏同样是不可或缺的原因之一。BRB之间的紧密连接也参与维持血管通透性，它可以有效阻止细胞与细胞之间的物质转运等细胞旁路的血管通透性增加。一些紧密连接蛋白参与维持BRB的形成[21]。体内外研究发现，紧密连接蛋白的磷酸化作用及血管通透性受到一些激酶和磷酸酶调节，血管通透性的增加与闭合蛋白的磷酸化活化增加、闭合蛋白数量的减少有关[22]。表明闭合蛋白的磷酸化可造成其在紧密连接蛋白复合体中的缺失，造成细胞旁通透性增加[23]。最终导致血管中的大分子物质从视网膜血管渗漏到视网膜细胞间隙，形成脂质渗出，造成视力下降。
2 DR治疗
目前针对DR尚无有效的治疗，所以预防显得尤为重要。严格的血糖、胆固醇控制及戒烟对于疾病的进展提供了保护性作用[24, 25]。非增生期DR以微动脉瘤、硬性渗出、棉绒斑、毛细血管无灌注区形成以及视网膜内微血管异常为特征。当这些病变进展到威胁视力的黄斑水肿及增生期DR时，可以采用激光光凝，破坏周围视网膜，从而减少供氧需求。但是激光治疗会出现一定的并发症，如视敏度下降、中央视网膜增厚、视野缩小等。抗VEGF药物及玻璃体切割手术也是临床应用较为成熟的方法，但都不以提高视力为治疗目的，且都存在眼内炎、牵拉性视网膜脱离等相应并发症。目前尚无促进受损视网膜血管再生的疗法。然而，最近对MSCs、EPCs和脂肪基质干细胞（ASCs）的研究表明，细胞疗法可能是预防神经血管损伤并促进损伤的视网膜再生的可行性选择[26-28]。
3 不同类型的干细胞及其在DR中的作用
3.1 MSCs
MSCs是多功能基质细胞，最初来源于骨髓，后来从脂肪组织、胎盘、脐带血、华通氏胶、牙髓、心肌和肝脏中也可分离得到。MSCs在体外培养时，表达表面标志物CD105、CD73、基质抗原1、CD44、CD90、CD166、CD54和CD49，但是缺乏造血干细胞（CD14、CD45、CD11a）的标志物、红细胞标志物（血型糖蛋白A）和血小板标志物（CD31）。MSCs具有自我更新和分化的功能，主要分化为中胚层来源的组织，但也可分化为内胚层和外胚层的组织[29, 30]。近年来研究发现，MSCs可能成为疾病治疗和组织替代方面的最佳疗法，已经提出至少三种潜在的作用机制。
首先，体内外研究均表明，MSCs最重要的作用就是具有旁分泌营养的作用。这些细胞可以分泌神经营养因子和血管生成因子，比如睫状生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、VEGF、转化生长因子（TGF）-β，DR所造成的缺氧环境可能具有加速旁分泌因子生成的作用。一项动物实验研究发现，玻璃体腔注射胎盘源性MSCs可明显抑制链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠的视网膜神经细胞凋亡，这可能是由于玻璃体腔局部注射所导致的视网膜内的神经保护因子密度增加[31]。
其次，这些细胞具有向受损组织分化的能力，但是其分化的能力是有限的，因为细胞具有多向分化能力而不是特异性向某种类型的细胞分化。已有报道指出，MSCs可以分化为肌源性成分及内皮细胞[32]。在糖尿病神经病变的动物模型中，骨髓来源的MSCs可以直接调节血管再生和周围神经髓鞘的形成[33]。这些干细胞首先移位到周围神经系统但是没有分化为神经元。因此，直接的组织替代可能不是这些细胞在退行性病变中的主要修复机制。MSCs在老年性黄斑变性及视网膜色素变性等退行性病变中具有支撑和替代受损的神经视网膜的作用。通过局部或全身注射骨髓或脂肪来源的MSCs于糖尿病动物模型体内，MSCs可以分化为光感受器细胞及神经色素上皮细胞[34-36]。但目前尚不清楚所观察到的这种现象是干细胞直接分化为受损的细胞还是干细胞与已经存在的光感受器细胞的融合。虽有很多机制尚未阐明，但MSCs的确延缓了糖尿病视网膜神经退行性病变且具有视力保护的作用。
