引用本文： 黄亮瑜, 柯屹峰, 林婷婷, 步绍翀, 任新军, 焦明菲, 王勇, 胡立颖, 王琼, 洪雅茹, 李筱荣, 东莉洁. 慢病毒介导聚嘧啶束结合蛋白相关剪接因子对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的抑制作用. 中华眼底病杂志, 2020, 36(1): 53-59. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.01.012 复制
由缺氧、高血糖等因素所致的线粒体内ROS大量堆积而诱发的氧化应激，可加重微血管代谢紊乱，导致微血管病变进一步恶化，从而在新生血管性疾病中发挥重要作用[1-3]。NF-E2相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶1（HO-1）通路作为关键的内源性抗氧化应激通路，在恢复氧化与抗氧化稳态平衡中发挥重要的调控作用[4-6]。本课题组前期研究结果证实，高表达聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）可以抑制ROS的产生进而缓解H2O2诱导的人RPE细胞凋亡[7]。鉴于在培养体系中添加H2O2是研究氧化应激的经典模型，而缺氧是氧化应激的重要触发因素，我们推测PSF可能通过抑制氧化应激反应来调控新生血管的形成。为验证这一推测，本研究观察了玻璃体腔注射慢病毒介导的PSF对氧诱导视网膜病变（OIR）模型小鼠视网膜新生血管的抑制作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及OIR模型建立
5日龄C57BL/6J小鼠，雌雄不限，清洁级，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。氧浓度90%、85%、（80±3）% 3个氧梯度浓度氮氧混合气（天津塞米气体有限公司）；CY-12C数字测氧仪（浙江建德梅城电化分析仪器厂）；高分子量异硫氰酸荧光素葡聚糖（FITC-dextran，美国Sigma公司）；10 μl微量注射器（Hamilton，美国Sigma公司）。腺病毒包装及纯化由本实验室自行完成。Olymplus荧光显微镜（BX51，日本Olympus公司）；7900HT实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；RNA提取试剂盒（美国Thermo公司）；逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；SYBR荧光定量染料（德国Roche公司）；抗Nrf2（NFE2L2）抗体（PB0327）、抗HO-1抗体（BA0605-1）（美国Boster公司）；单克隆抗PSF抗体（P2860，美国Sigma公司）。
将5日龄C57BL/6J小鼠112只与成熟哺育雌鼠14只常规共养2 d。将112只小鼠随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组（以下简称Vec组）及OIR模型+ PSF慢病毒处理组（以下简称PSF组），分别为16、32、32、32只。于小鼠7日龄时，正常对照组小鼠与2只成熟哺育雌鼠继续放置于常规环境饲养。单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠与12只成熟哺乳雌鼠移入长方形密闭玻璃箱中饲养，预备90%、85%、80%氧气注入密闭箱中，氧气瓶浓度由高至低顺序使用，密闭箱每日固定时间开启一次，同时简单更换垫料、添加食水，密闭后再以测氧仪确认密闭箱中氧浓度不低于氧气瓶浓度10%，以确认饲养箱的密闭性持续维持高氧饲养环境。5 d后即小鼠12日龄时，将所有密闭箱雌鼠、小鼠移出密闭玻璃箱。正常对照组与单纯OIR模型组小鼠不进行任何操作。Vec组与PSF组小鼠玻璃体腔注射空载体病毒或PSF慢病毒。显微镊轻轻拨开小鼠眼充分暴露眼球，33G微量注射器于上方垂直进针，确认针尖于眼内，未触及晶状体及视网膜，轻推滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1 μl，计时15 s后缓慢出针，给予左氧氟沙星滴眼液点眼抗炎抗感染治疗，恢复至正常氧环境中继续饲养至17日龄。
1.2 实验方法
