引用本文： 梁泽玉, 陈松, 张惟, 何广辉, 王俊华, 高翔, 武斌. 人脐带间充质干细胞源性微囊泡对高糖诱导下大鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用及机制. 中华眼底病杂志, 2018, 34(6): 568-574. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2018.06.009 复制
高糖、缺氧、高渗透压等应激因素可通过激活视网膜神经节细胞（RGC）内活性氧/丝裂原活化蛋白激酶等相关信号通路，导致促凋亡因子Bax、Bad等与抗凋亡因子B淋巴细胞瘤（Bcl）-2基因、Bcl-x等比例失衡，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），从而引起细胞内线粒体损伤，启动级联放大式的细胞凋亡程序，产生不可逆性的RGC损伤 [1-3]。大量基础研究结果已证实，间充质干细胞（MSC）可通过旁分泌途径以细胞外囊泡（EV）的形式发挥对组织直接或间接的修复作用[4-9]。EV是从细胞主动分泌的外泌体或从细胞膜表面直接出芽脱落形成的胞膜微囊泡（MV）或凋亡小体，其中MV是细胞在正常或病理状态下从细胞膜表面出芽脱落形成的双层胞膜结构的囊泡样物质，直径100～1000 nm，在细胞间通讯、凋亡、炎症、修复等方面发挥作用[10]。现已有多项研究表明MSC-MV具有减轻组织损伤的作用[11-13]。为验证这一结论，我们观察探讨了人脐带MSC-MV（hUMSC-MV）对高糖诱导下大鼠RGC损伤的保护作用及机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及原代大鼠RGC分离培养、鉴定
出生1～3 d、体重6.5～9.0 g的Sprague-Dawley雄性大鼠32只购自天津医科大学动物中心。hUMSC由中国医学科学院血液学研究所惠赠。多聚L赖氨酸预包被细胞6孔培养板（德国Greiner Bio-one公司）；羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、Dulbecco改良Eagle（DMEM）/F12低糖培养基、胎牛血清、Neurobasal/B27神经元培养基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；Trizol RNA逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；苯基吲哚（DAPI）、PKH26试剂盒（美国Sigma公司）；小鼠抗大鼠Thy-1一抗（美国Chemicon公司）；羊抗鼠Brn-3a一抗、荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记兔抗鼠IgG二抗、Cy3标记兔抗羊IgG二抗（美国Santa Cruz公司）；FITC标记抗人CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、第二型人类白血球抗原（HLA-DR）、CD34、CD45抗体（美国eBioscience公司）；兔抗鼠B-细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3、裂解的Caspase-3一抗抗体，羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）二抗（英国Abcam公司）。聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美国Roche公司）；细胞计数CCK-8试剂盒、膜联蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡试剂盒（日本株式会社同仁化学研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（北京碧云天生物技术公司）。手术显微镜（德国Zeiss公司）；超速低温离心机、流式细胞仪（美国Beckman公司）。RNA引物由天津博奥科生物公司合成。其余试剂均购自天津博奥科生物公司。
参照文献[14]的方法分离培养原代大鼠RGC。完整分离视网膜神经上皮层置于含100 U/ml青霉素及链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，于37 ℃细胞培养箱内用0.125%胰蛋白酶消化15～20 min，加入适量含10%胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，轻微吹打，4 ℃ 200×g离心3 min，弃上清液后加入Neurobasal/B27神经元培养基（Neurobasal+B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺），吹打成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/ml后接种于多聚赖氨酸包被的6孔细胞培养板内，每孔细胞悬液2 ml，置于37 ℃、5%CO2温箱内培养24 h后更换新鲜Neurobasal/B27 培养基。倒置显微镜下观察细胞密度及细胞贴壁情况。
