在微电极阵列植入的有创电生理实验条件下,记录大鼠麻醉过程中初级视觉皮层(V1)局部场电位(LFP),采用非线性动力学分析方法得到时间演化的复杂度变化曲线,并结合热刺激甩尾延迟时间和心率两项麻醉深度辅助判定指标,通过视觉刺激实验验证复杂度判定麻醉状态的可靠性。实验结果表明,麻醉过程中LFP的复杂度变化趋势相似,在相同麻醉状态下,视觉刺激前后大鼠初级视觉皮层响应LFP的复杂度差异不显著;但是不同麻醉状态下视觉刺激前后的LFP的复杂度具有显著性差异,说明复杂度可以作为麻醉深度判定的指标。进一步利用优化方法得到判定麻醉深度的复杂度阈值,其可靠性和准确率较高,为开颅手术的患者临床麻醉状态检测提供了有效的方法。
引用本文： 李晓媛, 师黎, 万红, 胡玉霞. 基于大鼠初级视觉皮层局部场电位的复杂度麻醉状态监测及效果分析. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 245-250. doi: 10.7507/1001-5515.20140046 复制
引言
有创的微电极阵列植入技术是动物神经电生理研究的主要手段，开颅手术过程中必须实施麻醉保证良好的操作条件，但是麻醉能够改变大脑神经元的活动，不同的麻醉药物和深度对手术顺利进行、动物生理功能和信号采集有效性具有很大的影响[1]。为了获得相对稳定的视觉刺激响应，选用高效的脑电(electroencephalogram,EEG)信号分析方法实现麻醉深度在线监测具有非常重要的临床应用价值。
目前临床上应用EEG信号进行麻醉深度监测主要采用从颅外头皮表面无创记录的EEG信号[2]，各种麻醉状态监测的方法(如时域、频域、时频域、双谱域、神经网络以及非线性动力学等分析方法[3-4])都具有一定的适用范围和缺陷。得到临床应用的双谱指数(bispectral index scale，BIS)[5]和Narcotrend指数[6]方法明显依赖麻醉药，对于药物联合使用无法起到预测作用，不能反映麻醉深度中的镇痛成分。研究表明EEG活动显示出非常复杂的非线性特性[7]，近年来发展起来的定量评价信号变化复杂性的复杂度(Lempel-ziv complexity，LZC)方法能有效地反映大脑在生理、病理和不同药物作用下的非线性变化特征，且算法简单，计算速度快，具有较好的抗干扰能力，许多研究运用复杂度分析进行临床麻醉监控和大脑疾病诊断[8-11]方面的探索。但是上述文献只定性阐述EEG的复杂度与麻醉深度的关系，没有定量求出表征不同麻醉深度的复杂度阈值，缺乏临床应用的基础。另一方面，基于EEG非线性动力学分析麻醉深度的方法应用在临床监控麻醉状态效果并不令人满意的原因主要由于EEG自身的特点所决定。首先EEG信号只反映大脑皮层不同区域功能活动的综合，不反映皮层下组织的功能状态，而后者才是对伤害性刺激的基本反射中枢，从而导致基于EEG分析的监测方法对某些伤害性刺激反映不敏感[12]；其次，EEG信号是头皮表面综合信息的反映，信号非常微弱，对噪声影响敏感，常受到肌电活动的干扰；最后，EEG信号的频带通常在0~30 Hz，缺少适用于麻醉深度精确分析的高频信息(如γ频带)，制约了基于的EEG的复杂度麻醉分析方法的应用[13]。
通过微电极植入技术记录到的局部场电位(local field potential,LFP)信号是在颅骨下获得的局部神经元突触后电位的综合，反映皮层下的脑功能活动，能有效对伤害性刺激做出反映。现在越来越多的研究表明LFP不易受肌电信号的影响，且具有适用于麻醉深度精确分析的高频信息，能更精确地反映麻醉效果[14-15]。因此，在有创电极植入的电生理实验中，利用LFP提取麻醉状态特征能更有效地实现麻醉状态的实时监控，并且为开颅手术患者的麻醉状态监控提供了新思路，具有非常重要的科学研究和临床实际应用价值。
鉴于上述原因和研究手段，本文提出一种基于LFP信号复杂度定量阈值分析的麻醉深度监测方法。首先，计算得到麻醉过程中大鼠视觉皮层V1区LFP信号的时间演化复杂度曲线，结合大鼠尾部热刺激的甩尾延迟时间和心率辅助麻醉状态判定标准进行麻醉过程状态划分。然后进行不同麻醉深度下各通道的相关性比较，确定合适的麻醉监控通道，并利用统计分析方法优化得出表示麻醉深度的复杂度阈值。结果表明LFP的复杂度很好地表征麻醉状态变化趋势，优化得到的复杂度阈值作为判定麻醉深度的指标可靠性和准确率较高，并且能够满足实时麻醉深度监测的要求，也为视觉刺激最佳时段和麻醉药物补充时间的确定提供了有益的探索。