采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠以颈椎脱臼法处死。取双眼眼球充分浸泡于4%多聚甲醛中固定过夜，经常规酒精梯度充分脱水，二甲苯透明化，石蜡包埋保存。将蜡块取出，经6 µm厚度连续切片，切片粘附于载玻片上，破膜水进行破膜，常温10 min，吸除后以清水冲洗2次，浸泡于苏木精染液中40 s（浸泡时间随苏木精染液使用情况而调整），清水漂洗2次；将载玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水冲洗2次；将载玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水漂洗2次；将载玻片浸泡于伊红染液中30 s（浸泡时间随伊红染液使用情况而调整），迅速过水后，按照酒精梯度流程（80%、85%、95%、100%、100%）每缸充分浸泡30 s脱水，浸泡过程轻轻摆动载玻片；最终将载玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后覆上盖玻片，光学显微镜观察并照相。以双盲法计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。
作视网膜铺片，测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠。手指按压固定小鼠头部，使用1 ml注射器+33G针头组合，将50 µl浓度50 mg/ml的FITC-dextran注入小鼠球后静脉窦，用以标记着染视网膜血管。注射后松开小鼠，静置5 min后以颈椎脱臼法处死并取出双眼眼球。将眼球完全浸泡于4%多聚甲醛中，40 min后取出放入PBS中，4 ℃过夜。次日，使用显微剪沿角膜缘环形剪开眼球，剥除角膜获得完整碗状视网膜，RGC层向上放置，使用显微剪自赤道部往视神经处人字型剪开，完全铺平视网膜。
采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中Nrf2和HO-1的mRNA相对表达量。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠颈椎脱臼法处死。摘取眼球放入离心管中将组织剪碎，加入1 ml、4 ℃预冷的Trizol，提取总RNA，超微量分光光度计测量波长260、280 nm处吸光度［A，旧称光密度（OD）］比值（A260/A280）。以比值介于1.8～2.0之间视为良好，可用于后续逆转录反应。按照逆转录试剂盒操作说明逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：1 µg RNA，1 µl 多聚胸腺嘧啶（T重复寡核酸），无酶水补充至总体性12 µl，65 ℃ 5 min；继续添加4 µl 5倍反应缓冲液，1 µl核糖核酸酶抑制剂，1 µl 逆转录，2 µl 脱氧核糖核苷三磷酸，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。在NCBI数据库中设计目的基因和内参基因的引物序列（表1），由金唯智生物科技有限公司合成引物。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，重复35个循环；37 ℃ 5 min。目的基因扩增产物的相对表达量应用2−ΔΔCT进行计算。
表1
目的基因引物序列
采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相对表达量。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠颈椎脱臼法处死。取视网膜放置于含有100 μl组织裂解液的1.5 ml离心管中，提取总蛋白，调整蛋白浓度。配制10%分离胶聚丙烯酰胺凝胶，以每组40 μg的总蛋白量进行上样，SDS-PAGE分离蛋白复合物，电泳结束后利用半干转膜法将蛋白条带转印至聚偏氟乙烯膜后，依次历经5%脱脂奶粉室温封闭1 h，抗Nrf2抗体、抗HO-1抗体、抗PSF抗体一抗室温孵育2 h，PBS洗膜10 min，重复3次；加入HRP偶联的二抗室温孵育1 h，PBS洗膜10 min，重复3次。最后加入化学发光法曝光底物，进行曝光并拍照，以检测靶蛋白表达。采用ImageJ图像分析软件进行灰度分析，以GAPDH作为内参照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS18.0统计软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差（
