引用本文： 郭庆敏, 孟旭霞, 胡迭, 周贤慧, 余川. 缺氧诱导因子-2α在增生型糖尿病视网膜病变新生血管形成中的作用. 中华眼底病杂志, 2020, 36(2): 110-115. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.02.005 复制
缺氧诱导因子（HIF）是由氧敏感的α亚基和结构性稳定表达的β亚基组成的异源二聚体，主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三种亚型，其中参与调节细胞适应性缺氧的是HIF-1和HIF-2。生理情况下，当机体组织或细胞处于低氧环境时，HIF-1α、HIF-2α表达相应增加，介导细胞对缺氧的适应性反应，从而维持机体的内环境稳定[1-2]。既往研究发现，HIF-1α在增生型糖尿病视网膜病变（PDR）患者玻璃体及纤维血管膜中的表达显著增加[3-4]，并参与调控PDR新生血管的发生及发展过程[5-6]。然而，HIF-2α是否参与PDR新生血管的发生尚不清楚。因此，我们检测了一组PDR患眼纤维血管膜病理标本中HIF-2α、Delta样配体4（Dll4）、VEGF的表达，初步探讨HIF-2α在PDR新生血管形成中的作用。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经青岛大学附属医院伦理审查委员会审核（批准号：QYFYWZLL25645）；所有患者或其家属均获知情并签署书面知情同意书。
2014年7月至2015年7月于青岛大学附属医院眼科行玻璃体切割手术（PPV）的PDR患者57例60只眼纳入研究。其中，男性32例34只眼，女性25例26只眼。年龄36～73岁，平均年龄（54.93±6.42）岁。糖尿病病程8～20年，平均糖尿病病程（15.72±3.51）年。患者均符合2型糖尿病诊断标准[7]及PDR诊断标准[8]。排除肺部疾病、严重肝肾功能不全、心脑血管病变、恶性肿瘤及自身免疫性疾病者。
根据PPV前是否行玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗将患者分为PDR未注药组和PDR注药组，分别为30例32只眼、27例28只眼。PDR注药组患眼于PPV前2～7 d玻璃体腔注射10 mg/ml雷珠单抗0.05 ml（含雷珠单抗0.5 mg）治疗。选取同期特发性黄斑前膜患者18例18只眼作为对照组。其中，男性5例5只眼，女性13例13只眼，均无糖尿病及糖尿病家族史；无全身感染、急性炎症反应及缺血缺氧性疾病史以及全身系统性疾病。
所有患眼均行经睫状体平坦部标准23G PPV。手术中应用视网膜剪和镊获得PDR纤维血管膜病理标本及黄斑前膜病理标本。采用随机数字表法随机分配标本。其中，30只眼病理标本4%多聚甲醛溶液固定，常规酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，3 μm连续切片，行蛋白表达检测；48只眼病理标本置于已消毒的离心管中，－80 ℃超低温冰箱冻存，用于基因表达检测。行蛋白表达检测的30只眼病理标本中，PDR未注药组、PDR注药组、对照组分别为10、12、8只眼；行基因检测的48只眼病理标本中，PDR未注药组、PDR注药组、对照组分别为22、16、10只眼。3组患者性别构成比、年龄、糖尿病病程、PDR病程、体重指数（BMI）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1，2）。
表1
行蛋白表达检测三组患者基线资料比较
表2
行mRNA表达检测三组患者基线资料比较
采用免疫组织化学染色法检测各组病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达。每个病理标本选取截面最大处连续切片15张，各选取5张按照免疫组织化学试剂盒说明要求行HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白的免疫组织化学染色，DAB显色3 min，PBS代替一抗作为阴性对照。结果以细胞浆内出现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为弱阳性、阳性、强阳性。采用Image Pro Plus 6.0软件计算每张切片相应蛋白免疫组织化学染色阳性部分的平均吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，最后统计各组病理标本中各种蛋白的平均值，代表相应蛋白的表达量。
