引用本文： 漆晨, 张慧, 林婷婷, 柯屹峰, 任新军, 步绍翀, 黄亮瑜, 王勇, 焦明菲, 胡立颖, 王琼, 洪亚茹, 李筱荣, 东莉洁. 聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子高表达对糖基化终末产物诱导下视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用. 中华眼底病杂志, 2020, 36(1): 46-52. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.01.011 复制
慢性高血糖所致的糖基化终末产物（AGEs）在视网膜血管中的过度蓄积与糖尿病视网膜病变（DR）发生发展密切相关，其可以促进VEGF表达，增加氧化应激作用，促进视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞凋亡等[1]。有研究发现，AGEs能降低溶酶体酶的降解能力，促进脂褐素沉积，造成RPE细胞损伤。RPE细胞参与构成视网膜外屏障，具有屏障、滤过、吞噬和分泌等作用，在维持视网膜正常的生理功能方面发挥重要作用。因此，如何干预AGEs对RPE细胞的损伤已成为近年来研究热点。聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）是一种多功能蛋白，可参与基因转录调控、DNA损伤修复、pre-mRNA的剪接等[2-3]。我们的前期研究发现，PSF蛋白可以通过抑制H2O2诱导的氧化应激反应造成的ROS堆积，维持RPE细胞稳态平衡，缓解RPE细胞凋亡[4]。考虑到AGEs是细胞氧化应激反应的重要诱导因素之一，本研究将PSF蛋白引入经AGEs刺激体外培养的人RPE细胞模型中，从而观察PSF蛋白对AGEs诱导的RPE细胞的影响，以期阐明三者之间的相互作用，为DR生物学治疗开发潜在新的治疗靶点提供理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及分组
人RPE细胞株（ARPE-19细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司）。增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）-PSF真核表达质粒由本实验室自行构建。MTT（北京索莱宝科技有限公司），AGEs溶液、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（美国Sigma公司），转染试剂脂质体2000（美国Invitrogen公司），Hoechst 33258染色剂（上海翊圣生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜（美国Millipore公司），增强化学发光（ECL）曝光底物、Infinite M200 Pro多功能酶标仪（美国Tecan公司），Olympus BX51正置显微镜、Olympus IX53荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。
实验分为正常对照组（N组）、空白对照组（N+AGEs组）、空载体对照组（Vec+AGEs组）、PSF高表达组（PSF+AGEs组）进行。N组RPE细胞常规培养；N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导；Vec+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将1.5 μg pcDNA空载体导入RPE细胞联合AGEs诱导；PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将1.5 μg pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外，其余3组细胞进行相应的转染处理，24 h后应用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，经Western blot结果证实pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞可成功高表达PSF蛋白，达到实验要求之后进行后续实验。
1.2 实验方法
采用HE染色观察PSF高表达对RPE细胞形态的影响[5]。将RPE细胞以2.5×105的密度爬片于24孔细胞培养板中预先放置的盖玻片，待细胞汇合度约70%，依据实验分组进行相应处理后，取出盖玻片，置于另一个干净24孔板中，细胞生长面向上，滴入4%多聚甲醛室温10 min进行固定，使用破膜水进行破膜，常温10 min，吸除后以清水冲洗2次后，将玻片取出浸泡于苏木精染液中30～60 s左右（视苏木精染液使用情况而调整），清水充分冲洗2次后，将玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水冲洗2次后，将玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水冲洗2次后，将玻片浸泡于伊红染液中30～60 s（视伊红染液使用情况而调整），过水后，按照酒精梯度流程，每缸30 s，确保充分脱水，最终将玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后将细胞生长面粘附于玻片上固定后，于荧光显微镜下进行观察。