采用免疫荧光法鉴定原代大鼠RGC。预冷PBS浸泡细胞3 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS清洗3次，5 min/次，10%牛血清白蛋白室温下封闭20 min后加入小鼠抗大鼠Thy-1一抗，兔抗大鼠Brn-3a（1：500）4 ℃过夜，PBS再次清洗3次，5 min/次，避光下加入FITC标记的兔抗小鼠荧光二抗IgG、Cy3标记的羊抗兔荧光二抗IgG（1：100），室温孵育1 h。PBS避光摇动清洗3次，5 min/次。加入DAPI染液，室温孵育4 min，PBS洗涤3次，5 min/次。避光晾干封片后荧光显微镜下观察细胞情况。
1.2 hUMSC-MV提取、鉴定以及大鼠RGC与hUMSC-MV内化过程
参照文献[15]的超速离心法收集hUMSC-MV。复苏hUMSC后以细胞密度1×105个/ml接种于6孔细胞培养板，待细胞铺满孔底约80%后，0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化细胞后以1：2传代，收集2～7代状态良好的hUMSC上清液，4 ℃下400×g离心10 min，取上清液后再以2000×g离心20 min，取上清液转移至超速离心管中，4 ℃下20 000 ×g离心1 h后去上清液，加入DMEM/F12培养基（1：1）及25 mmol/L HEPES缓冲液后再次4 ℃ 20 000 ×g离心1 h，得到的白色沉淀即为hUMSC-MV。500 μl PBS重悬沉淀，部分hUMSC-MV经多聚甲醛固定，剩余hUMSC-MV转移至无菌离心管中进行后续实验或−80 ℃冰箱中保存备用。
流式细胞仪检测MV大小及表型。0.5 ml PBS重悬hUMSC-MV，加入FITC标记的CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、HLA-DR、CD34、CD45等表面分子。孔径2 nm的载样铜网固定于支架上，滴加20 μl hUMSC-MV悬液，室温静置3 min。滤纸从铜网侧边吸干液体，3%磷钨酸溶液30 μl室温环境下负染hUMSC-MV 5 min。滤纸吸干负染液，将铜网置于透射电子显微镜的样品室内，观察hUMSC-MV的形态并拍照。BCA试剂盒测量hUMSC-MV蛋白含量。
配置蛋白浓度为50 μg/ml的hUMSC-MV PBS重悬液1 ml，加入100 μg/ml的PKH26 4 μl，混匀后4 ℃孵育1 h，4 ℃ 10 000×g离心1 h后去上清液，加入1 ml PBS重悬。RGC弃上清液后加入1滴浓度为5 μg/ml DAPI室温着染15 min，PBS清洗3次后加入1 ml上述PKH26标记的hUMSC-MV，继续培养6 h，弃上清液，加入新鲜Neurobasal/B27神经元培养液。荧光显微镜下观察、拍照。
1.3 实验分组以及hUMSC-MV对高糖环境下大鼠RGC活性及凋亡的影响
实验分为正常RGC对照组（A组）、高糖对照组（B组）、正常共培养组（C组）、高糖共培养组（D组）进行。A组细胞正常培养，B组细胞为33 mmol/L葡萄糖培养，C组细胞为hUMSC-MV培养，D组细胞为33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培养。Neurobasal/B27神经元培养液内加入hUMSC-MV至终浓度50 μg/ml。观察时间点为RGC与hUMSC-MV共培养后48 h。实验重复3次，取其均值。
采用CCK-8试剂盒测定各组RGC活性。各组细胞弃上清液后每孔加入10 μl CCK-8试剂孵育4 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。细胞活性（%）=（A干预−A空白对照）/（A0干预−A空白对照）×100%，其中A0干预为具有RGC、CCK溶液而未加hUMSC-MV的A值。采用AnnexinⅤ/PI双染法测量各组RGC凋亡率。酶解细胞后低速离心弃上清液，PBS漂洗后200×g离心5 min，500 μl结合缓冲液重悬，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μl PI溶液，轻轻振荡混匀。室温避光反应15 min，1 h内上机检测细胞凋亡率。
1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测
