引用本文： 徐嫚鸿, 王林妮, 林婷婷, 任新军, 柯屹峰, 胡立颖, 焦明菲, 王勇, 王琼, 洪雅茹, 李筱荣, 东莉洁. 多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子对缺氧诱导人视网膜微血管内皮细胞功能的影响. 中华眼底病杂志, 2020, 36(2): 135-142. doi: 10.3760/cma.j.issn.1005-1015.2020.02.010 复制
生理条件下，眼内的促血管生成分子和抑制血管生成分子之间存在着动态平衡，但在病理情况下由于缺氧、局部缺血和炎症会影响包括VEGF和色素上皮衍生因子在内的许多生长因子表达，从而导致视网膜新生血管（RNV）产生[1]。尽管激光光凝治疗和抗VEGF药物治疗在临床上取得一定的治疗效果，但由于对RNV的确切机制尚未研究透彻，临床上仍缺乏RNV的特异性和高效的治疗措施，因此挖掘抑制RNV形成的调控因子并深入探究其作用机制具有重要的临床意义[2-5]。多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）是参与多种基因调节过程的核酸结合蛋白[6]。我们的前期研究发现，重组腺相关病毒PSF可以下调氧诱导视网膜病变（OIR）模型鼠视网膜VEGF的表达水平，提示PSF对缺氧状态下RNV形成和人视网膜微血管内皮细胞（hRMECs）存在潜在的调控作用[7]。为深入探讨PSF的作用，本研究构建可稳定表达PSF的重组慢病毒（LV-PSF），一方面通过体内实验验证PSF对OIR模型鼠RNV的抑制作用；另一方面将LV-PSF引入缺氧状态下细胞实验体系中，旨在探究PSF对缺氧诱导hRMECs增生和迁移等功能的影响并挖掘PSF的作用机制，从而为以RNV为病理特征的眼部疾病治疗提供潜在靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
人肾上皮细胞系（293T）细胞株由天津医科大学眼科研究所张晓敏主任惠赠。hRMECs购自北京北纳科技有限公司。LV-PSF和空载慢病毒（LV-Vec）由本实验室自行构建。10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（P/S）、1倍DMEM培养基（美国Gibco公司），缺氧诱导装置（美国Billups-Rothenberg公司），Lipofectamine 2000转染试剂、cDNA逆转录试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、恒温培养箱，超净工作台（美国Thermo Fisher公司），去内毒素质粒大量提取试剂盒、封闭山羊血清、5%BSA封闭液、抗荧光衰减封片剂、MTT、1倍PBS、Triton X-100、4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司），Trizol试剂、Isolectin GS-IB4、Alexa Fluor™ 488 Conjugate（美国Invitrogen公司）。胰酶消化液（江苏碧云天生物技术研究所），细胞培养板（美国Costar公司），移液器、Tip头（德国Eppendorf公司），EP管、离心管（上海生物工程技术有限公司）。7900HT实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），荧光显微镜（日本Olympus公司），TDL-40B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DK-600A型电热恒温水浴箱（上海一恒科学仪器有限公司），细胞计数板（北京六一实验仪器厂）。
1.2 细胞培养、重组慢病毒包装及病毒滴度测定
正常细胞培养：293T细胞和hRMECs均使用含有10% FBS、P/S的DMEM培养基，置于37 ℃、95%空气、5% CO2的密闭恒温培养箱中进行培养。缺氧刺激细胞：将处于对数生长期的细胞或病毒感染后的细胞置于缺氧诱导装置中，向装置中充氮气直至氧气浓度达到2%，将缺氧诱导装置置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
质粒提取及测定：在NCBI基因数据库中查询获取人类PSF的核酸序列，基因序列号为NM_005066.2，由本实验室自行设计并合成重组质粒及大肠杆菌菌液。按照去内毒素质粒大量提取试剂盒说明书步骤提取质粒，通过酶切法和测序法鉴定目的质粒。重组慢病毒包装及浓缩：将293T细胞以2×107个/ml的密度复苏在75 cm塑料培养瓶中，待其生长到80%～90%融合度时进行传代，传至3～4代且融合度为60%以上时用于病毒包装。将目的质粒（pCDH-CMV-PSF-EF1-copGFP）和空载质粒（pEGFP-Vec）分别与穿梭质粒（pCMV-VSV-G）及包装质粒（psPAX2）以4:1:3的质量比构成三质粒系统，并和Lipofectamine 2000转染试剂（5～6 μl/ml）混合，室温孵育30 min。