神经干细胞（NSC）是一类能向神经细胞和胶质细胞分化的特殊干细胞。Müller细胞作为视网膜主要内源性NSC，具有在视网膜损伤后进入细胞周期增生并分化为神经细胞的能力。在脊椎动物中，视网膜Müller细胞的内源性NSC自发再生有着很高的效率，而哺乳动物这一能力几乎完全消失。深入研究发现，Ascl1、Sox2、Lin28、Atoh7等部分转录因子具有促进Müller细胞增生并分化为神经细胞的功能。而Ascl1联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂更能使小鼠Müller细胞分化的神经细胞整合进入已有的视网膜并能对光做出反应，从而可能挽救视力。但与斑马鱼相比，哺乳动物Müller细胞增生再生能力依然十分有限。寻找更多能增强Müller细胞分化能力的新因子将成为亟待解决的重要问题。
引用本文： 柯屹峰, 张珑俐, 李筱荣. 视网膜Müller细胞的内源性神经干细胞特性研究进展. 中华眼底病杂志, 2019, 35(5): 522-525. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2019.05.023 复制
视网膜再生研究的干细胞类型主要包括内源性神经干细胞（NSC）如Müller细胞，以及来自睫状体边缘区的视网膜干细胞。外源性干细胞则包括骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞和诱导多功能干细胞等[1]。干细胞的长时间自我更新和多向分化能力是实现神经细胞再生的关键。干细胞疗法提供了一种全新的神经再生方法，在人视网膜疾病中，应用干细胞分化的外源性神经细胞来替代受损的神经细胞，从而挽救视功能。但是这种替代治疗是一个复杂的过程，需要再生细胞整合进入原有视网膜与视神经网络并与其产生正确的突触连接。此外，外源性细胞移植还可能会激活宿主的免疫反应，从而排斥移植细胞。一个折中的方案是使用自体干细胞移植，但过程仍然十分复杂，必须在干细胞移植后精确控制细胞生长。近期有文献报道，3例老年性黄斑变性患者在接受自体脂肪干细胞移植1年后视力丧失[2]。因此，动员内源性NSC重新进入增生周期并向神经细胞再生是一种更有前途的方法。NSC是一类能向神经细胞和胶质细胞分化的特殊干细胞[3]。在内源性NSC中，Müller细胞是视网膜主要的NSC，分布于从视网膜内界膜到视网膜下腔的视网膜全层，非常适合作为视网膜再生的储备细胞。Müller细胞具有在视网膜损伤后进入细胞周期增生并分化为神经细胞的能力，这一功能在既往动物实验研究中多有报道。现就Müller细胞内源性NSC特性研究进展作一综述。
1 Müller细胞在斑马鱼视网膜再生中的重编程过程
部分非哺乳动物如鱼、鸡、蛙类中，视网膜损伤后自发再生有很高的效率[4-6]。而其中最具有代表性的是斑马鱼。斑马鱼视网膜严重损伤60 d后，视网膜内核层、外核层、神经节细胞层结构能完全恢复，同时光感受器细胞也逐渐恢复正常形态[4]。斑马鱼视网膜NSC主要是Müller细胞，是一种放射状胶质细胞并能表达胶质纤维酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶。可重新进入细胞增生周期再分化为神经前体细胞，并能向视网膜所有神经细胞再生，最终挽救视功能[7]。在一项中枢神经系统前体细胞的研究中，观察到放射状胶质细胞是大脑和视网膜的内源性NSC，NSC为避免过早被损耗通常处于相对静止状态。因此，内源性NSC在进行神经细胞再生时，先从静止状态进入细胞增生周期再进行分化[8]。