采用荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF的mRNA表达。每50～100 mg纤维血管膜或黄斑前膜加入1 ml RNAiso plus进行裂解；提取总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，A260/A280在1.7～2.1的样本用于实验。逆转录成cDNA，以GAPDH作为内参基因，采用双链嵌合荧光染色法扩增相应基因。引物序列：HIF-2α：正向引物 5’- TCATGCGACTGGCAATCAGC-3’，反向引物5’- GTCACCACGG CAATGAAACC-3’；Dll4：正向引物5’-CCCTGGCAATGTACTTGTGAT-3’，反向引物5’-TGGTGGGTGCAGTAGTTGAG-3；VEGF：正向引物5’- ATCGAGACCCTGGTGGACA-3’，反向引物5’- CCGCCTCGGCTTGTCACA-3’；GAPDH：正向引物5’-CACGATGGAGGG GCCGGACTCATC-3’，反向引物5’- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3’。退火温度60 ℃，40个循环后形成扩增曲线，记录Ct值，结果采用2-ΔΔCt公式进行分析。
采用SPSS19.0软件行统计学分析。所得数据经Kolmogoror-Smimor检验证实呈正态分布，以均数±标准差（
）表示。多组间相关因子表达差异比较采用Kruskal-Wallis检验。两变量间关系采用Spearman相关性分析。校验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达均呈阳性，且主要表达在新生血管内皮组织（图1）。PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（t=4.36、6.01、4.82，P=0.000、0.008、0.016）（图2）。
图1
PDR患眼纤维血管膜免疫组织化学染色像。1A示PDR未注药组，HIF-2α蛋白在新生血管内皮细胞中呈强阳性表达，纤维细胞和细胞外基质中几乎无表达（黑箭）DAB ×400；1B示PDR注药组，HIF-2α蛋白在血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×400；1C示PDR未注药组，Dll4蛋白在新生血管内皮细胞中呈阳性表达（黑箭）DAB ×200；1D示PDR注药组，Dll4蛋白在新生血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×200；1E示PDR未注药组，VEGF蛋白在新生血管内皮细胞中呈强阳性表达（黑箭）DAB ×200；1F示PDR注药组，VEGF蛋白在新生血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×200
图2
PDR注药组、PDR未注药组纤维血管膜中各检测因子的蛋白相对表达量比较。2A~2C分别示HIF-2α、Dll4、VEGF。*P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，PDR未注药组、PDR注药组、对照组患眼纤维血管膜、黄斑前膜中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（H=18.81、19.60、20.50，P=0.000、0.000、0.000）（图3）。其中，PDR未注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量最高，对照组患眼黄斑前膜中相对表达量最低。对照组与PDR注药组、PDR注药组与PDR未注药组、对照组与PDR未注药组患眼病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图3
PDR未注药组、PDR注药组、对照组病理标本中各检测因子的mRNA相对表达量比较。3A~3C分别示HIF-2α、Dll4、VEGF。 *P＜0.05
Spearman相关分析结果显示，HIF-2α与Dll4、VEGF mRNA的表达均呈正相关（r=0.95、0.87，P＜0.05）（图4）。
图4
HIF-2α mRNA表达与Dll4、VEGF mRNA表达相关性散点图。4A示Dll4；4B示VEGF
3 讨论
HIF作为主要调节细胞适应缺氧环境的转录因子，主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三种亚型。其中，HIF-1α与HIF-2α含有48%的同源氨基酸序列，然而两者的差异正被越来越广泛而深入地认知。研究发现，HIF-1α与HIF-2α调控病理性血管生成的机制存在差异[9]。在急性缺氧环境中，HIF-1α被激活且稳定表达，而随着缺氧时间延长，HIF-1α的表达逐渐降低直至消失，而HIF-2α的含量持续增加，诱导新生血管形成，且激活和上调VEGF的表达[10-11]。HIF-2α在缺氧环境中和持续性低氧条件下对血管新生发挥关键作用[12]。