弃去细胞培养瓶中的培养液，加入孵育好的混合物后培养30 min，再加入等量完全培养液培养4～6 h后更换一次培养液。感染后24～48 h可观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，48～72 h可以收集病毒。将培养瓶中的上清液转移至50 ml离心管中，以离心半径15 cm、1500 r/min在4 ℃条件下离心10 min，再经0.45 μm过滤器过滤。将上清液、浓缩液按8:3的比例向过滤后的上清液中添加浓缩液，以4500×g在4 ℃条件下离心15 min，小心弃去液体，用完全培养液重悬病毒颗粒，分装冻存于−80 ℃冰箱或直接使用。采用批量快速测定法测定病毒滴度，后续实验中按照测定的病毒滴度计算体内实验和体外实验的作用浓度。
1.3 重组慢病毒感染hRMECs、流式细胞仪测定感染效率及实时荧光定量PCR（RT-PCR）测量hRMECs中PSF mRNA表达
将hRMECs以5×105个/ml的密度接种于12孔板，并将其分为正常组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs；空载组为经LV-Vec感染的hRMECs；PSF高表达组为经LV-PSF感染的hRMECs。当细胞融合度达50%左右时，正常组继续培养，空载组和PSF组细胞弃去培养基，加入6 μg/ml聚凝胺孵育30 min后弃上清液，分别加入LV-Vec和LV- PSF感染，并于6 h后换完全培养液，48 h后于荧光显微镜下观察GFP的表达情况。
正常组、空载组和PSF高表达组细胞按分组处理后，消化离心并弃去上清液，分别用500 μl PBS重悬成单细胞悬液加入到流式管中上机检测。LV-Vec和LV-PSF表达GFP，可在波长为488 nm的蓝光雷射激发下发出绿色荧光，选用FL-1通道检测荧光信号。先检测正常组样品，调节电压使细胞群处于阴性区，再检测空载组和PSF高表达组，调节补偿使阳性群细胞处于合适位置。每组样品设置3个副孔，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复进行3次，检测结果通过Flowjo 7.6软件进行分析。
正常组、空载组和PSF高表达组细胞按分组处理后，按Trizol Reagent说明书提取总RNA，反转录合成cDNA模板，行RT-PCR。引物序列由本实验室设计，由苏州金唯智公司合成（表1）。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。目的基因扩增产物的相对含量用2-ΔΔCt计算。
表1
RT-PCR引物序列
1.4 PSF对OIR模型小鼠RNV的作用
7日龄健康C57B/L6小鼠20只，雌雄不限，体重（3.52±0.35）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。采用随机数字表法将小鼠分为正常组、OIR组、OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组，每组5只。后3组小鼠置于氧气浓度为（75±5）%的饲养箱中，温度维持在（23±2）℃。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠于12日龄时，经复方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉后，手术显微镜下各组玻璃体腔分别注射1 μl LV-Vec和LV-PSF，注射完毕后给予左氧氟沙星滴眼液点眼。OIR组小鼠不做玻璃体腔注射，于12日龄时置于正常室内空气中饲养。小鼠15日龄时，再次对OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠进行玻璃体腔注射重组慢病毒处理。正常组小鼠始终置于正常空气环境中饲养，未做任何处理。
小鼠17日龄时，各组小鼠腹腔注射过量10%水合氯醛处死，立即摘取右眼眼球在4%多聚甲醛中室温固定15 min，更换PBS冰上处理10 min。手术显微镜下剥离完整的视网膜，用100%甲醇固定15 min后，采用通透缓冲液（PBS缓冲液、1% BSA封闭液、0.5% Triton X-100及5%封闭山羊血清）处理视网膜2 h后用Alexa-488标记的Isolectin GS-IB4在4 ℃条件下孵育过夜。用PBS洗3遍后，将视网膜以RGC层向上平铺于载玻片上，并滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用相同的光学参数拍照。
1.5 PSF对缺氧诱导hRMECs增生和迁移功能的影响