±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常对照组小鼠视网膜未见突破内界膜的血管内皮细胞核；单纯OIR模型组与Vec组小鼠视网膜中可见较多突破内界膜的血管内皮细胞核；PSF组小鼠视网膜中可见少量突破内界膜的血管内皮细胞核（图1）。正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数比较，差异有统计学意义（F=24.87，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较正常对照组明显增多，PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较单纯OIR模型组、Vec组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图1
各组小鼠视网膜HE染色光学显微镜像。1A示正常对照组；1B示单纯OIR模型组；1C示Vec组；1D示PSF组。正常对照组小鼠视网膜未见突破内界膜的血管内皮细胞核；单纯OIR模型组与Vec组小鼠视网膜中可见较多突破内界膜的血管内皮细胞核；PSF组小鼠视网膜中可见少量突破内界膜的血管内皮细胞核 HE ×10
正常对照组小鼠视网膜血管呈亮绿色荧光着染，未见无灌注区；单纯OIR模型组及Vec组小鼠视网膜可见大量无灌注区且周边交界处清晰可见；PSF组小鼠视网膜可见少量未相连的无灌注区（图2）。正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠视网膜无灌注区面积分别为0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4组间小鼠视网膜无灌注区面积比较，差异有统计学意义（F=165.70，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜无灌注区面积较正常对照组明显增大，PSF组小鼠视网膜无灌注区面积较单纯OIR模型组、Vec组明显减小，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图2
各组小鼠视网膜铺片荧光显微镜像。2A示正常对照组；2B示单纯OIR模型组；2C示Vec组；2D示PSF组。正常对照组视网膜未见无灌注区，单纯OIR模型组及Vec组小鼠视网膜可见大量无灌注区（红色圈选区）；PSF组小鼠视网膜可见少量未相连的无灌注区（红色圈选区） FITC-dextran ×10
实时定量PCR检测结果显示，4组间小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=53.66、83.54，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量较正常对照组明显降低，PSF组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。
图3
各组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，4组间小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（F=58.38、52.69、24.79，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低，PSF组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图4）。
图4
各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相对表达量比较。*P＜0.05
3 讨论
研究发现，氧化应激在眼部病变中发挥重要作用[1,8-9]，氧化应激是指当体内抗氧化防御体系如超氧化物歧化酶、HO-1、过氧化氢酶等低于正常水平，导致ROS的产生与清除之间的稳态失衡，进而造成组织损伤的病理状态[10-12]。在氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体，活化下游信号，导致内皮细胞的增生和迁移以及新生血管的形成[13-14]。不仅如此，诸多导致新生血管的因素如高氧、缺血再灌注和炎症等均可引起体内产生过多的ROS[15-17]。换言之，由抗氧化治疗入手很可能为抑制病理性新生血管的形成提供一种新的思路。