采用Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡的影响。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，待细胞汇合度约70%，转染24 h，AGEs诱导72 h后弃培养液，PBS漂洗3次，每次1 min，加入4%多聚甲醛50 μl进行固定10 min后，PBS漂洗3次，每次5 min，每孔加入Hoechst 33258染液（0.5 μg/ml）30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min，荧光显微镜下观察、拍照。
DCFH-DA法检测PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，转染24 h后弃去培养液，给予AGEs处理72 h，PBS洗1次，加入30 μl终浓度为5 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min。DCFH-DA孵育结束后，使用PBS清洗2次，置于荧光显微镜下拍照并经酶联免疫检测仪在488 nm波长下测定各孔细胞吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。以A值反映各组细胞的ROS产量，每组设3个副孔，实验重复3次。
采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响[6]。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，待细胞汇合度约70%。将细胞分为正常组[AGEs-PSF-原卟啉锌（ZnPP）-]、AGEs处理组（AGEs+PSF-ZnPP-）、PSF高表达组（AGEs+PSF+ZnPP-）及ZnPP处理组（AGEs+PSF+ZnPP+）。按照实验分组进行相应转染，孵育24 h后，10 μmol/L的ZnPP处理2 h，150 μg/ml AGEs诱导72 h后每孔加入150 μl DMSO，经酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔细胞A值。每组设定3个副孔，实验共重复进行3次。
采用Western blot检测PSF高表达对血红素氧合酶1（HO-1）表达的影响[7]。按6×105个/孔接种细胞于1 ml培养体系的6孔细胞培养板中，待细胞汇合度约70%，一组细胞转染等量的PSF真核表达质粒，转染24 h后，弃去培养液，给予AGEs处理并分别于0、24、48、72 h收集各组全细胞提取物；另一组细胞分别转染递增量的PSF真核表达质粒，质量梯度为0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg，转染24 h后，弃去培养液，给予AGEs处理72 h后收集各组全细胞提取物，测定蛋白浓度，经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白复合物，将蛋白复合物转至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；HRP标记的二抗继续孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入ECL曝光底物，进行曝光并拍照，以GAPDH为内参照检测各组细胞中HO-1的不同表达水平并通过图像分析软件ImageJ进行定量灰度分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差（
±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，N组细胞形态饱满，细胞质丰富，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，细胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞质染色较均匀，偶见体积缩小（图1）。
图1
各组细胞光学显微镜像。1A~1D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞形态饱满，细胞核呈圆形；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，细胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（黑箭头）；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞质染色较均匀，偶见体积缩小（黑箭头） HE 标尺：100 μm
荧光显微镜观察发现，N组细胞核呈圆形，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核致密浓染，皱缩变小，或呈碎块状；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且其细胞核碎裂减少（图2）。
图2
各组细胞荧光显微镜像。2A~2D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强（白箭头）；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且细胞核碎裂减少（白箭头）Hoechst 33258 标尺：100 μm
荧光显微镜观察发现，N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且细胞核碎裂减少（图3）。DCFH-DA法检测结果显示，N+AGEs组、Vec+AGEs组、PSF+AGEs组细胞中ROS产量分别为8605.22±576.14、8827.44±892.62、3486.11±552.31。4组细胞中ROS产量比较，差异有统计学意义（F=11.94，P＜0.05）。与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较，PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降，差异有统计学意义（P=0.000、0.000）（图4）。