将hRMECs分为正常组（正常培养的hRMECs）、缺氧组（缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs）、空载组（用LV-Vec感染hRMECs 48 h，再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h）和PSF高表达组（用LV-PSF感染hRMECs 48 h，再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h）。缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h这一条件根据预实验结果获得。各组细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板，在分别进行各组刺激后，加入MTT孵育4 h后弃去培养上清液，加入150 μl DMSO，室温静置15 min后通过酶联免疫检测仪在490 nm波长处读取吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。每组设置3个副孔，实验重复进行3次。
将hRMECs以5×105个/ml的密度接种于12孔板，培养过夜后按正常组、缺氧组、空载组和PSF过表达组进行相应处理。除正常组之外，其余3组均进行缺氧培养3 h，进行划痕处理并将此时计作0 h，继续培养48 h。分别在培养24、48 h时，于4倍光学显微镜下随机选取3个视野测量划痕无细胞部分的面积，分别计算出24、48 h细胞迁移率。细胞迁移率=（最初划痕面积−检测时无细胞部分的面积）/最初划痕面积。
hRMECs分为正常组、空载组和PSF过表达组，后两组细胞在病毒感染后分别缺氧刺激3 h并恢复正常条件培养24 h。将3组细胞消化后以1.5×105个的密度接种于Transwell小室上室内，无血清培养基培养；下室加入100% FBS，培养10 h后吸出小室和24孔板内液体，用棉签将小室上表面细胞轻轻擦掉，4%多聚甲醛固定Transwell小室下表面细胞15 min后PBS洗3次，经常规HE染色。将小室晾干，用无菌尖刀片将小室表面切下，进行中性树胶封片。每组设置3个复孔，本实验共重复3次。
1.6 统计学分析
采用SPSS18.0统计软件行统计学分析。多样本计量资料均数比较采用方差齐性检验，方差齐时采用方差分析，总体均数有差异时采用两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LV-PSF鉴定
荧光显微镜观察发现，三质粒系统共同转染293T细胞48 h后可见GFP表达（图1A）；在LV-PSF感染hRMECs 48 h后也可观察到GFP表达（图1B）。流式细胞仪计数测得LV-PSF感染效率为97%（图1C）。RT-PCT测定结果显示，感染后48 h，PSF高表达组hRMECs中PSF mRNA表达较正常组、空载组明显增多，差异有统计学意义（t=32.85、30.60，P＜0.05）（图1D）。
图1
LV-PSF鉴定结果图。1A示三质粒系统转染293T细胞48 h后荧光显微镜像，可见293T细胞绿色荧光着染；1B示LV-PSF感染hRMECs 48 h后荧光显微镜像，可见hRMECs呈均匀绿色荧光着染；1C示流式细胞仪分析图，LV-PSF感染效率为97%；1D示正常组、空载组、PSF高表达组hRMECs中PSF mRNA表达比较，*P＜0.05。1A、1B标尺：100 μm
2.2 LV-PSF可显著抑制OIR小鼠模型RNV形成
荧光显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜血管呈绿色荧光着染，未见异常视网膜血管；OIR组及OIR+LV-Vec组小鼠视网膜可见明显的、位于视网膜中央的无灌注区以及位于无灌注区和血管分布区交界处的病理性新生血管簇；OIR+LV-PSF组小鼠视网膜可见少量分散分布的病理性新生血管簇（图2）。正常组、OIR组、OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积/视网膜面积比较，差异有统计学意义（F=204.90，P＜0.05）。组间两两比较，OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加（t=18.31、43.71），OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组、OIR+LV-Vec组明显减小（t=11.30、15.47），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。
图2
小鼠视网膜铺片荧光显微镜像。2A示正常组；2B示OIR组；2C示OIR+LV-Vec组；2D示OIR+LV-PSF组。OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV簇较正常组明显增加，OIR+LV-PSF组小鼠RNV簇较OIR组、OIR+LV-Vec组明显减少 标尺：500 μm
图3
各组小鼠RNV面积/视网膜面积的比值比较。*P＜0.05
2.3 PSF可抑制缺氧刺激后hRMECs的增生、迁移能力
MTT比色法检测结果显示，缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显升高（t=2.57），PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组和空载组明显降低（t=5.26、5.46、3.73），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图4）。