PSF是参与多种不同的生物学反应的多功能蛋白，包括DNA损伤修复、pre-mRNA的剪接加工以及基因的转录调控[18-19]。研究表明，IL-4刺激后，PSF可与信号转导子和转录激活子6（STAT6）结合形成复合物，进而抑制IL-4/STAT6信号通路的转录激活[20]。并且，PSF通过调节细胞因子信号抑制物3的表达间接参与视神经再生的调控，这一发现对视神经损伤性疾病有重要的学术意义和潜在的应用价值[21]。
本课题组前期研究发现，PSF蛋白可以抑制OIR小鼠视网膜新生血管的形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管增生[22]。而将PSF引入RPE细胞体外氧化应激模型中，PSF蛋白可以抑制ROS堆积，维持RPE细胞的稳态平衡。考虑到氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体及下游信号，导致内皮细胞增生和迁移以及新生血管形成[23]。据此我们推测，PSF蛋白有可能通过活化抗氧化体系来抑制新生血管形成。为明确这一推论，本研究观察分析了PSF对Nrf2及其下游基因HO-1的表达调控。Nrf2是参与调控抵抗氧化应激的主要核转录因子，当ROS等氧化应激因素存在时，Nrf2与抗氧化反应元件结合，诱导下游HO-1等多种抗氧化基因，从而发挥抗氧化应激保护细胞的作用[24]。
本研究结果显示，玻璃体腔内注射PSF会导致小鼠视网膜组织内PSF的高表达，进而导致Nrf2 的表达上调；HO-1作为Nrf2的下游因子，其在视网膜组织内的表达量会随之上调；HO-1作为ROS的负性调控因子，其表达上调会抑制视网膜组织内ROS生成，进而抑制HIF-1α表达。组织内HIF-1α表达减少，会导致VEGF以及VEGF受体表达下降，继而在根本上抑制血管生成。PSF可以上调Nrf2的表达及其下游基因HO-1的表达，提示抑制氧化应激反应是PSF蛋白发挥作用的重要分子机制之一。
本课题组前期研究发现，PSF可以抑制视网膜血管内皮细胞中细胞外信号调节激酶信号通路的活化，下调VEGF表达，进而抑制内皮细胞增生[25]。此外，对于体外培养的RPE细胞，PSF可通过调控磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[26]。本研究结果显示，PSF可上调HO-1的表达，抑制氧化应激反应。结合既往研究结果，我们认为，PSF与ROS诱导的VEGF表达之间可能存在某种关联，即缺氧导致ROS堆积，过多的ROS诱导HIF-1α的转录活化，进而激活其下游VEGF表达。在后续的研究中，我们将把PSF引入人视网膜血管内皮细胞的缺氧模型，分别从细胞增生、迁移和管腔形成等多个方面去收集PSF参与血管新生的全面信息，解读PSF对于视网膜新生血管调控的完整作用，从而为视网膜新生血管性疾病的基因治疗夯实理论基础。
由缺氧、高血糖等因素所致的线粒体内ROS大量堆积而诱发的氧化应激，可加重微血管代谢紊乱，导致微血管病变进一步恶化，从而在新生血管性疾病中发挥重要作用[1-3]。NF-E2相关因子2（Nrf2）/血红素氧合酶1（HO-1）通路作为关键的内源性抗氧化应激通路，在恢复氧化与抗氧化稳态平衡中发挥重要的调控作用[4-6]。本课题组前期研究结果证实，高表达聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）可以抑制ROS的产生进而缓解H2O2诱导的人RPE细胞凋亡[7]。鉴于在培养体系中添加H2O2是研究氧化应激的经典模型，而缺氧是氧化应激的重要触发因素，我们推测PSF可能通过抑制氧化应激反应来调控新生血管的形成。为验证这一推测，本研究观察了玻璃体腔注射慢病毒介导的PSF对氧诱导视网膜病变（OIR）模型小鼠视网膜新生血管的抑制作用。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料及OIR模型建立
5日龄C57BL/6J小鼠，雌雄不限，清洁级，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。氧浓度90%、85%、（80±3）% 3个氧梯度浓度氮氧混合气（天津塞米气体有限公司）；CY-12C数字测氧仪（浙江建德梅城电化分析仪器厂）；高分子量异硫氰酸荧光素葡聚糖（FITC-dextran，美国Sigma公司）；10 μl微量注射器（Hamilton，美国Sigma公司）。腺病毒包装及纯化由本实验室自行完成。Olymplus荧光显微镜（BX51，日本Olympus公司）；7900HT实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；RNA提取试剂盒（美国Thermo公司）；逆转录试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒（美国Thermo公司）；SYBR荧光定量染料（德国Roche公司）；抗Nrf2（NFE2L2）抗体（PB0327）、抗HO-1抗体（BA0605-1）（美国Boster公司）；单克隆抗PSF抗体（P2860，美国Sigma公司）。