图3
各组细胞荧光显微镜像。3A~3D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强（白箭头）；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，荧光减弱，且细胞核碎裂减少 DCFH-DA 标尺：100 μm
图4
各组细胞中ROS产量比较。*P＜0.05
MTT比色法检测结果显示，正常组、AGEs处理组、PSF高表达组及ZnPP处理组细胞生存力分别为1.04±0.10、0.63±0.09、0.94±0.10、0.67±0.11。4组间比较，差异有统计学意义（F=33.26，P=0.000）（图5）。
图5
各组细胞生存力比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，PSF蛋白以时间依赖性的方式上调HO-1的表达水平。在PSF蛋白作用0、24、48、72 h，HO-1相对表达水平依次为0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。不同PSF蛋白作用时间的HO-1相对表达水平比较，差异有统计学意义（F=164.91，P＜0.05）。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000）（图6）。
图6
不同PSF蛋白作用时间HO-1相对表达水平比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，PSF蛋白以剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg PSF蛋白作用下，HO-1相对表达水平依次为0.62±0.01、0.90±0.01、1.03±0.03、1.07±0.04、1.16±0.04、1.10±0.04。不同剂量PSF蛋白作用的HO-1相对表达水平比较，差异有统计学意义（F=104.82，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0 µg明显升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）（图7）。
图7
不同剂量PSF蛋白作用下HO-1相对表达水平比较。*P＜0.05
3 讨论
AGEs堆积是DR的主要致病因素，沉积在组织细胞上的AGEs能刺激其受体表达增加，两者结合相互作用增加细胞内氧化应激水平，引起一系列组织病理学改变[4, 8-11]。鉴于此，本研究选用AGEs作为诱导剂处理RPE细胞，以期在一定程度上模拟糖尿病患者眼部的微环境特征[12-14]。
RPE细胞的异常病理变化在多种视网膜疾病的发生发展过程中发挥重要作用[15]。用AGEs处理过的培养基来培养人RPE细胞，可导致AGEs受体（RAGE）的蛋白和mRNA表达增加。不仅如此，上调RAGE信使核糖核酸的表达，可促进周细胞内ROS的形成，从而加剧AGEs对视网膜的破坏作用。因此，保护RPE细胞免受AGEs损伤或可成为延缓和治疗DR的一条重要途径。
PSF是由707个氨基酸残基组成，相对分子质量为76×103的多功能蛋白，可在多种信号通路中发挥转录抑制因子的作用。其不仅可参与基因转录调控、DNA损伤修复、pre-mRNA剪接加工，而且是视网膜新生血管形成及视神经再生中重要的调控因子[2, 16-17]，因此近年来PSF成为眼科学研究领域的又一新型热点蛋白。我们的前期研究结果显示，PSF可以抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管增生[18]。在此基础之上进一步明确了胰岛素生长因子-1刺激后PSF可通过调控体外培养的RPE细胞磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[18-19]。
基于此，本研究将PSF引入人RPE细胞模型中，并利用AGEs作为诱导剂刺激RPE细胞，目的在于观察PSF高表达对AGEs作用下RPE细胞的保护作用。我们首先选择的是比较直观的HE染色及Hoechst 33258染色去观察AGEs刺激状态下RPE细胞的形态学改变以及PSF高表达对其产生的影响，结果显示正常培养的RPE细胞形态饱满，细胞质染色均一，细胞核淡染；而AGEs刺激可诱导细胞出现体积变小，细胞质浓缩，细胞核致密浓染甚至碎裂等一系列凋亡相关形态学改变；相比之下，PSF高表达组细胞形态尚饱满，细胞质相对丰富，细胞核形态比较稳定。除此之外，我们还发现，PSF可以显著下调AGEs诱导的RPE细胞内ROS的表达水平。ROS过量会打破机体正常氧化/还原动态平衡，造成生物大分子如蛋白质、脂质、核酸等的氧化损伤[20-24]。不仅如此，ROS还是重要的细胞内信使，可以活化许多信号传导通路，如蛋白激酶C途径、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶途径，这些途径的异常活化均与糖尿病大血管并发症的发生发展密切相关[25-28]。据此推测PSF可能通过减少ROS的积聚，帮助稳定体内氧化与抗氧化的动态平衡，从而有效缓解细胞的氧化应激损伤。