图4
各组细胞增生能力比较。*P＜0.05
细胞划痕实验结果显示，缺氧组与空载组细胞在缺氧刺激后明显迁移，而PSF高表达组细胞在缺氧刺激后迁移不明显（图5）。定量分析结果显示，缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激hRMECs迁移（t=8.35、13.84，P＜0.05）。PSF高表达组hRMECs迁移率相对正常组、缺氧组和空载组明显降低，差异有统计学意义（t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01，P＜0.05）（图6）。
图5
细胞划痕实验光学显微镜像。6A~6D示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组0 h；6E~6H示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组24 h；6I~6L示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组48 h。缺氧组与空载组细胞在缺氧刺激后明显迁移，而PSF高表达组细胞在缺氧刺激后迁移不明显 ×20
图6
各组细胞横向迁移率比较。*P＜0.05
Transwell小室实验结果显示，正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多，而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少（图7A～7C）。PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数较正常组、空载组明显减少，差异有统计学意义（t=9.334、6.149，P＜0.05）（图7D）。
图7
Transwell细胞迁移实验光学显微镜像及各组细胞纵向迁移率比较图。7A~7C分别示正常组、空载组、PSF高表达组光学显微镜像，正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多，而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少 ×10；7D示各组细胞纵向迁移率比较，*P＜0.05
2.4 PSF通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制hRMECs功能
RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（t=15.23、21.09，P<0.05）；PSF mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义（t=0.12、2.15，P>0.05）。与缺氧组、空载组比较，PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降（t=10.18、13.10），PSF mRNA表达明显增加（t=65.00、85.79），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图8）。
图8
各组细胞HIF-1α、VEGF、PSF mRNA表达比较。8A示HIF-1α；8B示VEGF；8C示PSF。*P＜0.05
3 讨论
我们的前期体外实验结果显示，高表达的PSF可以活化磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路，下调VEGF的表达[8]；体内实验结果显示，玻璃体腔注射PSF可有效下调小鼠视网膜组织中VEGF表达水平[9]。通过这些研究成果不难发现PSF的作用方式是多途径、多层面的，涉及的细胞类型也不局限于血管内皮细胞。基因治疗是一种基于外源性引入遗传物质以改变细胞基因表达情况从而达到治疗疾病目的的新措施，可以将外源性具有较强治疗作用的基因片段导入眼内，使其在眼内表达治疗基因产物，以达到持续而高效地治疗眼内疾病的目的。病毒载体现已成为基因治疗载体的研究热点[10-12]。本研究选择的慢病毒载体，具有基因整合功能，病毒基因组整合于目的细胞后可以长时间、稳定地表达目的基因，感染细胞类型包括分裂细胞和不分裂细胞，并且适用于感染难度较大的细胞[13]。在此基础之上进一步选择OIR模型来进行体内实验，观察PSF对缺氧诱导的RNV的影响，并通过在体外试验中采用更为贴近人体的hRMECs作为缺氧模型的细胞，以期收集更为全面的生物学信息，解读PSF在RNV中的作用。