在斑马鱼中，少数细胞因子被证实能控制Müller细胞增生和分化。在视网膜受伤后NSC重编程过程中，具有螺旋结构的转录因子Ascl1a和RNA结合蛋白Lin28被认为在激活视网膜再生相关信号通路中（包括Wnt和Notch信号通路）起到关键作用。早期研究显示，斑马鱼视网膜损伤6 h后Ascl1a表达上调，并且在损伤36 h内持续升高，最长时间可达7 d之后[9-11]。而Ascl1a基因表达下调则抑制视网膜损伤后的增生和再生能力[9]。Lin28是一种在胚胎干细胞和肿瘤细胞中表达的RNA结合蛋白，在斑马鱼的视网膜损伤后Ascl1a能直接结合到Lin28基因的启动子上，并且Lin28启动子的活性随着Ascl1a表达浓度的升高而增强。而Lin28能抑制let-7 miRNA（一种能调节细胞分化的miRNA）的形成并促进它的降解，从而促进Müller细胞的逆分化[12]。但Ascl1a和Lin28的体内调节机制仍然需要进一步研究。Lin28基因下调不能影响Ascl1a转录水平[12]，但在光感受器细胞再生时Lin28基因下调可以阻止Ascl1a蛋白生成[13]，表明可能还有其他细胞因子参与了视网膜再生活动。最近，两种新地转录因子Sox2和Atoh7被发现在受损视网膜的Müller细胞中重新表达。在光损伤1个月后的斑马鱼视网膜中，Sox2在Müller细胞中高表达并刺激Müller细胞增生，而Sox2基因敲除后Müller细胞增生能力大幅下降[14]。在受损伤的青鳉鱼视网膜，Atoh7在增生期Müller细胞和神经前体细胞中表达，并通过激活Notch信号通路促使Müller细胞有丝分裂效率提高[15]。此外，Sox2和Atoh7还能使静止状态的Müller细胞重新进入细胞周期并分化为神经细胞。值得注意的是，Sox2能诱导Ascl1a和Atoh7表达，且Ascl1a先于Atoh7表达并最后激活Lin28转录。然而Atoh基因表达是在Ascl1a下游还是两者沿两条平行通路分别表达来调控Lin28仍然未知。明确Sox2- Ascl1a/Atoh7- Lin28信号转录级联反应是控制斑马鱼视网膜损伤后NSC重编程和神经细胞再生的关键。
2 哺乳动物Müller再生能力受到限制
Müller细胞在所有脊椎动物视网膜损伤再生中都扮演重要角色，而哺乳动物Müller细胞再生能力几乎消失。哺乳动物视网膜严重损伤主要引发胶质细胞反应性增生，并引起细胞反应性肥大，Müller细胞转分化为成纤维细胞并最终在视网膜下形成胶质瘢痕[7]。Müller细胞这种胶质增生反应既有神经保护的有利作用，同时也有细胞损伤的有害作用。神经保护作用主要阻止组织损伤和神经细胞死亡，包括平衡钾离子、摄取谷氨酸、释放抗氧化剂、一氧化氮（NO）、神经营养因子。而有害作用则增加神经细胞死亡所导致的胶质瘢痕形成，包括释放炎症因子TNF，过度生产NO等。重点是相同的胶质增生反应依据持续时间和反应幅度能同时产生有益和有害的效果。慢性过度刺激或胶质增生的异常调节通常会引起有害反应[16]。而鱼视网膜损伤后Müller细胞能表达胶质增生相关蛋白，但不会形成胶质瘢痕。其原因是因为鱼视网膜损伤后胶质细胞增生被精确调控，保留上皮特性且不进行上皮-间质转化。虽然斑马鱼Müller细胞具有多潜能干细胞特性，但同时也是视杆细胞前体细胞，因而能同时表达静止体细胞相关蛋白和干细胞不对称有丝分裂标记蛋白。因此，鱼Müller细胞可以通过对体内稳态信号的反应不对称分裂，产生视杆细胞的前体细胞或多潜能神经前体细胞。迄今为止，哺乳动物视网膜再生研究主要集中于损伤后Müller细胞的改变。