采用RT-PCR检测各组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，Premier 5.0软件设计正向、反向引物（表1）。反应条件为95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重复40个循环。变性、退火、延伸重复45个循环。将得到的各组循环阈值（Ct值）数据与内参照GAPDH分析处理后，采用RQ= 2−△△Ct法计算各目的基因的相对表达量。
表1
Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH基因扩增和测序引物
采用Western blot检测各组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达。各组细胞弃上清液，加入预冷PBS清洗后，加入适量RIPA充分裂解细胞，BCA测量细胞内总蛋白。取40 μg样品100 ℃水浴加热3～5 min以充分变性蛋白。冷却至室温后加入15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜做好标记后于5%脱脂奶粉25 ml中室温封闭1 h，洗膜缓冲液（TBST）漂洗3次，10 min/次。分别加入兔抗鼠抗Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3抗体。混匀后4 ℃平摇过夜。再加入羊抗兔IgG-HRP二抗，混匀后4 ℃平摇1 h，TBST漂洗3次。取出PVDF膜后用增强化学发光A、B液反复吹洗5 min后置于曝光夹中用塑料薄膜封好，暗室中曝光30 s～5 min后显影并定影。以β-肌动蛋白作为内参照。胶片经激光光密度图像扫描仪扫描图像并用Quantity One分析软件进行图像分析，测得各个条带的灰度值。将目的条带的灰度值与对应内参的灰度值相比较，得出相对表达量，所得数据取平均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0软进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（
）表示，数据均行正态分布及方差齐性检验。符合正态分布及方差齐，各组计量资料统计分析采用单因素方差分析。组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
原代大鼠RGC于24～36 h可完全贴壁。倒置显微镜观察发现，RGC细胞核居中，胞体清晰，培养3～5 d后长出少许短小神经元突起，呈多角状（图1A）；6～7 d RGC神经突起间接触；7～8 d后RGC融合率达到70%。免疫荧光双染法结果显示，RGC细胞质内Thy-1表达阳性，细胞核内Brn-3a表达阳性（图1B）。
图1
原代大鼠RGC及hUMSC-MV鉴定像。1A.原代大鼠RGC倒置显微镜像，RGC胞体清晰，培养3～5 d后长出少许短小神经元多角状突起 ×200；1B.原代大鼠RGC免疫荧光鉴定像，RGC细胞质、短小突触及细胞核可见Thy-1及Brn-3a免疫荧光双染，细胞核DAPI蓝色染色阳性 Thy-1+Brn-3a双染 ×100；1C.hUMSC-MV透射电子显微镜像。hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构 磷钨酸 标尺：300 μm1C.hUMSC-MV透射电子显微镜像。hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构 磷钨酸 标尺：300 μm
透射电子显微镜观察发现，hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构，直径约100～1000 nm不等（图1B）。流式细胞仪检测结果显示，hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直径范围（图2）。
图2
hUMSC-MV流式细胞仪检测像。hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直径范围
流式细胞仪分析结果显示，hUMSC-MV表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45（图3）。BCA法测量结果显示，hUMSC-MV蛋白含量约为（80.12±0.44）μg。
图3
hUMSC-MV流式细胞仪分析像。hUMSC-MV表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45
荧光显微镜观察发现，hUMSC-MV与RGC共培养6 h后，RGC内细胞核呈蓝色荧光着染，细胞质内大量点状红色荧光，RGC可与hUMSC-MV良好内化（图4）。
图4
hUMSC-MV与RGC内化荧光显微镜像。4A.PKH26荧光标记hUMSC-MV；4B.RGC细胞核DAPI染色；4C.hUMSC-MV进入RGC内化 标尺：20 μm