PDR是以缺氧导致视网膜前新生血管形成为最主要病理改变的眼底病变。由于视网膜微血管细胞受到损害，导致局部微血管闭塞及无灌注区形成，继而引起组织缺血、缺氧，并最终引发新生血管生成。研究发现，HIF-2α主要在视网膜Müller细胞神经角质层对视网膜新生血管性疾病发挥直接调节作用，而通过调节星形细胞前体中HIF-2α的浓度则可控制视网膜新生血管的分化[13-14]。HIF-2α在缺氧环境中对新生血管的增生、迁移、成熟及代谢等均发挥重要调节作用[15]。本研究结果显示，PDR未注药组、PDR注药组纤维血管膜中HIF-2α的表达量显著高于对照组；PDR注药组纤维血管膜中HIF-2α的表达量低于未注药组。我们分析其原因，对照组黄斑前膜组织并未有缺氧环境的形成，而机体在常氧状态下，HIF会不断表达和降解，维持在较低水平[16]；而在PDR注药组，由于玻璃体腔注射抗VEGF药物，导致部分视网膜新生血管衰退萎缩，眼底缺氧环境得到改善，HIF-2α的表达亦相应减少。另外，本研究还发现Dll4表达与HIF-2α呈显著正相关，且在PDR未注药组病理标本中表达显著高于PDR注药组及对照组。缺氧被认为是Notch信号通路的始动环节[17]。相关研究结果显示，HIF-2α可通过特异性上调Notch配体Dll4而促进血管功能成熟，当特异性敲除HIF-2α基因后，Dll4的表达明显被抑制，导致大量无功能血管生成[18]。本研究结果与上述理论相吻合。
VEGF-VEGF受体信号被认为是调控血管发育的最主要信号，VEGF是刺激血管新生的主要细胞因子之一，是HIF最主要的靶基因。越来越多的研究发现，相对于HIF-1α，HIF-2α更易于与VEGF的启动子结合，调控VEGF mRNA的表达，而当特异性敲除HIF-2α后，VEGF浓度随之降低[19]。Wei等[20]在神经母细胞瘤研究中发现，VEGF mRNA的表达紧随HIF-2A（编码HIF-2α）基因表达，进一步说明VEGF的表达主要由HIF-2α调控。本研究结果显示，VEGF与HIF-2α的表达呈显著正相关，且PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中VEGF表达量较对照组显著升高。其原因可能与对照组黄斑前膜组织并未有新生血管的出芽和形成有关，因此亦未有VEGF信号通路的过度激活。PDR未注药组患眼纤维血管膜中VEGF表达量较PDR注药组升高。其原因，一方面缘于玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗；另一方面眼底新生血管减少，缺氧环境得到改善，HIF-2α的表达降低，对VEGF表达的调控作用亦随之减弱。此外，免疫组织化学染色显示，HIF-2α主要表达于新生血管内皮组织，与Dll4、VEGF的表达部位大体一致，进一步说明HIF-2α可能与Dll4及VEGF发挥协同作用，促进新生血管的发育和成熟。
本研究结果显示，HIF-2α可通过对Notch信号通路及VEGF信号通路相关因子的调控，在PDR新生血管的发生中发挥一定作用。PDR致盲率高，预后差，发病机制复杂，探讨HIF-2α在PDR发病过程中的表达，有助于为PDR的临床防治提供新的思路和靶点。
缺氧诱导因子（HIF）是由氧敏感的α亚基和结构性稳定表达的β亚基组成的异源二聚体，主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三种亚型，其中参与调节细胞适应性缺氧的是HIF-1和HIF-2。生理情况下，当机体组织或细胞处于低氧环境时，HIF-1α、HIF-2α表达相应增加，介导细胞对缺氧的适应性反应，从而维持机体的内环境稳定[1-2]。既往研究发现，HIF-1α在增生型糖尿病视网膜病变（PDR）患者玻璃体及纤维血管膜中的表达显著增加[3-4]，并参与调控PDR新生血管的发生及发展过程[5-6]。然而，HIF-2α是否参与PDR新生血管的发生尚不清楚。因此，我们检测了一组PDR患眼纤维血管膜病理标本中HIF-2α、Delta样配体4（Dll4）、VEGF的表达，初步探讨HIF-2α在PDR新生血管形成中的作用。现将结果报道如下。
1 对象和方法
回顾性临床研究。本研究经青岛大学附属医院伦理审查委员会审核（批准号：QYFYWZLL25645）；所有患者或其家属均获知情并签署书面知情同意书。
2014年7月至2015年7月于青岛大学附属医院眼科行玻璃体切割手术（PPV）的PDR患者57例60只眼纳入研究。其中，男性32例34只眼，女性25例26只眼。年龄36～73岁，平均年龄（54.93±6.42）岁。糖尿病病程8～20年，平均糖尿病病程（15.72±3.51）年。患者均符合2型糖尿病诊断标准[7]及PDR诊断标准[8]。排除肺部疾病、严重肝肾功能不全、心脑血管病变、恶性肿瘤及自身免疫性疾病者。
根据PPV前是否行玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗将患者分为PDR未注药组和PDR注药组，分别为30例32只眼、27例28只眼。PDR注药组患眼于PPV前2～7 d玻璃体腔注射10 mg/ml雷珠单抗0.05 ml（含雷珠单抗0.5 mg）治疗。选取同期特发性黄斑前膜患者18例18只眼作为对照组。其中，男性5例5只眼，女性13例13只眼，均无糖尿病及糖尿病家族史；无全身感染、急性炎症反应及缺血缺氧性疾病史以及全身系统性疾病。