本研究首先通过MTT比色法预实验选择缺氧刺激hRMECs增生的最佳条件，结果表明在2%氧浓度作用3 h恢复正常培养条件24 h能显著诱导hRMECs增生；高表达hRMECs中PSF水平则可明显抑制细胞的增生能力。其次，我们还研究了PSF对hRMECs迁移能力的影响，一方面依据细胞划痕实验可以观察细胞横向迁移使划痕愈合的能力；另一方面Transwell细胞迁移实验通过观察细胞能否纵向穿过Transwell小室基底膜上的微孔进入下室，从而评价细胞的纵向迁移能力。通过这两种方式，可以更为全面立体地模拟体内视网膜血管内皮细胞的迁移过程。细胞划痕实验结果表明，缺氧可刺激缺氧组和空载组hRMECs水平迁移能力，但PSF组hRMECs的迁移程度却受到抑制。Transwell细胞迁移实验结果显示，相对于正常组和空载组，PSF过表达可以抑制hRMECs的垂直迁移能力。这两项实验结果证明，PSF可以抑制缺氧刺激hRMECs的横向和纵向迁移能力，从而发挥抑制缺氧诱导细胞迁移的作用。我们还发现，体外缺氧诱导的hRMECs中HIF-1α和VEGF的转录水平均明显升高，但细胞中高水平的PSF则会明显抑制两者的表达。这提示在体外缺氧刺激的条件下，PSF通过负性调控HIF-1α/VEGF信号通路转录而发挥抑制hRMECs功能的作用。
本研究通过体内和体外实验较全面地揭示了PSF对RNV的作用，并阐述了其作用机制，为RNV性疾病的治疗提供了新的思路和方向。
生理条件下，眼内的促血管生成分子和抑制血管生成分子之间存在着动态平衡，但在病理情况下由于缺氧、局部缺血和炎症会影响包括VEGF和色素上皮衍生因子在内的许多生长因子表达，从而导致视网膜新生血管（RNV）产生[1]。尽管激光光凝治疗和抗VEGF药物治疗在临床上取得一定的治疗效果，但由于对RNV的确切机制尚未研究透彻，临床上仍缺乏RNV的特异性和高效的治疗措施，因此挖掘抑制RNV形成的调控因子并深入探究其作用机制具有重要的临床意义[2-5]。多聚嘧啶序列结合蛋白相关剪接因子（PSF）是参与多种基因调节过程的核酸结合蛋白[6]。我们的前期研究发现，重组腺相关病毒PSF可以下调氧诱导视网膜病变（OIR）模型鼠视网膜VEGF的表达水平，提示PSF对缺氧状态下RNV形成和人视网膜微血管内皮细胞（hRMECs）存在潜在的调控作用[7]。为深入探讨PSF的作用，本研究构建可稳定表达PSF的重组慢病毒（LV-PSF），一方面通过体内实验验证PSF对OIR模型鼠RNV的抑制作用；另一方面将LV-PSF引入缺氧状态下细胞实验体系中，旨在探究PSF对缺氧诱导hRMECs增生和迁移等功能的影响并挖掘PSF的作用机制，从而为以RNV为病理特征的眼部疾病治疗提供潜在靶点。现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要实验材料
人肾上皮细胞系（293T）细胞株由天津医科大学眼科研究所张晓敏主任惠赠。hRMECs购自北京北纳科技有限公司。LV-PSF和空载慢病毒（LV-Vec）由本实验室自行构建。10%胎牛血清（FBS）、青霉素/链霉素（P/S）、1倍DMEM培养基（美国Gibco公司），缺氧诱导装置（美国Billups-Rothenberg公司），Lipofectamine 2000转染试剂、cDNA逆转录试剂盒、BCA蛋白浓度检测试剂盒、恒温培养箱，超净工作台（美国Thermo Fisher公司），去内毒素质粒大量提取试剂盒、封闭山羊血清、5%BSA封闭液、抗荧光衰减封片剂、MTT、1倍PBS、Triton X-100、4%多聚甲醛（北京索莱宝科技有限公司），Trizol试剂、Isolectin GS-IB4、Alexa Fluor™ 488 Conjugate（美国Invitrogen公司）。胰酶消化液（江苏碧云天生物技术研究所），细胞培养板（美国Costar公司），移液器、Tip头（德国Eppendorf公司），EP管、离心管（上海生物工程技术有限公司）。7900HT实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），FACSCalibur流式细胞仪（美国BD公司），荧光显微镜（日本Olympus公司），TDL-40B型台式离心机（上海安亭科学仪器厂），DK-600A型电热恒温水浴箱（上海一恒科学仪器有限公司），细胞计数板（北京六一实验仪器厂）。
1.2 细胞培养、重组慢病毒包装及病毒滴度测定
正常细胞培养：293T细胞和hRMECs均使用含有10% FBS、P/S的DMEM培养基，置于37 ℃、95%空气、5% CO2的密闭恒温培养箱中进行培养。缺氧刺激细胞：将处于对数生长期的细胞或病毒感染后的细胞置于缺氧诱导装置中，向装置中充氮气直至氧气浓度达到2%，将缺氧诱导装置置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