A～D组细胞活性率分别为（92.33±2.51）%、（62.00±3.61）%、（90.33±0.58）%、（76.67±1.53）%，细胞凋亡率分别为（11.33±1.53）%、（44.67±1.53）%、（10.33±1.51）%、（23.00±1.00）%。4组细胞活性及凋亡率比较，差异均有统计学意义（F=107.92、382.11，P=0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B组细胞活性低于A、C、D组，B组细胞凋亡率高于A、C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
RT-PCR检测结果显示，4组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B、D组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达高于A、C组，差异有统计学意义；D组RGC内Bcl-2 mRNA表达高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组Bax、Caspase-3 mRNA表达高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。
图5
各组细胞凋亡相关基因mRNA表达比较
Western blot检测结果显示，4组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B、D组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达高于A、C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组RGC内Bcl-2蛋白表达高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组Bax、Caspase-3蛋白表达高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
各组细胞凋亡相关蛋白表达比较
3 讨论
MV是以细胞出芽方式分泌，由磷脂转运酶、反转酶等酶类参与，释放过程包括细胞膜内层磷脂酰丝氨酸非对称分布及细胞骨架的再分配[16-18]。Kanada等[19]发现，MV转运细胞内生信物质更为高效，其通过内化形式可完整进入靶细胞内，防止母细胞内核酸、蛋白质等生信物质在非正常亚细胞定位的降解。因此，本研究选用了具有体积较大、相对较低超离速度及时间、较为完整的细胞外囊膜完整性、更为有效的生信物质转运率的MV为研究对象，观察hUMSC-MV对高糖诱导下大鼠RGC损伤的保护作用并初步探讨其机制。
我们采用超速离心法成功提取hUMSC-MV，透射电子显微镜下观察到hUMSC-MV为单个或聚集成簇的完整圆形膜性囊泡样结构，直径约100～1000 nm不等。通过流式细胞仪分析发现，hUMSC-MV在直径102～103 nm范围内呈柱样聚集；其表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45，与文献报道结果一致[20-22]。hUMSC-MV与大鼠RGC共培养后RGC内可见大量点状红色荧光，证明hUMSC-MV可与大鼠RGC良好内化。CCK-8细胞活性检测及AnnexinⅤ/PI双染法细胞凋亡检测结果表明，高糖环境可降低大鼠RGC的细胞活性，诱导细胞凋亡，高糖刺激RGC内凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达。hUMSC-MV与大鼠RGC共培养后可增加大鼠RGC活性，降低细胞凋亡率；RGC内Bcl-2表达增加，Bax、Caspase-3表达降低，并降低Caspase-3的裂解活化。据此我们认为，高糖环境作为对RGC的损伤因素，通过诱导细胞内凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达导致RGC活性下降或凋亡；hUMSC-MV可通过与RGC内化的作用形式干预细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达及Caspase-3活化，从而发挥对RGC细胞损伤的保护。目前关于干细胞源性MV在神经损伤方面的作用多集中于中枢神经系统。Baulch等[23]发现，通过脊髓移植神经干细胞源性MV可改善大鼠接受放射治疗后行为认知功能的损伤。脂肪MSC源性MV在低浓度范围内可发挥对神经细胞的保护作用，高浓度范围对神经细胞的保护作用减弱[13]。上述研究结果与本研究结果类似，提示干细胞源性MV均有修复神经细胞损伤的作用。
本研究立足于hUMSC研究现状，以hUMSC-MV为介质为视网膜神经组织损伤的治疗提供一定的理论依据。但本研究缺陷在于为体外实验，仅观察单一浓度、单一时间点的hUMSC-MV对RGC的作用，并未进一步分析hUMSC-MV内的具体生物信息物质对RGC内凋亡相关信号通路的影响。在今后进一步研究中，拟进行hUMSC-MV不同浓度梯度对糖尿病视网膜病变动物模型的作用，着重于探讨hUMSC-MV对视网膜神经组织保护作用的作用靶点及信号通路。