但多数研究显示，损伤后Müller细胞在基因表达和信号通路改变（如Stat3、肝素结合性表皮生长因子、TNF-α）所导致的胶质细胞增生较神经细胞再生更多。从中可以看出神经源性转录因子和神经细胞再生必需的因子如Acsl1a、Pax6、Six3、NeuroD，必须能驱使Müller细胞来源的视网膜前体细胞而不是Müller细胞本身发生增生分化[7]。尽管如此，哺乳动物Müller细胞在体外实验中也发现具有潜在光感受器细胞前体细胞和双极神经细胞特征[17-18]，从而揭示其也具有NSC细胞特性。进一步研究表明，在受损伤的小鼠视网膜，外源性神经前转录因子Ascl1的高表达具有提高Müller细胞增生并再生无长突神经细胞、双级神经细胞和光感受器细胞的能力[19]。但是Müller细胞这种增生能力仅限制在幼鼠，因为外源基因进入染色体的能力在成年小鼠中受到广泛限制。然而最新研究表明，视网膜Müller细胞中Ascl1的过表达联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂能绕开这些限制，促进成年小鼠视网膜损伤后新的神经细胞再生[20]。这些再生的神经细胞能整合进入已有的神经网络并能对光做出反应，从而挽救视力。虽然这一结果极有前途，但哺乳动物与斑马鱼相比，其Müller细胞增生再生能力十分有限。总之，寻找除Ascl1外能增强哺乳动物视网膜Müller细胞有丝分裂能力的新因子以再生完整的视网膜是今后视网膜再生非常有前景的研究方向。
3 MicroRNA（miR）与Müller细胞再生
有研究表明，miR-9在斑马鱼Müller细胞中的表达能调控视网膜NSC增生和分化，miR-9的耗损能提高斑马鱼视网膜神经前体细胞和神经细胞的数量；进一步研究发现，miR-9下游目的基因TLX和ONECUT mRNAs的过表达能提高斑马鱼NSC向神经细胞分化的能力[21]。有趣的是，能提高视网膜NSC增生能力的Lin28是miR-9的靶目标[22]。miR-9的表达能抑制视网膜前体细胞生成，表明miR-9作为Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信号通路的负调节单元阻止了Müller细胞增生，而miR-9下游的目的基因能促进NSC增生和分化。在哺乳动物中，miRlet-7、miR-9是小鼠视网膜前体细胞向晚期发育成熟的关键调节因子，并能促使整个视网膜发育加快。而这些miR的靶基因Protogenin和Lin28表达升高能抑制视网膜前体细胞的进一步发育[22]。证实miRlet-7、miR-9作为Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信号通路的负调节单元同样能阻止小鼠Müller细胞增生。在转染的HEK293细胞中，miRlet-7能抑制再生相关基因Ascl1a、Hspd1、Lin-28、Pax6b和Oct4的表达[12]，在小鼠NSC中，miRlet-7b（let-7 microRNA家族成员）能通过作用于干细胞调节因子TLX和细胞周期调节因子CyclinD而抑制NSC的增生[23]。总之，这一发现支持了miR-9/ miRlet-7-TLX-ONECUT通路作为内源性Müller细胞重编程分化为有功能的视网膜神经细胞所发挥的重要作用。
4 未来展望