所有患眼均行经睫状体平坦部标准23G PPV。手术中应用视网膜剪和镊获得PDR纤维血管膜病理标本及黄斑前膜病理标本。采用随机数字表法随机分配标本。其中，30只眼病理标本4%多聚甲醛溶液固定，常规酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋，3 μm连续切片，行蛋白表达检测；48只眼病理标本置于已消毒的离心管中，－80 ℃超低温冰箱冻存，用于基因表达检测。行蛋白表达检测的30只眼病理标本中，PDR未注药组、PDR注药组、对照组分别为10、12、8只眼；行基因检测的48只眼病理标本中，PDR未注药组、PDR注药组、对照组分别为22、16、10只眼。3组患者性别构成比、年龄、糖尿病病程、PDR病程、体重指数（BMI）比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（表1，2）。
表1
行蛋白表达检测三组患者基线资料比较
表2
行mRNA表达检测三组患者基线资料比较
采用免疫组织化学染色法检测各组病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达。每个病理标本选取截面最大处连续切片15张，各选取5张按照免疫组织化学试剂盒说明要求行HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白的免疫组织化学染色，DAB显色3 min，PBS代替一抗作为阴性对照。结果以细胞浆内出现黄色、棕黄色或棕褐色颗粒为弱阳性、阳性、强阳性。采用Image Pro Plus 6.0软件计算每张切片相应蛋白免疫组织化学染色阳性部分的平均吸光度[A，旧称光密度（OD）]值，最后统计各组病理标本中各种蛋白的平均值，代表相应蛋白的表达量。
采用荧光定量PCR（RT-PCR）检测各组病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF的mRNA表达。每50～100 mg纤维血管膜或黄斑前膜加入1 ml RNAiso plus进行裂解；提取总RNA，紫外分光光度计检测其浓度和纯度，A260/A280在1.7～2.1的样本用于实验。逆转录成cDNA，以GAPDH作为内参基因，采用双链嵌合荧光染色法扩增相应基因。引物序列：HIF-2α：正向引物 5’- TCATGCGACTGGCAATCAGC-3’，反向引物5’- GTCACCACGG CAATGAAACC-3’；Dll4：正向引物5’-CCCTGGCAATGTACTTGTGAT-3’，反向引物5’-TGGTGGGTGCAGTAGTTGAG-3；VEGF：正向引物5’- ATCGAGACCCTGGTGGACA-3’，反向引物5’- CCGCCTCGGCTTGTCACA-3’；GAPDH：正向引物5’-CACGATGGAGGG GCCGGACTCATC-3’，反向引物5’- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3’。退火温度60 ℃，40个循环后形成扩增曲线，记录Ct值，结果采用2-ΔΔCt公式进行分析。
采用SPSS19.0软件行统计学分析。所得数据经Kolmogoror-Smimor检验证实呈正态分布，以均数±标准差（）表示。多组间相关因子表达差异比较采用Kruskal-Wallis检验。两变量间关系采用Spearman相关性分析。校验水准α=0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
免疫组织化学染色结果显示，PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达均呈阳性，且主要表达在新生血管内皮组织（图1）。PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF蛋白表达量比较，差异均有统计学意义（t=4.36、6.01、4.82，P=0.000、0.008、0.016）（图2）。
图1
PDR患眼纤维血管膜免疫组织化学染色像。1A示PDR未注药组，HIF-2α蛋白在新生血管内皮细胞中呈强阳性表达，纤维细胞和细胞外基质中几乎无表达（黑箭）DAB ×400；1B示PDR注药组，HIF-2α蛋白在血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×400；1C示PDR未注药组，Dll4蛋白在新生血管内皮细胞中呈阳性表达（黑箭）DAB ×200；1D示PDR注药组，Dll4蛋白在新生血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×200；1E示PDR未注药组，VEGF蛋白在新生血管内皮细胞中呈强阳性表达（黑箭）DAB ×200；1F示PDR注药组，VEGF蛋白在新生血管内皮细胞中呈弱阳性表达（黑箭）DAB ×200
图2
PDR注药组、PDR未注药组纤维血管膜中各检测因子的蛋白相对表达量比较。2A~2C分别示HIF-2α、Dll4、VEGF。*P＜0.05