高糖、缺氧、高渗透压等应激因素可通过激活视网膜神经节细胞（RGC）内活性氧/丝裂原活化蛋白激酶等相关信号通路，导致促凋亡因子Bax、Bad等与抗凋亡因子B淋巴细胞瘤（Bcl）-2基因、Bcl-x等比例失衡，活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspases），从而引起细胞内线粒体损伤，启动级联放大式的细胞凋亡程序，产生不可逆性的RGC损伤 [1-3]。大量基础研究结果已证实，间充质干细胞（MSC）可通过旁分泌途径以细胞外囊泡（EV）的形式发挥对组织直接或间接的修复作用[4-9]。EV是从细胞主动分泌的外泌体或从细胞膜表面直接出芽脱落形成的胞膜微囊泡（MV）或凋亡小体，其中MV是细胞在正常或病理状态下从细胞膜表面出芽脱落形成的双层胞膜结构的囊泡样物质，直径100～1000 nm，在细胞间通讯、凋亡、炎症、修复等方面发挥作用[10]。现已有多项研究表明MSC-MV具有减轻组织损伤的作用[11-13]。为验证这一结论，我们观察探讨了人脐带MSC-MV（hUMSC-MV）对高糖诱导下大鼠RGC损伤的保护作用及机制。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及原代大鼠RGC分离培养、鉴定
出生1～3 d、体重6.5～9.0 g的Sprague-Dawley雄性大鼠32只购自天津医科大学动物中心。hUMSC由中国医学科学院血液学研究所惠赠。多聚L赖氨酸预包被细胞6孔培养板（德国Greiner Bio-one公司）；羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、Dulbecco改良Eagle（DMEM）/F12低糖培养基、胎牛血清、Neurobasal/B27神经元培养基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；Trizol RNA逆转录试剂盒（美国Invitrogen公司）；苯基吲哚（DAPI）、PKH26试剂盒（美国Sigma公司）；小鼠抗大鼠Thy-1一抗（美国Chemicon公司）；羊抗鼠Brn-3a一抗、荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记兔抗鼠IgG二抗、Cy3标记兔抗羊IgG二抗（美国Santa Cruz公司）；FITC标记抗人CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、第二型人类白血球抗原（HLA-DR）、CD34、CD45抗体（美国eBioscience公司）；兔抗鼠B-细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bax、半胱天冬蛋白酶（Caspase）-3、裂解的Caspase-3一抗抗体，羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶（HRP）二抗（英国Abcam公司）。聚偏氟乙烯（PVDF）膜（美国Roche公司）；细胞计数CCK-8试剂盒、膜联蛋白（Annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡试剂盒（日本株式会社同仁化学研究所）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量试剂盒（北京碧云天生物技术公司）。手术显微镜（德国Zeiss公司）；超速低温离心机、流式细胞仪（美国Beckman公司）。RNA引物由天津博奥科生物公司合成。其余试剂均购自天津博奥科生物公司。
参照文献[14]的方法分离培养原代大鼠RGC。完整分离视网膜神经上皮层置于含100 U/ml青霉素及链霉素的磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，于37 ℃细胞培养箱内用0.125%胰蛋白酶消化15～20 min，加入适量含10%胎牛血清DMEM/F12培养基终止消化，轻微吹打，4 ℃ 200×g离心3 min，弃上清液后加入Neurobasal/B27神经元培养基（Neurobasal+B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺），吹打成细胞悬液，调整细胞密度为5×105个/ml后接种于多聚赖氨酸包被的6孔细胞培养板内，每孔细胞悬液2 ml，置于37 ℃、5%CO2温箱内培养24 h后更换新鲜Neurobasal/B27 培养基。倒置显微镜下观察细胞密度及细胞贴壁情况。