为初步探讨PSF蛋白的作用机制，我们在实验体系中引入HO-1的特异性抑制剂ZnPP。MTT量化分析发现，ZnPP可有效拮抗PSF蛋白对细胞的保护作用，下调细胞的生存力。该结果提示PSF蛋白在一定程度上是通过调控HO-1的表达来发挥对细胞的保护作用。在此基础之上，我们进一步观察到PSF蛋白不仅可以上调HO-1的表达，而且PSF蛋白对HO-1的表达调控还具有时间和剂量的依赖性，即伴随PSF蛋白的作用时间延长以及作用浓度增加，PSF蛋白对HO-1的上调作用显著提高。HO-1是机体抗氧化系统的重要组成部分，作为NF-E2相关因子2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗细胞凋亡等作用[29]。由此可见，PSF蛋白通过促进HO-1的表达，可有效拮抗AGEs诱导细胞氧化损伤和炎症反应。
本研究结果表明，PSF通过缓解氧化损伤来有效保护AGEs诱导的RPE细胞损伤，其有望成为DR防治的潜在干预靶点。即利用生物学手段，特异性的上调细胞中PSF的表达水平，内源性提高RPE细胞的抗氧化能力，进而抑制或延缓DR的发生发展。
慢性高血糖所致的糖基化终末产物（AGEs）在视网膜血管中的过度蓄积与糖尿病视网膜病变（DR）发生发展密切相关，其可以促进VEGF表达，增加氧化应激作用，促进视网膜毛细血管内皮细胞和周细胞凋亡等[1]。有研究发现，AGEs能降低溶酶体酶的降解能力，促进脂褐素沉积，造成RPE细胞损伤。RPE细胞参与构成视网膜外屏障，具有屏障、滤过、吞噬和分泌等作用，在维持视网膜正常的生理功能方面发挥重要作用。因此，如何干预AGEs对RPE细胞的损伤已成为近年来研究热点。聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子（PSF）是一种多功能蛋白，可参与基因转录调控、DNA损伤修复、pre-mRNA的剪接等[2-3]。我们的前期研究发现，PSF蛋白可以通过抑制H2O2诱导的氧化应激反应造成的ROS堆积，维持RPE细胞稳态平衡，缓解RPE细胞凋亡[4]。考虑到AGEs是细胞氧化应激反应的重要诱导因素之一，本研究将PSF蛋白引入经AGEs刺激体外培养的人RPE细胞模型中，从而观察PSF蛋白对AGEs诱导的RPE细胞的影响，以期阐明三者之间的相互作用，为DR生物学治疗开发潜在新的治疗靶点提供理论依据。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及分组
人RPE细胞株（ARPE-19细胞，广州吉妮欧生物科技有限公司）。增强型绿色荧光蛋白质粒（pEGFP）-PSF真核表达质粒由本实验室自行构建。MTT（北京索莱宝科技有限公司），AGEs溶液、2’,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）（美国Sigma公司），转染试剂脂质体2000（美国Invitrogen公司），Hoechst 33258染色剂（上海翊圣生物科技有限公司），聚偏氟乙烯膜（PVDF）膜（美国Millipore公司），增强化学发光（ECL）曝光底物、Infinite M200 Pro多功能酶标仪（美国Tecan公司），Olympus BX51正置显微镜、Olympus IX53荧光倒置显微镜（日本Olympus公司）。
实验分为正常对照组（N组）、空白对照组（N+AGEs组）、空载体对照组（Vec+AGEs组）、PSF高表达组（PSF+AGEs组）进行。N组RPE细胞常规培养；N+AGEs组只做转染处理但不导入任何外源性基因的RPE细胞联合AGEs诱导；Vec+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将1.5 μg pcDNA空载体导入RPE细胞联合AGEs诱导；PSF+AGEs组利用转染试剂脂质体2000将1.5 μg pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞联合AGEs诱导。除N组以外，其余3组细胞进行相应的转染处理，24 h后应用150 μg/ml的AGEs刺激72 h，经Western blot结果证实pcDNA-PSF真核表达质粒导入RPE细胞可成功高表达PSF蛋白，达到实验要求之后进行后续实验。
1.2 实验方法
采用HE染色观察PSF高表达对RPE细胞形态的影响[5]。将RPE细胞以2.5×105的密度爬片于24孔细胞培养板中预先放置的盖玻片，待细胞汇合度约70%，依据实验分组进行相应处理后，取出盖玻片，置于另一个干净24孔板中，细胞生长面向上，滴入4%多聚甲醛室温10 min进行固定，使用破膜水进行破膜，常温10 min，吸除后以清水冲洗2次后，将玻片取出浸泡于苏木精染液中30～60 s左右（视苏木精染液使用情况而调整），清水充分冲洗2次后，将玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水冲洗2次后，将玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水冲洗2次后，将玻片浸泡于伊红染液中30～60 s（视伊红染液使用情况而调整），过水后，按照酒精梯度流程，每缸30 s，确保充分脱水，最终将玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后将细胞生长面粘附于玻片上固定后，于荧光显微镜下进行观察。
采用Hoechst 33258染色观察PSF高表达对RPE细胞凋亡的影响。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，待细胞汇合度约70%，转染24 h，AGEs诱导72 h后弃培养液，PBS漂洗3次，每次1 min，加入4%多聚甲醛50 μl进行固定10 min后，PBS漂洗3次，每次5 min，每孔加入Hoechst 33258染液（0.5 μg/ml）30 μl，染色15 min后，吸去染液，PBS洗3次，每次5 min，荧光显微镜下观察、拍照。