将5日龄C57BL/6J小鼠112只与成熟哺育雌鼠14只常规共养2 d。将112只小鼠随机分为正常对照组、单纯OIR模型组、OIR模型+慢病毒空载体处理组（以下简称Vec组）及OIR模型+ PSF慢病毒处理组（以下简称PSF组），分别为16、32、32、32只。于小鼠7日龄时，正常对照组小鼠与2只成熟哺育雌鼠继续放置于常规环境饲养。单纯OIR模型组、Vec组及PSF组小鼠与12只成熟哺乳雌鼠移入长方形密闭玻璃箱中饲养，预备90%、85%、80%氧气注入密闭箱中，氧气瓶浓度由高至低顺序使用，密闭箱每日固定时间开启一次，同时简单更换垫料、添加食水，密闭后再以测氧仪确认密闭箱中氧浓度不低于氧气瓶浓度10%，以确认饲养箱的密闭性持续维持高氧饲养环境。5 d后即小鼠12日龄时，将所有密闭箱雌鼠、小鼠移出密闭玻璃箱。正常对照组与单纯OIR模型组小鼠不进行任何操作。Vec组与PSF组小鼠玻璃体腔注射空载体病毒或PSF慢病毒。显微镊轻轻拨开小鼠眼充分暴露眼球，33G微量注射器于上方垂直进针，确认针尖于眼内，未触及晶状体及视网膜，轻推滴度为1×1011 TU/ml的空载体病毒或PSF慢病毒1 μl，计时15 s后缓慢出针，给予左氧氟沙星滴眼液点眼抗炎抗感染治疗，恢复至正常氧环境中继续饲养至17日龄。
1.2 实验方法
采用HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠以颈椎脱臼法处死。取双眼眼球充分浸泡于4%多聚甲醛中固定过夜，经常规酒精梯度充分脱水，二甲苯透明化，石蜡包埋保存。将蜡块取出，经6 µm厚度连续切片，切片粘附于载玻片上，破膜水进行破膜，常温10 min，吸除后以清水冲洗2次，浸泡于苏木精染液中40 s（浸泡时间随苏木精染液使用情况而调整），清水漂洗2次；将载玻片浸泡于1%醋酸中2～3 s，清水冲洗2次；将载玻片浸泡于0.5%氨水中2～3 s，清水漂洗2次；将载玻片浸泡于伊红染液中30 s（浸泡时间随伊红染液使用情况而调整），迅速过水后，按照酒精梯度流程（80%、85%、95%、100%、100%）每缸充分浸泡30 s脱水，浸泡过程轻轻摆动载玻片；最终将载玻片浸泡于二甲苯中1 min，取出晾干后覆上盖玻片，光学显微镜观察并照相。以双盲法计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核。
作视网膜铺片，测量各组小鼠视网膜无灌注区相对面积。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠。手指按压固定小鼠头部，使用1 ml注射器+33G针头组合，将50 µl浓度50 mg/ml的FITC-dextran注入小鼠球后静脉窦，用以标记着染视网膜血管。注射后松开小鼠，静置5 min后以颈椎脱臼法处死并取出双眼眼球。将眼球完全浸泡于4%多聚甲醛中，40 min后取出放入PBS中，4 ℃过夜。次日，使用显微剪沿角膜缘环形剪开眼球，剥除角膜获得完整碗状视网膜，RGC层向上放置，使用显微剪自赤道部往视神经处人字型剪开，完全铺平视网膜。
采用实时定量PCR检测各组小鼠视网膜中Nrf2和HO-1的mRNA相对表达量。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠颈椎脱臼法处死。摘取眼球放入离心管中将组织剪碎，加入1 ml、4 ℃预冷的Trizol，提取总RNA，超微量分光光度计测量波长260、280 nm处吸光度［A，旧称光密度（OD）］比值（A260/A280）。以比值介于1.8～2.0之间视为良好，可用于后续逆转录反应。按照逆转录试剂盒操作说明逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系：1 µg RNA，1 µl 多聚胸腺嘧啶（T重复寡核酸），无酶水补充至总体性12 µl，65 ℃ 5 min；继续添加4 µl 5倍反应缓冲液，1 µl核糖核酸酶抑制剂，1 µl 逆转录，2 µl 脱氧核糖核苷三磷酸，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min。在NCBI数据库中设计目的基因和内参基因的引物序列（表1），由金唯智生物科技有限公司合成引物。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，重复35个循环；37 ℃ 5 min。目的基因扩增产物的相对表达量应用2−ΔΔCT进行计算。