采用免疫荧光法鉴定原代大鼠RGC。预冷PBS浸泡细胞3 min，4%多聚甲醛冰上固定20 min，PBS清洗3次，5 min/次，10%牛血清白蛋白室温下封闭20 min后加入小鼠抗大鼠Thy-1一抗，兔抗大鼠Brn-3a（1：500）4 ℃过夜，PBS再次清洗3次，5 min/次，避光下加入FITC标记的兔抗小鼠荧光二抗IgG、Cy3标记的羊抗兔荧光二抗IgG（1：100），室温孵育1 h。PBS避光摇动清洗3次，5 min/次。加入DAPI染液，室温孵育4 min，PBS洗涤3次，5 min/次。避光晾干封片后荧光显微镜下观察细胞情况。
1.2 hUMSC-MV提取、鉴定以及大鼠RGC与hUMSC-MV内化过程
参照文献[15]的超速离心法收集hUMSC-MV。复苏hUMSC后以细胞密度1×105个/ml接种于6孔细胞培养板，待细胞铺满孔底约80%后，0.25%胰蛋白酶+0.02%乙二胺四乙酸消化细胞后以1：2传代，收集2～7代状态良好的hUMSC上清液，4 ℃下400×g离心10 min，取上清液后再以2000×g离心20 min，取上清液转移至超速离心管中，4 ℃下20 000 ×g离心1 h后去上清液，加入DMEM/F12培养基（1：1）及25 mmol/L HEPES缓冲液后再次4 ℃ 20 000 ×g离心1 h，得到的白色沉淀即为hUMSC-MV。500 μl PBS重悬沉淀，部分hUMSC-MV经多聚甲醛固定，剩余hUMSC-MV转移至无菌离心管中进行后续实验或−80 ℃冰箱中保存备用。
流式细胞仪检测MV大小及表型。0.5 ml PBS重悬hUMSC-MV，加入FITC标记的CD44、CD29、CD73、CD105、CD49f、HLA-DR、CD34、CD45等表面分子。孔径2 nm的载样铜网固定于支架上，滴加20 μl hUMSC-MV悬液，室温静置3 min。滤纸从铜网侧边吸干液体，3%磷钨酸溶液30 μl室温环境下负染hUMSC-MV 5 min。滤纸吸干负染液，将铜网置于透射电子显微镜的样品室内，观察hUMSC-MV的形态并拍照。BCA试剂盒测量hUMSC-MV蛋白含量。
配置蛋白浓度为50 μg/ml的hUMSC-MV PBS重悬液1 ml，加入100 μg/ml的PKH26 4 μl，混匀后4 ℃孵育1 h，4 ℃ 10 000×g离心1 h后去上清液，加入1 ml PBS重悬。RGC弃上清液后加入1滴浓度为5 μg/ml DAPI室温着染15 min，PBS清洗3次后加入1 ml上述PKH26标记的hUMSC-MV，继续培养6 h，弃上清液，加入新鲜Neurobasal/B27神经元培养液。荧光显微镜下观察、拍照。
1.3 实验分组以及hUMSC-MV对高糖环境下大鼠RGC活性及凋亡的影响
实验分为正常RGC对照组（A组）、高糖对照组（B组）、正常共培养组（C组）、高糖共培养组（D组）进行。A组细胞正常培养，B组细胞为33 mmol/L葡萄糖培养，C组细胞为hUMSC-MV培养，D组细胞为33 mmol/L葡萄糖、hUMSC-MV共培养。Neurobasal/B27神经元培养液内加入hUMSC-MV至终浓度50 μg/ml。观察时间点为RGC与hUMSC-MV共培养后48 h。实验重复3次，取其均值。
采用CCK-8试剂盒测定各组RGC活性。各组细胞弃上清液后每孔加入10 μl CCK-8试剂孵育4 h，酶标仪测定450 nm处的吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。细胞活性（%）=（A干预−A空白对照）/（A0干预−A空白对照）×100%，其中A0干预为具有RGC、CCK溶液而未加hUMSC-MV的A值。采用AnnexinⅤ/PI双染法测量各组RGC凋亡率。酶解细胞后低速离心弃上清液，PBS漂洗后200×g离心5 min，500 μl结合缓冲液重悬，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC溶液和5 μl PI溶液，轻轻振荡混匀。室温避光反应15 min，1 h内上机检测细胞凋亡率。
1.4 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白免疫印迹法（Western blot）检测
采用RT-PCR检测各组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达。以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照，按照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA，Premier 5.0软件设计正向、反向引物（表1）。反应条件为95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，重复40个循环。变性、退火、延伸重复45个循环。将得到的各组循环阈值（Ct值）数据与内参照GAPDH分析处理后，采用RQ= 2−△△Ct法计算各目的基因的相对表达量。
表1
Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH基因扩增和测序引物