最后，MSCs是免疫调节细胞，具有免疫调节功能。它可以抑制在体的单核细胞向巨噬细胞分化；增加抗炎因子白细胞介素（IL）-10的水平，降低促炎因子IL-12和干扰素-γ的水平，抑制杀伤性T细胞的增生，增加调节性T细胞（T-reg）的数量，从而形成一个免疫耐受的环境[26, 29, 30]。MSCs对于糖尿病进展的易感性可能与T-reg的免疫调节活性有关，因此MSCs治疗糖尿病的潜在机制主要是通过释放营养和免疫调节因子来保护血管细胞[26, 37]。然而这个假想是否合理还有待进一步观察研究。但是，MSCs的确可以暂时性逆转非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠的高血糖水平，而NOD骨髓来源的MSCs则不具有这种功能，可能是因为NOD小鼠的长期高血糖已经导致骨髓微环境发生了变化，其产生的干细胞存在功能受损的情况[38]。
尽管MSCs对视网膜神经血管具体保护机制尚不清楚，但其好处是显而易见的。目前正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验观察它们对DR等缺血性视网膜病变的视力影响[39]。
3.2 EPCs
EPCs代表一种细胞异质性群体，它的来源较为广泛，大部分来源于促血管生成的造血细胞，也可以来源于造血干细胞和祖细胞[40, 41]。EPCs于1997年被首次阐明，该研究表明从人外周血中分离得到的CD34+细胞，在体外实验中可以分化为内皮细胞，而体内实验中可参与新生血管的形成[42]。通常把人类外周血中具有阳性干细胞表面标志[CD34、VEGF受体2和（或）CD133]的单核细胞定义为EPCs。从外周血中分离出的EPCs有两种主要亚型，它们具有一些共同的表面标志物，如CD34、CD131和激酶结构域受体[43, 44]。第一种亚型是内皮集落形成细胞，它可以直接整合到成熟的血管，形成内皮细胞层来参与损伤血管的修复[45, 46]，也可以分泌血管修复所需的旁分泌因子[47]。另外一种亚型是内皮细胞集落形成单位，它只能以旁分泌的方式发挥作用，比如释放生长因子刺激受损区域的血管EPCs形成血管壁[41, 48]。外周血中循环的EPCs数量和血管再生能力在疾病的不同阶段是不同的，如在伴有糖尿病、高血脂、高血压或吸烟等这些危险因素的心脏病患者中，外周血EPCs数量减少，功能特性也发生变化[49]。
目前，EPCs已经作为一种潜在疗法应用于临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期非眼部缺血性疾病的临床试验研究，包括缺血性心肌病、周围缺血病变、脑血管意外等[50]。EPCs与其他分化成熟的内皮细胞相比，具有更强的抗氧化应激能力[51]。这也就提示直接将血管祖细胞移植到受损的血管内皮部位可以导致组织再生。此外，EPCs还具有旁分泌营养的功能，它可以分泌促血管生成因子（VEGF、干细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、肝细胞生长因子）和神经营养因子，已经发现在糖尿病神经病变中具有治疗意义[52]。它还可通过旁分泌作用阻止氧化应激所导致的成熟内皮细胞凋亡[53]。大量有说服力的研究表明，EPCs可以改善周边缺血部位的血液灌注[42, 54-56]。体内研究发现，人iPSC可以分化为血管EPCs，进而整合到受损的内皮细胞[54]；成体干细胞及人类ESC来源的成血管细胞被证明具有内皮细胞功能[55]。骨髓来源的EPCs移植导致供体来源的内皮细胞参与血管壁的形成，说明循环血细胞可以参与内皮细胞损伤的修复[56]。这些存在于循环血中的少量细胞，也就是EPCs，能够迁移到缺血部位并整合至活跃的血管生成区域[42]。
在糖尿病中，视网膜内微血管异常包含很多内皮细胞，这种现象可能是由缺血性视网膜为促进血管新生所导致。尽管糖尿病视网膜血管的再生是减少的，但这种疾病的慢性进展性的特点为代偿性血管的再生提供了条件。如果有成功针对视网膜血管再生的靶向疗法，就有可能消除DR引起的视网膜缺血。