现阶段研究主要的限制还在于NSC分化效率的不高。寻找新的能提高NSC分化效率的因子成为重中之重，如Ascl1对小鼠Müller细胞重编程过程只诱导了中等程度的双极细胞再生[20]。表明其他控制Müller细胞增生和分化的因子很可能没有受Ascl1的调节。然而已有研究确认，Müller细胞在斑马鱼视网膜损伤后少数细胞因子能提高Müller细胞的再生能力[24]。由于哺乳动物Müller细胞再生和分化能力的有限，需要找出哪种因子能高效促进Müller细胞在斑马鱼视网膜中的再生并将其移植到人视网膜再生过程中。最后怎样将位于上游或平行于Ascl1的不同转录因子联合起来并促进神经细胞增生和分化将成为一个重要的待解决问题。未来几年，随着高通量检测技术的广泛应用，促进Müller细胞再生和分化的候选基因将被筛选出，如果能找到这样的基因，并整合各个转录因子，将极大提高Müller细胞分化为神经细胞的能力，为视网膜再生的临床应用带来切实可行的希望。
视网膜再生研究的干细胞类型主要包括内源性神经干细胞（NSC）如Müller细胞，以及来自睫状体边缘区的视网膜干细胞。外源性干细胞则包括骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞和诱导多功能干细胞等[1]。干细胞的长时间自我更新和多向分化能力是实现神经细胞再生的关键。干细胞疗法提供了一种全新的神经再生方法，在人视网膜疾病中，应用干细胞分化的外源性神经细胞来替代受损的神经细胞，从而挽救视功能。但是这种替代治疗是一个复杂的过程，需要再生细胞整合进入原有视网膜与视神经网络并与其产生正确的突触连接。此外，外源性细胞移植还可能会激活宿主的免疫反应，从而排斥移植细胞。一个折中的方案是使用自体干细胞移植，但过程仍然十分复杂，必须在干细胞移植后精确控制细胞生长。近期有文献报道，3例老年性黄斑变性患者在接受自体脂肪干细胞移植1年后视力丧失[2]。因此，动员内源性NSC重新进入增生周期并向神经细胞再生是一种更有前途的方法。NSC是一类能向神经细胞和胶质细胞分化的特殊干细胞[3]。在内源性NSC中，Müller细胞是视网膜主要的NSC，分布于从视网膜内界膜到视网膜下腔的视网膜全层，非常适合作为视网膜再生的储备细胞。Müller细胞具有在视网膜损伤后进入细胞周期增生并分化为神经细胞的能力，这一功能在既往动物实验研究中多有报道。现就Müller细胞内源性NSC特性研究进展作一综述。
1 Müller细胞在斑马鱼视网膜再生中的重编程过程
部分非哺乳动物如鱼、鸡、蛙类中，视网膜损伤后自发再生有很高的效率[4-6]。而其中最具有代表性的是斑马鱼。斑马鱼视网膜严重损伤60 d后，视网膜内核层、外核层、神经节细胞层结构能完全恢复，同时光感受器细胞也逐渐恢复正常形态[4]。斑马鱼视网膜NSC主要是Müller细胞，是一种放射状胶质细胞并能表达胶质纤维酸性蛋白和谷氨酰胺合成酶。可重新进入细胞增生周期再分化为神经前体细胞，并能向视网膜所有神经细胞再生，最终挽救视功能[7]。在一项中枢神经系统前体细胞的研究中，观察到放射状胶质细胞是大脑和视网膜的内源性NSC，NSC为避免过早被损耗通常处于相对静止状态。因此，内源性NSC在进行神经细胞再生时，先从静止状态进入细胞增生周期再进行分化[8]。在斑马鱼中，少数细胞因子被证实能控制Müller细胞增生和分化。在视网膜受伤后NSC重编程过程中，具有螺旋结构的转录因子Ascl1a和RNA结合蛋白Lin28被认为在激活视网膜再生相关信号通路中（包括Wnt和Notch信号通路）起到关键作用。早期研究显示，斑马鱼视网膜损伤6 h后Ascl1a表达上调，并且在损伤36 h内持续升高，最长时间可达7 d之后[9-11]。而Ascl1a基因表达下调则抑制视网膜损伤后的增生和再生能力[9]。