采用Western blot检测各组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达。各组细胞弃上清液，加入预冷PBS清洗后，加入适量RIPA充分裂解细胞，BCA测量细胞内总蛋白。取40 μg样品100 ℃水浴加热3～5 min以充分变性蛋白。冷却至室温后加入15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上。PVDF膜做好标记后于5%脱脂奶粉25 ml中室温封闭1 h，洗膜缓冲液（TBST）漂洗3次，10 min/次。分别加入兔抗鼠抗Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3抗体。混匀后4 ℃平摇过夜。再加入羊抗兔IgG-HRP二抗，混匀后4 ℃平摇1 h，TBST漂洗3次。取出PVDF膜后用增强化学发光A、B液反复吹洗5 min后置于曝光夹中用塑料薄膜封好，暗室中曝光30 s～5 min后显影并定影。以β-肌动蛋白作为内参照。胶片经激光光密度图像扫描仪扫描图像并用Quantity One分析软件进行图像分析，测得各个条带的灰度值。将目的条带的灰度值与对应内参的灰度值相比较，得出相对表达量，所得数据取平均值。
1.5 统计学方法
采用SPSS 22.0软进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（
）表示，数据均行正态分布及方差齐性检验。符合正态分布及方差齐，各组计量资料统计分析采用单因素方差分析。组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
原代大鼠RGC于24～36 h可完全贴壁。倒置显微镜观察发现，RGC细胞核居中，胞体清晰，培养3～5 d后长出少许短小神经元突起，呈多角状（图1A）；6～7 d RGC神经突起间接触；7～8 d后RGC融合率达到70%。免疫荧光双染法结果显示，RGC细胞质内Thy-1表达阳性，细胞核内Brn-3a表达阳性（图1B）。
图1
原代大鼠RGC及hUMSC-MV鉴定像。1A.原代大鼠RGC倒置显微镜像，RGC胞体清晰，培养3～5 d后长出少许短小神经元多角状突起 ×200；1B.原代大鼠RGC免疫荧光鉴定像，RGC细胞质、短小突触及细胞核可见Thy-1及Brn-3a免疫荧光双染，细胞核DAPI蓝色染色阳性 Thy-1+Brn-3a双染 ×100；1C.hUMSC-MV透射电子显微镜像。hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构 磷钨酸 标尺：300 μm1C.hUMSC-MV透射电子显微镜像。hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构 磷钨酸 标尺：300 μm
透射电子显微镜观察发现，hUMSC-MV为单个或少许成簇的圆形膜性囊泡样结构，直径约100～1000 nm不等（图1B）。流式细胞仪检测结果显示，hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直径范围（图2）。
图2
hUMSC-MV流式细胞仪检测像。hUMSC-MV多聚集在102～103 nm直径范围
流式细胞仪分析结果显示，hUMSC-MV表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45（图3）。BCA法测量结果显示，hUMSC-MV蛋白含量约为（80.12±0.44）μg。
图3
hUMSC-MV流式细胞仪分析像。hUMSC-MV表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105、CD90，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45
荧光显微镜观察发现，hUMSC-MV与RGC共培养6 h后，RGC内细胞核呈蓝色荧光着染，细胞质内大量点状红色荧光，RGC可与hUMSC-MV良好内化（图4）。
图4
hUMSC-MV与RGC内化荧光显微镜像。4A.PKH26荧光标记hUMSC-MV；4B.RGC细胞核DAPI染色；4C.hUMSC-MV进入RGC内化 标尺：20 μm
A～D组细胞活性率分别为（92.33±2.51）%、（62.00±3.61）%、（90.33±0.58）%、（76.67±1.53）%，细胞凋亡率分别为（11.33±1.53）%、（44.67±1.53）%、（10.33±1.51）%、（23.00±1.00）%。4组细胞活性及凋亡率比较，差异均有统计学意义（F=107.92、382.11，P=0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B组细胞活性低于A、C、D组，B组细胞凋亡率高于A、C、D组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