CD34+细胞已经作为一种潜在疗法在DR及缺血再灌注等缺血性视网膜病变的小鼠模型中应用[57]。全身或玻璃体腔局部注射外周血或骨髓来源的CD34+ EPCs可以导致这些细胞快速归巢到受损的视网膜血管处。尽管移植率低，但是观察发现，通过单次静脉注射，这些细胞可以整合到视网膜血管长达6个月之久[58]。EPCs对于受损视网膜血管的修复作用是很明显的，这就揭示EPCs具有治疗作用，且尚未发现不良反应。
早期DR以血管退行性病变为其主要标志，糖尿病环境可以产生大量的ROS产物，血管祖细胞就会产生病理性因子（肿瘤坏死因子-α、IL-8），增加病理性的诱导型NO合酶而非内皮型NO合酶的表达[27]。内皮型NO合酶活性的下降或者通过上调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶导致的ROS水平增加都可导致糖尿病环境下EPCs的NO生物活性下降[59]。NO介导的信号通路对于骨髓来源的EPCs动员及向受损血管的归巢具有重要作用；同样，在晚期DR患者中发现，尽管其循环血中的CD34+ EPCs要比对照组多，这些细胞在迁移、整合及形成血管方面的能力是有缺陷的[60]。尽管有这些缺点，细胞疗法对晚期DR及其他缺血性视网膜病变仍然是一种有效的选择。细胞疗法主要是针对早中期DR进行治疗，它可以促进血管修复、逆转缺血、减少缺氧或炎症信号，进而阻止向晚期和不可逆转的视力损害期进展[27]。因此，EPCs在DR治疗中是有前景的，但仍需克服上述存在的问题。
3.3 ASCs
具有MSCs和EPCs共同特性的祖细胞是从一类成体组织类型中分离出来的，其中ASCs就是一类这样的祖细胞，从脂肪组织中分离而来。目前，ASCs在DR中的作用研究受到越来越多的关注。在链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠模型中，静脉注射ASCs，血糖水平可在1周后显著降低，BRB完整性得以改善。从脂肪组织中分离出的CD34+细胞可以抑制内皮细胞凋亡、稳定血管，且认为其来源于周细胞[61, 62]。在Akimba糖尿病小鼠中，静脉注射的ASCs可以整合到视网膜血管中，抑制内皮细胞凋亡及减少约80%的毛细血管丢失，且可以通过TGF-b1的治疗加速ASCs来源的周细胞表型（与视网膜本身的周细胞相似）形成，获得周细胞定位，使得ASCs治疗更加有效[63]。
有研究发现，ACSs在视网膜上表达视紫红质和胶质原纤维酸性蛋白质，暗示了供体细胞向光感受器细胞和胶质样细胞分化[64]。将ASCs静脉注射到Ⅰ型免疫缺陷的糖尿病鼠体内可以改善视网膜电图，从而提供一个神经保护作用[28]。综上，ASCs不仅可以降低血糖还可以起到神经血管保护作用，但是其对神经及血管病变的修复作用到底是由于血糖降低引起视网膜微环境改善还是ASCs直接替代受损组织尚不清楚。进一步研究表明，糖尿病模型鼠玻璃体腔注射ASCs来源的营养因子在稳定血管及保护视网膜细胞免受糖尿病环境影响起着关键作用。以上临床前期研究为下一步ASCs作为DR中毛细血管缺失及神经退行性病变的一种临床治疗提供有力的依据。
3.4 多功能干细胞
多能干细胞具有分化成熟为任何一种细胞的能力。iPSC主要来源于ESC。ESC来源的视网膜祖细胞具有向光感受器细胞整合及分化的能力[65]。研究表明，视网膜退行性病变小鼠模型在注射ESC以后，视力得到提高[65, 66]。在糖尿病中，视网膜色素上皮（RPE）层的紧密连接受损导致RPE屏障破坏，这表明RPE细胞替代疗法在DR的治疗中同样很重要[67, 68]。