Lin28是一种在胚胎干细胞和肿瘤细胞中表达的RNA结合蛋白，在斑马鱼的视网膜损伤后Ascl1a能直接结合到Lin28基因的启动子上，并且Lin28启动子的活性随着Ascl1a表达浓度的升高而增强。而Lin28能抑制let-7 miRNA（一种能调节细胞分化的miRNA）的形成并促进它的降解，从而促进Müller细胞的逆分化[12]。但Ascl1a和Lin28的体内调节机制仍然需要进一步研究。Lin28基因下调不能影响Ascl1a转录水平[12]，但在光感受器细胞再生时Lin28基因下调可以阻止Ascl1a蛋白生成[13]，表明可能还有其他细胞因子参与了视网膜再生活动。最近，两种新地转录因子Sox2和Atoh7被发现在受损视网膜的Müller细胞中重新表达。在光损伤1个月后的斑马鱼视网膜中，Sox2在Müller细胞中高表达并刺激Müller细胞增生，而Sox2基因敲除后Müller细胞增生能力大幅下降[14]。在受损伤的青鳉鱼视网膜，Atoh7在增生期Müller细胞和神经前体细胞中表达，并通过激活Notch信号通路促使Müller细胞有丝分裂效率提高[15]。此外，Sox2和Atoh7还能使静止状态的Müller细胞重新进入细胞周期并分化为神经细胞。值得注意的是，Sox2能诱导Ascl1a和Atoh7表达，且Ascl1a先于Atoh7表达并最后激活Lin28转录。然而Atoh基因表达是在Ascl1a下游还是两者沿两条平行通路分别表达来调控Lin28仍然未知。明确Sox2- Ascl1a/Atoh7- Lin28信号转录级联反应是控制斑马鱼视网膜损伤后NSC重编程和神经细胞再生的关键。
2 哺乳动物Müller再生能力受到限制
Müller细胞在所有脊椎动物视网膜损伤再生中都扮演重要角色，而哺乳动物Müller细胞再生能力几乎消失。哺乳动物视网膜严重损伤主要引发胶质细胞反应性增生，并引起细胞反应性肥大，Müller细胞转分化为成纤维细胞并最终在视网膜下形成胶质瘢痕[7]。Müller细胞这种胶质增生反应既有神经保护的有利作用，同时也有细胞损伤的有害作用。神经保护作用主要阻止组织损伤和神经细胞死亡，包括平衡钾离子、摄取谷氨酸、释放抗氧化剂、一氧化氮（NO）、神经营养因子。而有害作用则增加神经细胞死亡所导致的胶质瘢痕形成，包括释放炎症因子TNF，过度生产NO等。重点是相同的胶质增生反应依据持续时间和反应幅度能同时产生有益和有害的效果。慢性过度刺激或胶质增生的异常调节通常会引起有害反应[16]。而鱼视网膜损伤后Müller细胞能表达胶质增生相关蛋白，但不会形成胶质瘢痕。其原因是因为鱼视网膜损伤后胶质细胞增生被精确调控，保留上皮特性且不进行上皮-间质转化。虽然斑马鱼Müller细胞具有多潜能干细胞特性，但同时也是视杆细胞前体细胞，因而能同时表达静止体细胞相关蛋白和干细胞不对称有丝分裂标记蛋白。因此，鱼Müller细胞可以通过对体内稳态信号的反应不对称分裂，产生视杆细胞的前体细胞或多潜能神经前体细胞。迄今为止，哺乳动物视网膜再生研究主要集中于损伤后Müller细胞的改变。但多数研究显示，损伤后Müller细胞在基因表达和信号通路改变（如Stat3、肝素结合性表皮生长因子、TNF-α）所导致的胶质细胞增生较神经细胞再生更多。从中可以看出神经源性转录因子和神经细胞再生必需的因子如Acsl1a、Pax6、Six3、NeuroD，必须能驱使Müller细胞来源的视网膜前体细胞而不是Müller细胞本身发生增生分化[7]。尽管如此，哺乳动物Müller细胞在体外实验中也发现具有潜在光感受器细胞前体细胞和双极神经细胞特征[17-18]，从而揭示其也具有NSC细胞特性。