质粒提取及测定：在NCBI基因数据库中查询获取人类PSF的核酸序列，基因序列号为NM_005066.2，由本实验室自行设计并合成重组质粒及大肠杆菌菌液。按照去内毒素质粒大量提取试剂盒说明书步骤提取质粒，通过酶切法和测序法鉴定目的质粒。重组慢病毒包装及浓缩：将293T细胞以2×107个/ml的密度复苏在75 cm塑料培养瓶中，待其生长到80%～90%融合度时进行传代，传至3～4代且融合度为60%以上时用于病毒包装。将目的质粒（pCDH-CMV-PSF-EF1-copGFP）和空载质粒（pEGFP-Vec）分别与穿梭质粒（pCMV-VSV-G）及包装质粒（psPAX2）以4:1:3的质量比构成三质粒系统，并和Lipofectamine 2000转染试剂（5～6 μl/ml）混合，室温孵育30 min。弃去细胞培养瓶中的培养液，加入孵育好的混合物后培养30 min，再加入等量完全培养液培养4～6 h后更换一次培养液。感染后24～48 h可观察到绿色荧光蛋白（GFP）表达情况，48～72 h可以收集病毒。将培养瓶中的上清液转移至50 ml离心管中，以离心半径15 cm、1500 r/min在4 ℃条件下离心10 min，再经0.45 μm过滤器过滤。将上清液、浓缩液按8:3的比例向过滤后的上清液中添加浓缩液，以4500×g在4 ℃条件下离心15 min，小心弃去液体，用完全培养液重悬病毒颗粒，分装冻存于−80 ℃冰箱或直接使用。采用批量快速测定法测定病毒滴度，后续实验中按照测定的病毒滴度计算体内实验和体外实验的作用浓度。
1.3 重组慢病毒感染hRMECs、流式细胞仪测定感染效率及实时荧光定量PCR（RT-PCR）测量hRMECs中PSF mRNA表达
将hRMECs以5×105个/ml的密度接种于12孔板，并将其分为正常组、空载组、PSF高表达组。正常组为正常体外培养的hRMECs；空载组为经LV-Vec感染的hRMECs；PSF高表达组为经LV-PSF感染的hRMECs。当细胞融合度达50%左右时，正常组继续培养，空载组和PSF组细胞弃去培养基，加入6 μg/ml聚凝胺孵育30 min后弃上清液，分别加入LV-Vec和LV- PSF感染，并于6 h后换完全培养液，48 h后于荧光显微镜下观察GFP的表达情况。
正常组、空载组和PSF高表达组细胞按分组处理后，消化离心并弃去上清液，分别用500 μl PBS重悬成单细胞悬液加入到流式管中上机检测。LV-Vec和LV-PSF表达GFP，可在波长为488 nm的蓝光雷射激发下发出绿色荧光，选用FL-1通道检测荧光信号。先检测正常组样品，调节电压使细胞群处于阴性区，再检测空载组和PSF高表达组，调节补偿使阳性群细胞处于合适位置。每组样品设置3个副孔，每孔获取50 000个微粒信号，实验重复进行3次，检测结果通过Flowjo 7.6软件进行分析。
正常组、空载组和PSF高表达组细胞按分组处理后，按Trizol Reagent说明书提取总RNA，反转录合成cDNA模板，行RT-PCR。引物序列由本实验室设计，由苏州金唯智公司合成（表1）。扩增条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。目的基因扩增产物的相对含量用2-ΔΔCt计算。
表1
RT-PCR引物序列
1.4 PSF对OIR模型小鼠RNV的作用
7日龄健康C57B/L6小鼠20只，雌雄不限，体重（3.52±0.35）g，购自斯贝福（北京）生物技术有限公司。采用随机数字表法将小鼠分为正常组、OIR组、OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组，每组5只。后3组小鼠置于氧气浓度为（75±5）%的饲养箱中，温度维持在（23±2）℃。OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠于12日龄时，经复方托吡卡胺滴眼液散瞳，0.4%盐酸奥布卡因滴眼液表面麻醉后，手术显微镜下各组玻璃体腔分别注射1 μl LV-Vec和LV-PSF，注射完毕后给予左氧氟沙星滴眼液点眼。OIR组小鼠不做玻璃体腔注射，于12日龄时置于正常室内空气中饲养。小鼠15日龄时，再次对OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠进行玻璃体腔注射重组慢病毒处理。正常组小鼠始终置于正常空气环境中饲养，未做任何处理。
小鼠17日龄时，各组小鼠腹腔注射过量10%水合氯醛处死，立即摘取右眼眼球在4%多聚甲醛中室温固定15 min，更换PBS冰上处理10 min。手术显微镜下剥离完整的视网膜，用100%甲醇固定15 min后，采用通透缓冲液（PBS缓冲液、1% BSA封闭液、0.5% Triton X-100及5%封闭山羊血清）处理视网膜2 h后用Alexa-488标记的Isolectin GS-IB4在4 ℃条件下孵育过夜。用PBS洗3遍后，将视网膜以RGC层向上平铺于载玻片上，并滴加抗荧光衰减封片剂，盖上盖玻片，在荧光显微镜下用相同的光学参数拍照。
1.5 PSF对缺氧诱导hRMECs增生和迁移功能的影响
将hRMECs分为正常组（正常培养的hRMECs）、缺氧组（缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h的hRMECs）、空载组（用LV-Vec感染hRMECs 48 h，再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h）和PSF高表达组（用LV-PSF感染hRMECs 48 h，再用缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h）。缺氧刺激3 h恢复正常培养条件24 h这一条件根据预实验结果获得。各组细胞以1×105个/ml的密度接种于96孔板，在分别进行各组刺激后，加入MTT孵育4 h后弃去培养上清液，加入150 μl DMSO，室温静置15 min后通过酶联免疫检测仪在490 nm波长处读取吸光度[A，旧称光密度（OD）]值。每组设置3个副孔，实验重复进行3次。