近年来研究发现，CD34+脐带血细胞来源的iPSC可以产生血管祖细胞[69]。这些iPSC是通过高水平的VEGF干预后被刺激分化为CD34+/CD146+的血管祖细胞[70]。然而通过不同的移植途径，血管祖细胞存在的位置是不同的。NOD/非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠模型中，示踪发现血管祖细胞移位至无细胞毛细血管外的周细胞部位；当经过静脉注射后，它们整合到血管管腔的内皮细胞部位，证明它们具有分化为内皮细胞的潜能[58]。
iPSC的应用为脐带血中CD34+细胞治疗无细胞毛细血管的再生提供了一种可行的疗法。在分化过程中，iPSC可能会表现出一些表观遗传学改变，这些改变是基于糖尿病代谢记忆产生的，因此寻找一种不受糖尿病环境影响的自体iPSC对于DR的辅助治疗十分重要。
4 总结与展望
干细胞在延缓DR的进程、减轻DR的症状方面具有潜在的治疗意义。目前，对于干细胞治疗DR的研究主要侧重于视网膜早期病变，即在增生期DR出现之前。一些类型的干细胞分泌特殊的生长因子，进而对糖尿病的视网膜产生神经保护作用；另外一些类型的干细胞，可以减少及修复毛细血管闭塞、减少周细胞的缺失，可以向周细胞及内皮细胞分化，从而对DR中受损的血管产生保护作用。ESC和iPSC同样可以产生具有再生能力的干细胞，加速向糖尿病中受损的视网膜细胞分化。但上述研究中的干细胞都是异体来源，若取自糖尿病本身骨髓、脂肪等组织来源的干细胞，由于这些细胞长期受糖尿病环境的影响，所处的微环境已经发生变化，在修复视网膜损伤时，功能较正常环境来源的干细胞明显削弱。目前一些研究倾向于诱导糖尿病来源的祖细胞恢复正常功能，为实现自体疗法提供可能。
干细胞疗法在DR血管和神经元损害中均具有再生和修复的潜能。接下来，对干细胞再生的分子机制进一步研究可为治疗DR等缺血性视网膜病变提供新的药理及遗传学方法，同时还可加强现有干细胞疗法的治疗效果。
目前对于糖尿病视网膜病变（DR）的治疗手段主要有激光光凝、玻璃体腔注射抗血管内皮生长因子（VEGF）药物和玻璃体切割手术，均以延缓或阻止持续的退行性病变为治疗目的，而不是针对该疾病的发病机制展开治疗。近年来，包括细胞特异性内生干细胞、内皮祖细胞（EPCs）、胚胎干细胞（ESC）、诱导多功能干细胞（iPSC）及间充质干细胞（MSCs）在内的细胞再生疗法在临床前期的疾病治疗研究中占据着越来越重要的地位。不同种类的干细胞对于视网膜均有神经及血管保护作用，但是作用的靶点侧重点不同。了解不同种类干细胞在DR中的作用，有利于干细胞再生疗法在DR临床治疗研究中的应用开展。现针对不同类别的干细胞在DR中的作用作一综述。
1 DR的发病机制
视网膜是体内代谢活动最活跃的组织，它的这种高代谢率需要一个结构和功能完整的血管系统及血管周围起到支撑和营养作用的神经系统支撑。眼动脉20%的血液供应到视网膜，视网膜中央动脉又分支成密集的毛细血管网组成血视网膜屏障（BRB）。这种高度选择性的屏障由相互接壤的内皮细胞连接及内皮细胞外包绕的周细胞和胶质细胞组成，周细胞和胶质细胞可以根据视网膜内层的代谢负荷来调节血流。高度敏感的神经视网膜依赖这种控制氧化和小血管多余产能，所以一旦视网膜产生缺血而致组织灌注受损，受影响区域的神经元就会立即死亡[1]。DR作为一种视网膜缺血性病变，亦将产生上述病变过程，最终导致无细胞毛细血管区域形成、视网膜神经元的死亡、继发性炎症反应以及代偿性新生血管所致的视网膜损伤[2-8]。
DR历来被视为血管性疾病，或者更具体的来说，是一种视网膜内层微血管性的血管内皮细胞疾病。然而近年来，越来越多的研究认为，糖尿病相关的神经退行性病变的出现要明显早于内皮细胞的改变[9-14]。这就揭示了DR其实是一种神经血管退行性疾病。
1.1 糖尿病诱导视网膜神经退行性病变