RT-PCR检测结果显示，PDR未注药组、PDR注药组、对照组患眼纤维血管膜、黄斑前膜中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（H=18.81、19.60、20.50，P=0.000、0.000、0.000）（图3）。其中，PDR未注药组患眼纤维血管膜中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量最高，对照组患眼黄斑前膜中相对表达量最低。对照组与PDR注药组、PDR注药组与PDR未注药组、对照组与PDR未注药组患眼病理标本中HIF-2α、Dll4、VEGF mRNA相对表达量比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
图3
PDR未注药组、PDR注药组、对照组病理标本中各检测因子的mRNA相对表达量比较。3A~3C分别示HIF-2α、Dll4、VEGF。 *P＜0.05
Spearman相关分析结果显示，HIF-2α与Dll4、VEGF mRNA的表达均呈正相关（r=0.95、0.87，P＜0.05）（图4）。
图4
HIF-2α mRNA表达与Dll4、VEGF mRNA表达相关性散点图。4A示Dll4；4B示VEGF
3 讨论
HIF作为主要调节细胞适应缺氧环境的转录因子，主要有HIF-1、HIF-2、HIF-3三种亚型。其中，HIF-1α与HIF-2α含有48%的同源氨基酸序列，然而两者的差异正被越来越广泛而深入地认知。研究发现，HIF-1α与HIF-2α调控病理性血管生成的机制存在差异[9]。在急性缺氧环境中，HIF-1α被激活且稳定表达，而随着缺氧时间延长，HIF-1α的表达逐渐降低直至消失，而HIF-2α的含量持续增加，诱导新生血管形成，且激活和上调VEGF的表达[10-11]。HIF-2α在缺氧环境中和持续性低氧条件下对血管新生发挥关键作用[12]。
PDR是以缺氧导致视网膜前新生血管形成为最主要病理改变的眼底病变。由于视网膜微血管细胞受到损害，导致局部微血管闭塞及无灌注区形成，继而引起组织缺血、缺氧，并最终引发新生血管生成。研究发现，HIF-2α主要在视网膜Müller细胞神经角质层对视网膜新生血管性疾病发挥直接调节作用，而通过调节星形细胞前体中HIF-2α的浓度则可控制视网膜新生血管的分化[13-14]。HIF-2α在缺氧环境中对新生血管的增生、迁移、成熟及代谢等均发挥重要调节作用[15]。本研究结果显示，PDR未注药组、PDR注药组纤维血管膜中HIF-2α的表达量显著高于对照组；PDR注药组纤维血管膜中HIF-2α的表达量低于未注药组。我们分析其原因，对照组黄斑前膜组织并未有缺氧环境的形成，而机体在常氧状态下，HIF会不断表达和降解，维持在较低水平[16]；而在PDR注药组，由于玻璃体腔注射抗VEGF药物，导致部分视网膜新生血管衰退萎缩，眼底缺氧环境得到改善，HIF-2α的表达亦相应减少。另外，本研究还发现Dll4表达与HIF-2α呈显著正相关，且在PDR未注药组病理标本中表达显著高于PDR注药组及对照组。缺氧被认为是Notch信号通路的始动环节[17]。相关研究结果显示，HIF-2α可通过特异性上调Notch配体Dll4而促进血管功能成熟，当特异性敲除HIF-2α基因后，Dll4的表达明显被抑制，导致大量无功能血管生成[18]。本研究结果与上述理论相吻合。
VEGF-VEGF受体信号被认为是调控血管发育的最主要信号，VEGF是刺激血管新生的主要细胞因子之一，是HIF最主要的靶基因。越来越多的研究发现，相对于HIF-1α，HIF-2α更易于与VEGF的启动子结合，调控VEGF mRNA的表达，而当特异性敲除HIF-2α后，VEGF浓度随之降低[19]。Wei等[20]在神经母细胞瘤研究中发现，VEGF mRNA的表达紧随HIF-2A（编码HIF-2α）基因表达，进一步说明VEGF的表达主要由HIF-2α调控。本研究结果显示，VEGF与HIF-2α的表达呈显著正相关，且PDR未注药组、PDR注药组患眼纤维血管膜中VEGF表达量较对照组显著升高。其原因可能与对照组黄斑前膜组织并未有新生血管的出芽和形成有关，因此亦未有VEGF信号通路的过度激活。PDR未注药组患眼纤维血管膜中VEGF表达量较PDR注药组升高。其原因，一方面缘于玻璃体腔注射抗VEGF药物治疗；另一方面眼底新生血管减少，缺氧环境得到改善，HIF-2α的表达降低，对VEGF表达的调控作用亦随之减弱。此外，免疫组织化学染色显示，HIF-2α主要表达于新生血管内皮组织，与Dll4、VEGF的表达部位大体一致，进一步说明HIF-2α可能与Dll4及VEGF发挥协同作用，促进新生血管的发育和成熟。
本研究结果显示，HIF-2α可通过对Notch信号通路及VEGF信号通路相关因子的调控，在PDR新生血管的发生中发挥一定作用。PDR致盲率高，预后差，发病机制复杂，探讨HIF-2α在PDR发病过程中的表达，有助于为PDR的临床防治提供新的思路和靶点。