RT-PCR检测结果显示，4组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达比较，差异有统计学意义（F=219.79、339.198、1 071.21，P=0.000、0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B、D组RGC内Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达高于A、C组，差异有统计学意义；D组RGC内Bcl-2 mRNA表达高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组Bax、Caspase-3 mRNA表达高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。
图5
各组细胞凋亡相关基因mRNA表达比较
Western blot检测结果显示，4组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达比较，差异有统计学意义（F=544.28、295.79、533.18、224.75，P=0.000、0.000、0.000、0.000）。组间两两比较结果显示，B、D组RGC内Bcl-2、Bax、裂解的Caspase-3、Caspase-3蛋白表达高于A、C组，差异有统计学意义（P＜0.05）；D组RGC内Bcl-2蛋白表达高于B组，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组Bax、Caspase-3蛋白表达高于D组，差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。
图6
各组细胞凋亡相关蛋白表达比较
3 讨论
MV是以细胞出芽方式分泌，由磷脂转运酶、反转酶等酶类参与，释放过程包括细胞膜内层磷脂酰丝氨酸非对称分布及细胞骨架的再分配[16-18]。Kanada等[19]发现，MV转运细胞内生信物质更为高效，其通过内化形式可完整进入靶细胞内，防止母细胞内核酸、蛋白质等生信物质在非正常亚细胞定位的降解。因此，本研究选用了具有体积较大、相对较低超离速度及时间、较为完整的细胞外囊膜完整性、更为有效的生信物质转运率的MV为研究对象，观察hUMSC-MV对高糖诱导下大鼠RGC损伤的保护作用并初步探讨其机制。
我们采用超速离心法成功提取hUMSC-MV，透射电子显微镜下观察到hUMSC-MV为单个或聚集成簇的完整圆形膜性囊泡样结构，直径约100～1000 nm不等。通过流式细胞仪分析发现，hUMSC-MV在直径102～103 nm范围内呈柱样聚集；其表面高表达CD44、CD29、CD73、CD105，阴性表达CD49f、HLA-DR、CD34、CD45，与文献报道结果一致[20-22]。hUMSC-MV与大鼠RGC共培养后RGC内可见大量点状红色荧光，证明hUMSC-MV可与大鼠RGC良好内化。CCK-8细胞活性检测及AnnexinⅤ/PI双染法细胞凋亡检测结果表明，高糖环境可降低大鼠RGC的细胞活性，诱导细胞凋亡，高糖刺激RGC内凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白表达。hUMSC-MV与大鼠RGC共培养后可增加大鼠RGC活性，降低细胞凋亡率；RGC内Bcl-2表达增加，Bax、Caspase-3表达降低，并降低Caspase-3的裂解活化。据此我们认为，高糖环境作为对RGC的损伤因素，通过诱导细胞内凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达导致RGC活性下降或凋亡；hUMSC-MV可通过与RGC内化的作用形式干预细胞内凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的表达及Caspase-3活化，从而发挥对RGC细胞损伤的保护。目前关于干细胞源性MV在神经损伤方面的作用多集中于中枢神经系统。Baulch等[23]发现，通过脊髓移植神经干细胞源性MV可改善大鼠接受放射治疗后行为认知功能的损伤。脂肪MSC源性MV在低浓度范围内可发挥对神经细胞的保护作用，高浓度范围对神经细胞的保护作用减弱[13]。上述研究结果与本研究结果类似，提示干细胞源性MV均有修复神经细胞损伤的作用。
本研究立足于hUMSC研究现状，以hUMSC-MV为介质为视网膜神经组织损伤的治疗提供一定的理论依据。但本研究缺陷在于为体外实验，仅观察单一浓度、单一时间点的hUMSC-MV对RGC的作用，并未进一步分析hUMSC-MV内的具体生物信息物质对RGC内凋亡相关信号通路的影响。在今后进一步研究中，拟进行hUMSC-MV不同浓度梯度对糖尿病视网膜病变动物模型的作用，着重于探讨hUMSC-MV对视网膜神经组织保护作用的作用靶点及信号通路。