DR不仅仅是一种单独的血管病变，视网膜神经元和神经胶质细胞也在整个疾病的进展过程中扮演着极其重要的地位。神经胶质细胞功能异常与视网膜病变是相关的。在视网膜出现血管病变之前，已经有可见的视网膜神经退行性病变出现，即神经细胞凋亡和胶质细胞活化，目前二者被认为是DR的重要组织学特征。神经元细胞位于视网膜的最内层，是糖尿病相关凋亡过程发生最早的部位。最近的研究证明，DR早期的神经视网膜即存在促凋亡和促生长信号的不平衡[9]。视网膜星形胶质细胞和Müller细胞参与胶质细胞活化。糖尿病同样与小胶质细胞活化有关，小胶质细胞是位于视网膜内层的自身监控免疫细胞，可以释放化学因子促进神经细胞死亡[10]。此外由于新陈代谢的加剧恶化而导致的高糖血症和活性氧（ROS）产物的增加会影响视网膜神经细胞的功能和活性[11-13]。过量的ROS产物会导致一些生物分子，如脂质、蛋白质、DNA的氧化性损伤。视网膜神经节细胞和胶质细胞对氧化应激诱导的损伤尤为敏感，从而导致这些细胞较早产生凋亡[14]。视网膜神经保护因子水平也明显减少，进一步加速神经元死亡[11-13]。
神经退行性病变的确在DR发生发展中起重要作用，值得注意的是Müller细胞在此过程中产生的一些因子可以调节血流、血管通透性及细胞存活，且该细胞围绕在视网膜的整个血管外周，因此对于BRB也起到保护作用[15]。除了Müller细胞外，与血管相邻的小胶质细胞的活化同样对血管退行性病变起到重要作用，血管退行性病变是动物模型或糖尿病患者的早期糖尿病视网膜血管病变的一个标志性特征[16, 17]。由此可见，DR中神经退行性病变与血管病变存在一定的关联。
1.2 糖尿病诱导视网膜微血管病变
视网膜功能的正常维持，需要完整的血管壁及BRB。BRB由内皮细胞之间的连接、基底膜及血管外的周细胞组成。在糖尿病中，长期的高糖环境会导致内皮细胞、周细胞及血管平滑肌细胞的功能紊乱及死亡，内皮细胞及周细胞自我更新能力受损，它们的再生能力也被耗尽，BRB最终遭到破坏。在糖尿病患者及大鼠模型中可以观察到内皮细胞死亡出现在没有任何视网膜组织病理学改变之前，最终导致毛细血管幻影的出现[18]。糖尿病中高糖和缺氧的环境使得内皮细胞的增生率要比在正常环境下高，最终导致复制性衰老（一种不可逆的细胞周期阻滞）[19]。
除内皮细胞受损外，周细胞丢失也是DR的一个早期特征。视网膜血管处周细胞的缺失是先于其他血管病变的一个引发因素。动物实验表明，在糖尿病2个月时可出现周细胞的缺失，而在6个月时才可观察到无细胞毛细血管的形成[20]。周细胞的缺失会削弱BRB的功能且会导致毛细血管的不稳定和血管的渗透性增加。
此外，细胞旁路的微血管成分受损对于BRB的破坏同样是不可或缺的原因之一。BRB之间的紧密连接也参与维持血管通透性，它可以有效阻止细胞与细胞之间的物质转运等细胞旁路的血管通透性增加。一些紧密连接蛋白参与维持BRB的形成[21]。体内外研究发现，紧密连接蛋白的磷酸化作用及血管通透性受到一些激酶和磷酸酶调节，血管通透性的增加与闭合蛋白的磷酸化活化增加、闭合蛋白数量的减少有关[22]。表明闭合蛋白的磷酸化可造成其在紧密连接蛋白复合体中的缺失，造成细胞旁通透性增加[23]。最终导致血管中的大分子物质从视网膜血管渗漏到视网膜细胞间隙，形成脂质渗出，造成视力下降。
2 DR治疗
目前针对DR尚无有效的治疗，所以预防显得尤为重要。严格的血糖、胆固醇控制及戒烟对于疾病的进展提供了保护性作用[24, 25]。非增生期DR以微动脉瘤、硬性渗出、棉绒斑、毛细血管无灌注区形成以及视网膜内微血管异常为特征。当这些病变进展到威胁视力的黄斑水肿及增生期DR时，可以采用激光光凝，破坏周围视网膜，从而减少供氧需求。但是激光治疗会出现一定的并发症，如视敏度下降、中央视网膜增厚、视野缩小等。抗VEGF药物及玻璃体切割手术也是临床应用较为成熟的方法，但都不以提高视力为治疗目的，且都存在眼内炎、牵拉性视网膜脱离等相应并发症。目前尚无促进受损视网膜血管再生的疗法。然而，最近对MSCs、EPCs和脂肪基质干细胞（ASCs）的研究表明，细胞疗法可能是预防神经血管损伤并促进损伤的视网膜再生的可行性选择[26-28]。
3 不同类型的干细胞及其在DR中的作用
3.1 MSCs