DCFH-DA法检测PSF高表达对AGEs诱导的RPE细胞ROS表达的影响。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，转染24 h后弃去培养液，给予AGEs处理72 h，PBS洗1次，加入30 μl终浓度为5 μmol/L DCFH-DA避光孵育30 min。DCFH-DA孵育结束后，使用PBS清洗2次，置于荧光显微镜下拍照并经酶联免疫检测仪在488 nm波长下测定各孔细胞吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。以A值反映各组细胞的ROS产量，每组设3个副孔，实验重复3次。
采用MTT比色法检测PSF高表达对RPE细胞生存力的影响[6]。接种RPE细胞于200 μl培养体系的96孔细胞板中，待细胞汇合度约70%。将细胞分为正常组[AGEs-PSF-原卟啉锌（ZnPP）-]、AGEs处理组（AGEs+PSF-ZnPP-）、PSF高表达组（AGEs+PSF+ZnPP-）及ZnPP处理组（AGEs+PSF+ZnPP+）。按照实验分组进行相应转染，孵育24 h后，10 μmol/L的ZnPP处理2 h，150 μg/ml AGEs诱导72 h后每孔加入150 μl DMSO，经酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔细胞A值。每组设定3个副孔，实验共重复进行3次。
采用Western blot检测PSF高表达对血红素氧合酶1（HO-1）表达的影响[7]。按6×105个/孔接种细胞于1 ml培养体系的6孔细胞培养板中，待细胞汇合度约70%，一组细胞转染等量的PSF真核表达质粒，转染24 h后，弃去培养液，给予AGEs处理并分别于0、24、48、72 h收集各组全细胞提取物；另一组细胞分别转染递增量的PSF真核表达质粒，质量梯度为0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg，转染24 h后，弃去培养液，给予AGEs处理72 h后收集各组全细胞提取物，测定蛋白浓度，经SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白复合物，将蛋白复合物转至PVDF膜。5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；HRP标记的二抗继续孵育1 h，1倍TBST洗膜3次，10 min/次；最后加入ECL曝光底物，进行曝光并拍照，以GAPDH为内参照检测各组细胞中HO-1的不同表达水平并通过图像分析软件ImageJ进行定量灰度分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS18.0软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，N组细胞形态饱满，细胞质丰富，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，细胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞质染色较均匀，偶见体积缩小（图1）。
图1
各组细胞光学显微镜像。1A~1D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞形态饱满，细胞核呈圆形；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞体积缩小，细胞质致密浓缩、嗜酸性染色增强（黑箭头）；PSF+AGEs组细胞形态尚饱满，细胞质染色较均匀，偶见体积缩小（黑箭头） HE 标尺：100 μm
荧光显微镜观察发现，N组细胞核呈圆形，染色均一；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核致密浓染，皱缩变小，或呈碎块状；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且其细胞核碎裂减少（图2）。
图2
各组细胞荧光显微镜像。2A~2D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强（白箭头）；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且细胞核碎裂减少（白箭头）Hoechst 33258 标尺：100 μm
荧光显微镜观察发现，N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，且细胞核碎裂减少（图3）。DCFH-DA法检测结果显示，N+AGEs组、Vec+AGEs组、PSF+AGEs组细胞中ROS产量分别为8605.22±576.14、8827.44±892.62、3486.11±552.31。4组细胞中ROS产量比较，差异有统计学意义（F=11.94，P＜0.05）。与N+AGEs组、Vec+AGEs组比较，PSF+AGEs组细胞中ROS产量下降，差异有统计学意义（P=0.000、0.000）（图4）。
图3
各组细胞荧光显微镜像。3A~3D分别示N组、N+AGEs组、Vec+ AGEs组、PSF+ AGEs组。N组细胞核染色均一，形态完整；N+AGEs组、Vec+AGEs组细胞核浓缩固缩、碎裂，荧光增强（白箭头）；PSF+AGEs组部分细胞核边集呈新月状，荧光减弱，且细胞核碎裂减少 DCFH-DA 标尺：100 μm
图4
各组细胞中ROS产量比较。*P＜0.05
MTT比色法检测结果显示，正常组、AGEs处理组、PSF高表达组及ZnPP处理组细胞生存力分别为1.04±0.10、0.63±0.09、0.94±0.10、0.67±0.11。4组间比较，差异有统计学意义（F=33.26，P=0.000）（图5）。