将hRMECs以5×105个/ml的密度接种于12孔板，培养过夜后按正常组、缺氧组、空载组和PSF过表达组进行相应处理。除正常组之外，其余3组均进行缺氧培养3 h，进行划痕处理并将此时计作0 h，继续培养48 h。分别在培养24、48 h时，于4倍光学显微镜下随机选取3个视野测量划痕无细胞部分的面积，分别计算出24、48 h细胞迁移率。细胞迁移率=（最初划痕面积−检测时无细胞部分的面积）/最初划痕面积。
hRMECs分为正常组、空载组和PSF过表达组，后两组细胞在病毒感染后分别缺氧刺激3 h并恢复正常条件培养24 h。将3组细胞消化后以1.5×105个的密度接种于Transwell小室上室内，无血清培养基培养；下室加入100% FBS，培养10 h后吸出小室和24孔板内液体，用棉签将小室上表面细胞轻轻擦掉，4%多聚甲醛固定Transwell小室下表面细胞15 min后PBS洗3次，经常规HE染色。将小室晾干，用无菌尖刀片将小室表面切下，进行中性树胶封片。每组设置3个复孔，本实验共重复3次。
1.6 统计学分析
采用SPSS18.0统计软件行统计学分析。多样本计量资料均数比较采用方差齐性检验，方差齐时采用方差分析，总体均数有差异时采用两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 LV-PSF鉴定
荧光显微镜观察发现，三质粒系统共同转染293T细胞48 h后可见GFP表达（图1A）；在LV-PSF感染hRMECs 48 h后也可观察到GFP表达（图1B）。流式细胞仪计数测得LV-PSF感染效率为97%（图1C）。RT-PCT测定结果显示，感染后48 h，PSF高表达组hRMECs中PSF mRNA表达较正常组、空载组明显增多，差异有统计学意义（t=32.85、30.60，P＜0.05）（图1D）。
图1
LV-PSF鉴定结果图。1A示三质粒系统转染293T细胞48 h后荧光显微镜像，可见293T细胞绿色荧光着染；1B示LV-PSF感染hRMECs 48 h后荧光显微镜像，可见hRMECs呈均匀绿色荧光着染；1C示流式细胞仪分析图，LV-PSF感染效率为97%；1D示正常组、空载组、PSF高表达组hRMECs中PSF mRNA表达比较，*P＜0.05。1A、1B标尺：100 μm
2.2 LV-PSF可显著抑制OIR小鼠模型RNV形成
荧光显微镜观察发现，正常组小鼠视网膜血管呈绿色荧光着染，未见异常视网膜血管；OIR组及OIR+LV-Vec组小鼠视网膜可见明显的、位于视网膜中央的无灌注区以及位于无灌注区和血管分布区交界处的病理性新生血管簇；OIR+LV-PSF组小鼠视网膜可见少量分散分布的病理性新生血管簇（图2）。正常组、OIR组、OIR+LV-Vec组和OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积/视网膜面积比较，差异有统计学意义（F=204.90，P＜0.05）。组间两两比较，OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV面积较正常组明显增加（t=18.31、43.71），OIR+LV-PSF组小鼠RNV面积较OIR组、OIR+LV-Vec组明显减小（t=11.30、15.47），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。
图2
小鼠视网膜铺片荧光显微镜像。2A示正常组；2B示OIR组；2C示OIR+LV-Vec组；2D示OIR+LV-PSF组。OIR组、OIR+LV-Vec组小鼠RNV簇较正常组明显增加，OIR+LV-PSF组小鼠RNV簇较OIR组、OIR+LV-Vec组明显减少 标尺：500 μm
图3
各组小鼠RNV面积/视网膜面积的比值比较。*P＜0.05
2.3 PSF可抑制缺氧刺激后hRMECs的增生、迁移能力
MTT比色法检测结果显示，缺氧组hRMECs增生能力较正常组明显升高（t=2.57），PSF高表达组hRMECs增生能力较正常组、缺氧组和空载组明显降低（t=5.26、5.46、3.73），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图4）。
图4
各组细胞增生能力比较。*P＜0.05
细胞划痕实验结果显示，缺氧组与空载组细胞在缺氧刺激后明显迁移，而PSF高表达组细胞在缺氧刺激后迁移不明显（图5）。定量分析结果显示，缺氧刺激3 h恢复正常条件24 h或48 h均可刺激hRMECs迁移（t=8.35、13.84，P＜0.05）。PSF高表达组hRMECs迁移率相对正常组、缺氧组和空载组明显降低，差异有统计学意义（t=10.99、18.27、9.75、8.93、26.94、7.01，P＜0.05）（图6）。