表1
目的基因引物序列
采用Western blot检测各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相对表达量。小鼠17日龄时，各组选取8只小鼠颈椎脱臼法处死。取视网膜放置于含有100 μl组织裂解液的1.5 ml离心管中，提取总蛋白，调整蛋白浓度。配制10%分离胶聚丙烯酰胺凝胶，以每组40 μg的总蛋白量进行上样，SDS-PAGE分离蛋白复合物，电泳结束后利用半干转膜法将蛋白条带转印至聚偏氟乙烯膜后，依次历经5%脱脂奶粉室温封闭1 h，抗Nrf2抗体、抗HO-1抗体、抗PSF抗体一抗室温孵育2 h，PBS洗膜10 min，重复3次；加入HRP偶联的二抗室温孵育1 h，PBS洗膜10 min，重复3次。最后加入化学发光法曝光底物，进行曝光并拍照，以检测靶蛋白表达。采用ImageJ图像分析软件进行灰度分析，以GAPDH作为内参照进行校正，计算目的蛋白的相对表达量。目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
1.3 统计学分析
采用SPSS18.0统计软件行统计学分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
光学显微镜观察发现，正常对照组小鼠视网膜未见突破内界膜的血管内皮细胞核；单纯OIR模型组与Vec组小鼠视网膜中可见较多突破内界膜的血管内皮细胞核；PSF组小鼠视网膜中可见少量突破内界膜的血管内皮细胞核（图1）。正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为0.00、14.36±5.50、15.67±4.96、8.13±2.09个。4组间小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数比较，差异有统计学意义（F=24.87，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较正常对照组明显增多，PSF组小鼠突破内界膜的血管内皮细胞核数较单纯OIR模型组、Vec组明显减少，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图1
各组小鼠视网膜HE染色光学显微镜像。1A示正常对照组；1B示单纯OIR模型组；1C示Vec组；1D示PSF组。正常对照组小鼠视网膜未见突破内界膜的血管内皮细胞核；单纯OIR模型组与Vec组小鼠视网膜中可见较多突破内界膜的血管内皮细胞核；PSF组小鼠视网膜中可见少量突破内界膜的血管内皮细胞核 HE ×10
正常对照组小鼠视网膜血管呈亮绿色荧光着染，未见无灌注区；单纯OIR模型组及Vec组小鼠视网膜可见大量无灌注区且周边交界处清晰可见；PSF组小鼠视网膜可见少量未相连的无灌注区（图2）。正常对照组、单纯OIR模型组、Vec组、PSF组小鼠视网膜无灌注区面积分别为0.00%、（35.71±2.81）%、（36.57±4.53）%、（15.33±4.75）%。4组间小鼠视网膜无灌注区面积比较，差异有统计学意义（F=165.70，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜无灌注区面积较正常对照组明显增大，PSF组小鼠视网膜无灌注区面积较单纯OIR模型组、Vec组明显减小，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图2
各组小鼠视网膜铺片荧光显微镜像。2A示正常对照组；2B示单纯OIR模型组；2C示Vec组；2D示PSF组。正常对照组视网膜未见无灌注区，单纯OIR模型组及Vec组小鼠视网膜可见大量无灌注区（红色圈选区）；PSF组小鼠视网膜可见少量未相连的无灌注区（红色圈选区） FITC-dextran ×10
实时定量PCR检测结果显示，4组间小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量比较，差异有统计学意义（F=53.66、83.54，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量较正常对照组明显降低，PSF组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。