MSCs是多功能基质细胞，最初来源于骨髓，后来从脂肪组织、胎盘、脐带血、华通氏胶、牙髓、心肌和肝脏中也可分离得到。MSCs在体外培养时，表达表面标志物CD105、CD73、基质抗原1、CD44、CD90、CD166、CD54和CD49，但是缺乏造血干细胞（CD14、CD45、CD11a）的标志物、红细胞标志物（血型糖蛋白A）和血小板标志物（CD31）。MSCs具有自我更新和分化的功能，主要分化为中胚层来源的组织，但也可分化为内胚层和外胚层的组织[29, 30]。近年来研究发现，MSCs可能成为疾病治疗和组织替代方面的最佳疗法，已经提出至少三种潜在的作用机制。
首先，体内外研究均表明，MSCs最重要的作用就是具有旁分泌营养的作用。这些细胞可以分泌神经营养因子和血管生成因子，比如睫状生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、VEGF、转化生长因子（TGF）-β，DR所造成的缺氧环境可能具有加速旁分泌因子生成的作用。一项动物实验研究发现，玻璃体腔注射胎盘源性MSCs可明显抑制链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠的视网膜神经细胞凋亡，这可能是由于玻璃体腔局部注射所导致的视网膜内的神经保护因子密度增加[31]。
其次，这些细胞具有向受损组织分化的能力，但是其分化的能力是有限的，因为细胞具有多向分化能力而不是特异性向某种类型的细胞分化。已有报道指出，MSCs可以分化为肌源性成分及内皮细胞[32]。在糖尿病神经病变的动物模型中，骨髓来源的MSCs可以直接调节血管再生和周围神经髓鞘的形成[33]。这些干细胞首先移位到周围神经系统但是没有分化为神经元。因此，直接的组织替代可能不是这些细胞在退行性病变中的主要修复机制。MSCs在老年性黄斑变性及视网膜色素变性等退行性病变中具有支撑和替代受损的神经视网膜的作用。通过局部或全身注射骨髓或脂肪来源的MSCs于糖尿病动物模型体内，MSCs可以分化为光感受器细胞及神经色素上皮细胞[34-36]。但目前尚不清楚所观察到的这种现象是干细胞直接分化为受损的细胞还是干细胞与已经存在的光感受器细胞的融合。虽有很多机制尚未阐明，但MSCs的确延缓了糖尿病视网膜神经退行性病变且具有视力保护的作用。
最后，MSCs是免疫调节细胞，具有免疫调节功能。它可以抑制在体的单核细胞向巨噬细胞分化；增加抗炎因子白细胞介素（IL）-10的水平，降低促炎因子IL-12和干扰素-γ的水平，抑制杀伤性T细胞的增生，增加调节性T细胞（T-reg）的数量，从而形成一个免疫耐受的环境[26, 29, 30]。MSCs对于糖尿病进展的易感性可能与T-reg的免疫调节活性有关，因此MSCs治疗糖尿病的潜在机制主要是通过释放营养和免疫调节因子来保护血管细胞[26, 37]。然而这个假想是否合理还有待进一步观察研究。但是，MSCs的确可以暂时性逆转非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠的高血糖水平，而NOD骨髓来源的MSCs则不具有这种功能，可能是因为NOD小鼠的长期高血糖已经导致骨髓微环境发生了变化，其产生的干细胞存在功能受损的情况[38]。
尽管MSCs对视网膜神经血管具体保护机制尚不清楚，但其好处是显而易见的。目前正在进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验观察它们对DR等缺血性视网膜病变的视力影响[39]。
3.2 EPCs