图5
细胞划痕实验光学显微镜像。6A~6D示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组0 h；6E~6H示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组24 h；6I~6L示正常组、缺氧组、空载组、PSF高表达组48 h。缺氧组与空载组细胞在缺氧刺激后明显迁移，而PSF高表达组细胞在缺氧刺激后迁移不明显 ×20
图6
各组细胞横向迁移率比较。*P＜0.05
Transwell小室实验结果显示，正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多，而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少（图7A～7C）。PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数较正常组、空载组明显减少，差异有统计学意义（t=9.334、6.149，P＜0.05）（图7D）。
图7
Transwell细胞迁移实验光学显微镜像及各组细胞纵向迁移率比较图。7A~7C分别示正常组、空载组、PSF高表达组光学显微镜像，正常组和空载组微孔膜上染色的细胞数较多，而PSF高表达组微孔膜上染色的细胞数明显减少 ×10；7D示各组细胞纵向迁移率比较，*P＜0.05
2.4 PSF通过HIF-1α/VEGF信号通路抑制hRMECs功能
RT-PCR检测结果显示，与正常组比较，缺氧组、空载组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显增加，差异有统计学意义（t=15.23、21.09，P<0.05）；PSF mRNA表达无明显变化，差异无统计学意义（t=0.12、2.15，P>0.05）。与缺氧组、空载组比较，PSF高表达组hRMECs中HIF-1α、VEGF的mRNA表达明显下降（t=10.18、13.10），PSF mRNA表达明显增加（t=65.00、85.79），差异均有统计学意义（P＜0.05）（图8）。
图8
各组细胞HIF-1α、VEGF、PSF mRNA表达比较。8A示HIF-1α；8B示VEGF；8C示PSF。*P＜0.05
3 讨论
我们的前期体外实验结果显示，高表达的PSF可以活化磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶信号通路，下调VEGF的表达[8]；体内实验结果显示，玻璃体腔注射PSF可有效下调小鼠视网膜组织中VEGF表达水平[9]。通过这些研究成果不难发现PSF的作用方式是多途径、多层面的，涉及的细胞类型也不局限于血管内皮细胞。基因治疗是一种基于外源性引入遗传物质以改变细胞基因表达情况从而达到治疗疾病目的的新措施，可以将外源性具有较强治疗作用的基因片段导入眼内，使其在眼内表达治疗基因产物，以达到持续而高效地治疗眼内疾病的目的。病毒载体现已成为基因治疗载体的研究热点[10-12]。本研究选择的慢病毒载体，具有基因整合功能，病毒基因组整合于目的细胞后可以长时间、稳定地表达目的基因，感染细胞类型包括分裂细胞和不分裂细胞，并且适用于感染难度较大的细胞[13]。在此基础之上进一步选择OIR模型来进行体内实验，观察PSF对缺氧诱导的RNV的影响，并通过在体外试验中采用更为贴近人体的hRMECs作为缺氧模型的细胞，以期收集更为全面的生物学信息，解读PSF在RNV中的作用。
本研究首先通过MTT比色法预实验选择缺氧刺激hRMECs增生的最佳条件，结果表明在2%氧浓度作用3 h恢复正常培养条件24 h能显著诱导hRMECs增生；高表达hRMECs中PSF水平则可明显抑制细胞的增生能力。其次，我们还研究了PSF对hRMECs迁移能力的影响，一方面依据细胞划痕实验可以观察细胞横向迁移使划痕愈合的能力；另一方面Transwell细胞迁移实验通过观察细胞能否纵向穿过Transwell小室基底膜上的微孔进入下室，从而评价细胞的纵向迁移能力。通过这两种方式，可以更为全面立体地模拟体内视网膜血管内皮细胞的迁移过程。细胞划痕实验结果表明，缺氧可刺激缺氧组和空载组hRMECs水平迁移能力，但PSF组hRMECs的迁移程度却受到抑制。Transwell细胞迁移实验结果显示，相对于正常组和空载组，PSF过表达可以抑制hRMECs的垂直迁移能力。这两项实验结果证明，PSF可以抑制缺氧刺激hRMECs的横向和纵向迁移能力，从而发挥抑制缺氧诱导细胞迁移的作用。我们还发现，体外缺氧诱导的hRMECs中HIF-1α和VEGF的转录水平均明显升高，但细胞中高水平的PSF则会明显抑制两者的表达。这提示在体外缺氧刺激的条件下，PSF通过负性调控HIF-1α/VEGF信号通路转录而发挥抑制hRMECs功能的作用。
本研究通过体内和体外实验较全面地揭示了PSF对RNV的作用，并阐述了其作用机制，为RNV性疾病的治疗提供了新的思路和方向。