进一步研究表明，在受损伤的小鼠视网膜，外源性神经前转录因子Ascl1的高表达具有提高Müller细胞增生并再生无长突神经细胞、双级神经细胞和光感受器细胞的能力[19]。但是Müller细胞这种增生能力仅限制在幼鼠，因为外源基因进入染色体的能力在成年小鼠中受到广泛限制。然而最新研究表明，视网膜Müller细胞中Ascl1的过表达联合组蛋白脱乙酰酶抑制剂能绕开这些限制，促进成年小鼠视网膜损伤后新的神经细胞再生[20]。这些再生的神经细胞能整合进入已有的神经网络并能对光做出反应，从而挽救视力。虽然这一结果极有前途，但哺乳动物与斑马鱼相比，其Müller细胞增生再生能力十分有限。总之，寻找除Ascl1外能增强哺乳动物视网膜Müller细胞有丝分裂能力的新因子以再生完整的视网膜是今后视网膜再生非常有前景的研究方向。
3 MicroRNA（miR）与Müller细胞再生
有研究表明，miR-9在斑马鱼Müller细胞中的表达能调控视网膜NSC增生和分化，miR-9的耗损能提高斑马鱼视网膜神经前体细胞和神经细胞的数量；进一步研究发现，miR-9下游目的基因TLX和ONECUT mRNAs的过表达能提高斑马鱼NSC向神经细胞分化的能力[21]。有趣的是，能提高视网膜NSC增生能力的Lin28是miR-9的靶目标[22]。miR-9的表达能抑制视网膜前体细胞生成，表明miR-9作为Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信号通路的负调节单元阻止了Müller细胞增生，而miR-9下游的目的基因能促进NSC增生和分化。在哺乳动物中，miRlet-7、miR-9是小鼠视网膜前体细胞向晚期发育成熟的关键调节因子，并能促使整个视网膜发育加快。而这些miR的靶基因Protogenin和Lin28表达升高能抑制视网膜前体细胞的进一步发育[22]。证实miRlet-7、miR-9作为Sox2-Ascl1a/Atoh7-Lin28信号通路的负调节单元同样能阻止小鼠Müller细胞增生。在转染的HEK293细胞中，miRlet-7能抑制再生相关基因Ascl1a、Hspd1、Lin-28、Pax6b和Oct4的表达[12]，在小鼠NSC中，miRlet-7b（let-7 microRNA家族成员）能通过作用于干细胞调节因子TLX和细胞周期调节因子CyclinD而抑制NSC的增生[23]。总之，这一发现支持了miR-9/ miRlet-7-TLX-ONECUT通路作为内源性Müller细胞重编程分化为有功能的视网膜神经细胞所发挥的重要作用。
4 未来展望
现阶段研究主要的限制还在于NSC分化效率的不高。寻找新的能提高NSC分化效率的因子成为重中之重，如Ascl1对小鼠Müller细胞重编程过程只诱导了中等程度的双极细胞再生[20]。表明其他控制Müller细胞增生和分化的因子很可能没有受Ascl1的调节。然而已有研究确认，Müller细胞在斑马鱼视网膜损伤后少数细胞因子能提高Müller细胞的再生能力[24]。由于哺乳动物Müller细胞再生和分化能力的有限，需要找出哪种因子能高效促进Müller细胞在斑马鱼视网膜中的再生并将其移植到人视网膜再生过程中。最后怎样将位于上游或平行于Ascl1的不同转录因子联合起来并促进神经细胞增生和分化将成为一个重要的待解决问题。未来几年，随着高通量检测技术的广泛应用，促进Müller细胞再生和分化的候选基因将被筛选出，如果能找到这样的基因，并整合各个转录因子，将极大提高Müller细胞分化为神经细胞的能力，为视网膜再生的临床应用带来切实可行的希望。