EPCs代表一种细胞异质性群体，它的来源较为广泛，大部分来源于促血管生成的造血细胞，也可以来源于造血干细胞和祖细胞[40, 41]。EPCs于1997年被首次阐明，该研究表明从人外周血中分离得到的CD34+细胞，在体外实验中可以分化为内皮细胞，而体内实验中可参与新生血管的形成[42]。通常把人类外周血中具有阳性干细胞表面标志[CD34、VEGF受体2和（或）CD133]的单核细胞定义为EPCs。从外周血中分离出的EPCs有两种主要亚型，它们具有一些共同的表面标志物，如CD34、CD131和激酶结构域受体[43, 44]。第一种亚型是内皮集落形成细胞，它可以直接整合到成熟的血管，形成内皮细胞层来参与损伤血管的修复[45, 46]，也可以分泌血管修复所需的旁分泌因子[47]。另外一种亚型是内皮细胞集落形成单位，它只能以旁分泌的方式发挥作用，比如释放生长因子刺激受损区域的血管EPCs形成血管壁[41, 48]。外周血中循环的EPCs数量和血管再生能力在疾病的不同阶段是不同的，如在伴有糖尿病、高血脂、高血压或吸烟等这些危险因素的心脏病患者中，外周血EPCs数量减少，功能特性也发生变化[49]。
目前，EPCs已经作为一种潜在疗法应用于临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期非眼部缺血性疾病的临床试验研究，包括缺血性心肌病、周围缺血病变、脑血管意外等[50]。EPCs与其他分化成熟的内皮细胞相比，具有更强的抗氧化应激能力[51]。这也就提示直接将血管祖细胞移植到受损的血管内皮部位可以导致组织再生。此外，EPCs还具有旁分泌营养的功能，它可以分泌促血管生成因子（VEGF、干细胞生长因子、胰岛素样生长因子-1、成纤维细胞生长因子-2、肝细胞生长因子）和神经营养因子，已经发现在糖尿病神经病变中具有治疗意义[52]。它还可通过旁分泌作用阻止氧化应激所导致的成熟内皮细胞凋亡[53]。大量有说服力的研究表明，EPCs可以改善周边缺血部位的血液灌注[42, 54-56]。体内研究发现，人iPSC可以分化为血管EPCs，进而整合到受损的内皮细胞[54]；成体干细胞及人类ESC来源的成血管细胞被证明具有内皮细胞功能[55]。骨髓来源的EPCs移植导致供体来源的内皮细胞参与血管壁的形成，说明循环血细胞可以参与内皮细胞损伤的修复[56]。这些存在于循环血中的少量细胞，也就是EPCs，能够迁移到缺血部位并整合至活跃的血管生成区域[42]。
在糖尿病中，视网膜内微血管异常包含很多内皮细胞，这种现象可能是由缺血性视网膜为促进血管新生所导致。尽管糖尿病视网膜血管的再生是减少的，但这种疾病的慢性进展性的特点为代偿性血管的再生提供了条件。如果有成功针对视网膜血管再生的靶向疗法，就有可能消除DR引起的视网膜缺血。
CD34+细胞已经作为一种潜在疗法在DR及缺血再灌注等缺血性视网膜病变的小鼠模型中应用[57]。全身或玻璃体腔局部注射外周血或骨髓来源的CD34+ EPCs可以导致这些细胞快速归巢到受损的视网膜血管处。尽管移植率低，但是观察发现，通过单次静脉注射，这些细胞可以整合到视网膜血管长达6个月之久[58]。EPCs对于受损视网膜血管的修复作用是很明显的，这就揭示EPCs具有治疗作用，且尚未发现不良反应。
早期DR以血管退行性病变为其主要标志，糖尿病环境可以产生大量的ROS产物，血管祖细胞就会产生病理性因子（肿瘤坏死因子-α、IL-8），增加病理性的诱导型NO合酶而非内皮型NO合酶的表达[27]。内皮型NO合酶活性的下降或者通过上调还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶导致的ROS水平增加都可导致糖尿病环境下EPCs的NO生物活性下降[59]。NO介导的信号通路对于骨髓来源的EPCs动员及向受损血管的归巢具有重要作用；同样，在晚期DR患者中发现，尽管其循环血中的CD34+ EPCs要比对照组多，这些细胞在迁移、整合及形成血管方面的能力是有缺陷的[60]。尽管有这些缺点，细胞疗法对晚期DR及其他缺血性视网膜病变仍然是一种有效的选择。细胞疗法主要是针对早中期DR进行治疗，它可以促进血管修复、逆转缺血、减少缺氧或炎症信号，进而阻止向晚期和不可逆转的视力损害期进展[27]。因此，EPCs在DR治疗中是有前景的，但仍需克服上述存在的问题。