图3
各组小鼠视网膜中Nrf2、PSF mRNA相对表达量比较。*P＜0.05
Western blot检测结果显示，4组间小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（F=58.38、52.69、24.79，P＜0.05）。组间两两比较，单纯OIR模型组、Vec组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较正常对照组明显降低，PSF组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF蛋白相对表达量较单纯OIR模型组、Vec组明显增加，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图4）。
图4
各组小鼠视网膜中Nrf2、HO-1、PSF的蛋白相对表达量比较。*P＜0.05
3 讨论
研究发现，氧化应激在眼部病变中发挥重要作用[1,8-9]，氧化应激是指当体内抗氧化防御体系如超氧化物歧化酶、HO-1、过氧化氢酶等低于正常水平，导致ROS的产生与清除之间的稳态失衡，进而造成组织损伤的病理状态[10-12]。在氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体，活化下游信号，导致内皮细胞的增生和迁移以及新生血管的形成[13-14]。不仅如此，诸多导致新生血管的因素如高氧、缺血再灌注和炎症等均可引起体内产生过多的ROS[15-17]。换言之，由抗氧化治疗入手很可能为抑制病理性新生血管的形成提供一种新的思路。
PSF是参与多种不同的生物学反应的多功能蛋白，包括DNA损伤修复、pre-mRNA的剪接加工以及基因的转录调控[18-19]。研究表明，IL-4刺激后，PSF可与信号转导子和转录激活子6（STAT6）结合形成复合物，进而抑制IL-4/STAT6信号通路的转录激活[20]。并且，PSF通过调节细胞因子信号抑制物3的表达间接参与视神经再生的调控，这一发现对视神经损伤性疾病有重要的学术意义和潜在的应用价值[21]。
本课题组前期研究发现，PSF蛋白可以抑制OIR小鼠视网膜新生血管的形成，下调VEGF表达，从而抑制新生血管增生[22]。而将PSF引入RPE细胞体外氧化应激模型中，PSF蛋白可以抑制ROS堆积，维持RPE细胞的稳态平衡。考虑到氧化应激情况下，ROS调控VEGF表达，活化VEGF受体及下游信号，导致内皮细胞增生和迁移以及新生血管形成[23]。据此我们推测，PSF蛋白有可能通过活化抗氧化体系来抑制新生血管形成。为明确这一推论，本研究观察分析了PSF对Nrf2及其下游基因HO-1的表达调控。Nrf2是参与调控抵抗氧化应激的主要核转录因子，当ROS等氧化应激因素存在时，Nrf2与抗氧化反应元件结合，诱导下游HO-1等多种抗氧化基因，从而发挥抗氧化应激保护细胞的作用[24]。
本研究结果显示，玻璃体腔内注射PSF会导致小鼠视网膜组织内PSF的高表达，进而导致Nrf2 的表达上调；HO-1作为Nrf2的下游因子，其在视网膜组织内的表达量会随之上调；HO-1作为ROS的负性调控因子，其表达上调会抑制视网膜组织内ROS生成，进而抑制HIF-1α表达。组织内HIF-1α表达减少，会导致VEGF以及VEGF受体表达下降，继而在根本上抑制血管生成。PSF可以上调Nrf2的表达及其下游基因HO-1的表达，提示抑制氧化应激反应是PSF蛋白发挥作用的重要分子机制之一。
本课题组前期研究发现，PSF可以抑制视网膜血管内皮细胞中细胞外信号调节激酶信号通路的活化，下调VEGF表达，进而抑制内皮细胞增生[25]。此外，对于体外培养的RPE细胞，PSF可通过调控磷酸酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路的活化程度来影响VEGF的表达[26]。本研究结果显示，PSF可上调HO-1的表达，抑制氧化应激反应。结合既往研究结果，我们认为，PSF与ROS诱导的VEGF表达之间可能存在某种关联，即缺氧导致ROS堆积，过多的ROS诱导HIF-1α的转录活化，进而激活其下游VEGF表达。在后续的研究中，我们将把PSF引入人视网膜血管内皮细胞的缺氧模型，分别从细胞增生、迁移和管腔形成等多个方面去收集PSF参与血管新生的全面信息，解读PSF对于视网膜新生血管调控的完整作用，从而为视网膜新生血管性疾病的基因治疗夯实理论基础。