图5
各组细胞生存力比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，PSF蛋白以时间依赖性的方式上调HO-1的表达水平。在PSF蛋白作用0、24、48、72 h，HO-1相对表达水平依次为0.37±0.01、0.84±0.06、0.96±0.05、1.00±0.02。不同PSF蛋白作用时间的HO-1相对表达水平比较，差异有统计学意义（F=164.91，P＜0.05）。PSF蛋白作用24、48、72 h的HO-1相对表达水平较0 h明显升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000）（图6）。
图6
不同PSF蛋白作用时间HO-1相对表达水平比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，PSF蛋白以剂量依赖性的方式上调HO-1的表达水平。0.0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg PSF蛋白作用下，HO-1相对表达水平依次为0.62±0.01、0.90±0.01、1.03±0.03、1.07±0.04、1.16±0.04、1.10±0.04。不同剂量PSF蛋白作用的HO-1相对表达水平比较，差异有统计学意义（F=104.82，P＜0.05）。0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 µg PSF蛋白作用下的HO-1相对表达水平较0.0 µg明显升高，差异有统计学意义（P=0.000、0.000、0.000、0.000、0.000）（图7）。
图7
不同剂量PSF蛋白作用下HO-1相对表达水平比较。*P＜0.05
3 讨论
AGEs堆积是DR的主要致病因素，沉积在组织细胞上的AGEs能刺激其受体表达增加，两者结合相互作用增加细胞内氧化应激水平，引起一系列组织病理学改变[4, 8-11]。鉴于此，本研究选用AGEs作为诱导剂处理RPE细胞，以期在一定程度上模拟糖尿病患者眼部的微环境特征[12-14]。
RPE细胞的异常病理变化在多种视网膜疾病的发生发展过程中发挥重要作用[15]。用AGEs处理过的培养基来培养人RPE细胞，可导致AGEs受体（RAGE）的蛋白和mRNA表达增加。不仅如此，上调RAGE信使核糖核酸的表达，可促进周细胞内ROS的形成，从而加剧AGEs对视网膜的破坏作用。因此，保护RPE细胞免受AGEs损伤或可成为延缓和治疗DR的一条重要途径。
PSF是由707个氨基酸残基组成，相对分子质量为76×103的多功能蛋白，可在多种信号通路中发挥转录抑制因子的作用。其不仅可参与基因转录调控、DNA损伤修复、pre-mRNA剪接加工，而且是视网膜新生血管形成及视神经再生中重要的调控因子[2, 16-17]，因此近年来PSF成为眼科学研究领域的又一新型热点蛋白。我们的前期研究结果显示，PSF可以抑制氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管增生[18]。在此基础之上进一步明确了胰岛素生长因子-1刺激后PSF可通过调控体外培养的RPE细胞磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[18-19]。
基于此，本研究将PSF引入人RPE细胞模型中，并利用AGEs作为诱导剂刺激RPE细胞，目的在于观察PSF高表达对AGEs作用下RPE细胞的保护作用。我们首先选择的是比较直观的HE染色及Hoechst 33258染色去观察AGEs刺激状态下RPE细胞的形态学改变以及PSF高表达对其产生的影响，结果显示正常培养的RPE细胞形态饱满，细胞质染色均一，细胞核淡染；而AGEs刺激可诱导细胞出现体积变小，细胞质浓缩，细胞核致密浓染甚至碎裂等一系列凋亡相关形态学改变；相比之下，PSF高表达组细胞形态尚饱满，细胞质相对丰富，细胞核形态比较稳定。除此之外，我们还发现，PSF可以显著下调AGEs诱导的RPE细胞内ROS的表达水平。ROS过量会打破机体正常氧化/还原动态平衡，造成生物大分子如蛋白质、脂质、核酸等的氧化损伤[20-24]。不仅如此，ROS还是重要的细胞内信使，可以活化许多信号传导通路，如蛋白激酶C途径、丝裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶途径，这些途径的异常活化均与糖尿病大血管并发症的发生发展密切相关[25-28]。据此推测PSF可能通过减少ROS的积聚，帮助稳定体内氧化与抗氧化的动态平衡，从而有效缓解细胞的氧化应激损伤。
为初步探讨PSF蛋白的作用机制，我们在实验体系中引入HO-1的特异性抑制剂ZnPP。MTT量化分析发现，ZnPP可有效拮抗PSF蛋白对细胞的保护作用，下调细胞的生存力。该结果提示PSF蛋白在一定程度上是通过调控HO-1的表达来发挥对细胞的保护作用。在此基础之上，我们进一步观察到PSF蛋白不仅可以上调HO-1的表达，而且PSF蛋白对HO-1的表达调控还具有时间和剂量的依赖性，即伴随PSF蛋白的作用时间延长以及作用浓度增加，PSF蛋白对HO-1的上调作用显著提高。HO-1是机体抗氧化系统的重要组成部分，作为NF-E2相关因子2的下游基因，其具有抗炎、抗氧化及抗细胞凋亡等作用[29]。由此可见，PSF蛋白通过促进HO-1的表达，可有效拮抗AGEs诱导细胞氧化损伤和炎症反应。
本研究结果表明，PSF通过缓解氧化损伤来有效保护AGEs诱导的RPE细胞损伤，其有望成为DR防治的潜在干预靶点。即利用生物学手段，特异性的上调细胞中PSF的表达水平，内源性提高RPE细胞的抗氧化能力，进而抑制或延缓DR的发生发展。