3.3 ASCs
具有MSCs和EPCs共同特性的祖细胞是从一类成体组织类型中分离出来的，其中ASCs就是一类这样的祖细胞，从脂肪组织中分离而来。目前，ASCs在DR中的作用研究受到越来越多的关注。在链脲佐菌素诱导的糖尿病鼠模型中，静脉注射ASCs，血糖水平可在1周后显著降低，BRB完整性得以改善。从脂肪组织中分离出的CD34+细胞可以抑制内皮细胞凋亡、稳定血管，且认为其来源于周细胞[61, 62]。在Akimba糖尿病小鼠中，静脉注射的ASCs可以整合到视网膜血管中，抑制内皮细胞凋亡及减少约80%的毛细血管丢失，且可以通过TGF-b1的治疗加速ASCs来源的周细胞表型（与视网膜本身的周细胞相似）形成，获得周细胞定位，使得ASCs治疗更加有效[63]。
有研究发现，ACSs在视网膜上表达视紫红质和胶质原纤维酸性蛋白质，暗示了供体细胞向光感受器细胞和胶质样细胞分化[64]。将ASCs静脉注射到Ⅰ型免疫缺陷的糖尿病鼠体内可以改善视网膜电图，从而提供一个神经保护作用[28]。综上，ASCs不仅可以降低血糖还可以起到神经血管保护作用，但是其对神经及血管病变的修复作用到底是由于血糖降低引起视网膜微环境改善还是ASCs直接替代受损组织尚不清楚。进一步研究表明，糖尿病模型鼠玻璃体腔注射ASCs来源的营养因子在稳定血管及保护视网膜细胞免受糖尿病环境影响起着关键作用。以上临床前期研究为下一步ASCs作为DR中毛细血管缺失及神经退行性病变的一种临床治疗提供有力的依据。
3.4 多功能干细胞
多能干细胞具有分化成熟为任何一种细胞的能力。iPSC主要来源于ESC。ESC来源的视网膜祖细胞具有向光感受器细胞整合及分化的能力[65]。研究表明，视网膜退行性病变小鼠模型在注射ESC以后，视力得到提高[65, 66]。在糖尿病中，视网膜色素上皮（RPE）层的紧密连接受损导致RPE屏障破坏，这表明RPE细胞替代疗法在DR的治疗中同样很重要[67, 68]。
近年来研究发现，CD34+脐带血细胞来源的iPSC可以产生血管祖细胞[69]。这些iPSC是通过高水平的VEGF干预后被刺激分化为CD34+/CD146+的血管祖细胞[70]。然而通过不同的移植途径，血管祖细胞存在的位置是不同的。NOD/非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠模型中，示踪发现血管祖细胞移位至无细胞毛细血管外的周细胞部位；当经过静脉注射后，它们整合到血管管腔的内皮细胞部位，证明它们具有分化为内皮细胞的潜能[58]。
iPSC的应用为脐带血中CD34+细胞治疗无细胞毛细血管的再生提供了一种可行的疗法。在分化过程中，iPSC可能会表现出一些表观遗传学改变，这些改变是基于糖尿病代谢记忆产生的，因此寻找一种不受糖尿病环境影响的自体iPSC对于DR的辅助治疗十分重要。
4 总结与展望
干细胞在延缓DR的进程、减轻DR的症状方面具有潜在的治疗意义。目前，对于干细胞治疗DR的研究主要侧重于视网膜早期病变，即在增生期DR出现之前。一些类型的干细胞分泌特殊的生长因子，进而对糖尿病的视网膜产生神经保护作用；另外一些类型的干细胞，可以减少及修复毛细血管闭塞、减少周细胞的缺失，可以向周细胞及内皮细胞分化，从而对DR中受损的血管产生保护作用。ESC和iPSC同样可以产生具有再生能力的干细胞，加速向糖尿病中受损的视网膜细胞分化。但上述研究中的干细胞都是异体来源，若取自糖尿病本身骨髓、脂肪等组织来源的干细胞，由于这些细胞长期受糖尿病环境的影响，所处的微环境已经发生变化，在修复视网膜损伤时，功能较正常环境来源的干细胞明显削弱。目前一些研究倾向于诱导糖尿病来源的祖细胞恢复正常功能，为实现自体疗法提供可能。
干细胞疗法在DR血管和神经元损害中均具有再生和修复的潜能。接下来，对干细胞再生的分子机制进一步研究可为治疗DR等缺血性视网膜病变提供新的药理及遗传学方法，同时还可加强现有干细胞疗法的治疗效果。