1 基于LFP的复杂度麻醉状态分析
1.1 通道的选择
为了选取合适的通道进行麻醉状态监测，必须考察不同的麻醉状态对多通道自发LFP信号的独立性影响，采用互相关系数分析不同通道之间的相关性。Pearson互相关系数定义为
| $r=\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)}^{2}}\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}^{2}}}}}}$ |
其中
1.2 LFP的复杂度分析
复杂度是一种非线性动力学分析方法，可以有效反映地EGT变化过程中的特征信息，揭示大脑在不同麻醉状态下的活动变化规律。LZC分析[16]是基于粗粒化的方法，因其计算速度快非常适合麻醉深度评估等临床实际应用。
首先将LFP信号按照一定的采样率进行粗粒化，得到其二值化的时间序列P={s1，s2，…,sn}。分别定义S和Q为时间序列P的子串，SQ为S和Q的级联，SQπ表示从SQ序列中删掉最后一个字母，v(SQπ)表示SQπ的所有不同子串的集合，C(n)为序列P的复杂度，计算步骤如下：
(1) 数值初始化：C(n)=1，S=(s1)，Q=(s2),则SQπ=(s1)；
(2) 如果Q∈v(SQπ)，表示Q是SQπ的子串，S保持不变，待求序列的下一个字母级联至Q，则Q=(s2,s3)；如果Q∉v(SQπ)，那么Q不是SQπ的子串，表示产生一个新模式，S重新赋予S和Q的级联，即S=SQ=(s1,s2)，将Q清空后赋予待求序列的下一个字母，Q=(s3)。同时，C(n)=C(n)+1；
(3) 重复过程(2)，判断Q是否属于v(SQπ)，直到Q取到待求序列P的最后一个字母；
C(n)表示将序列分成C(n)个不同的子串，对于任意(0,1)随机序列，当n→∞，复杂度C(n)的最大边界量为：
| $\underset{n\to \infty }{\mathop{\lim }}\,C\left( n \right)=b\left( n \right)=\frac{n}{{{\log }_{2}}n}$ |
为了获得与序列长度无关的复杂度，对C(n)进行归一化，得到标准的复杂测度LZC：
| $\text{LZC=}\frac{C\left( n \right)}{b\left( n \right)}$ |
该复杂度作为一种模型独立的非线性测度，反映了任意序列随时间产生新模式的速率。同时，LFP的复杂测度随着信号的长度、采样频率和时间会发生变化[17]，当采样数据达到足够多时，复杂度趋于稳定值，为了提高计算速度，本文选取10 s的LFP信号作为一个片段计算LZC。
1.3 判定麻醉深度的LZC阈值优化
按照上述预处理方法记录并计算麻醉全程LFP的复杂度LZC，为了能够得到量化的判定麻醉深度的LZC阈值，首先随机选取18只大鼠的重复实验过程中的所有不同状态的70%的LZC片段作为训练样本，针对不同麻醉状态LZC分布，本文选取阈值r∈(0,1)，间隔Δr=0.2循环求解不同状态的LZC统计学分布，优化选取最佳阈值ro，当LZC＞ro时，认为该时段动物处于浅麻状态，否则处于深麻状态。其余的30%LZC片段作为测试样本，检验判定结果的准确性。
2 材料和方法
2.1 手术及准备
实验动物选用视力较好的非白化Long Evans(LE)大鼠18只，体重(260±20) g，雌雄不拘，由河南省动物中心提供(许可证号SCXK(豫)2010-0002)，动物的实验符合动物管理和使用委员会的各项规定。手术时首次按照4.0 mL/kg 腹腔注射10%的水合氯醛诱导麻醉[18]，缝制测试眼的眼线圈。将动物固定在立体定位仪上(ST-5ND-C，成都仪器)，用耳杆固定头部，应用小动物监测系统(MouseSTAT-CO2，KENT)将大鼠体温控制在37~38℃，连续监视心率(heart rate，HR)、血氧饱和度(oxyhemoglobin saturation，SpO2)和血流灌注指数(perfusion index，PI)等生理参数。根据LE大鼠脑定位图谱(George Paxinos and Charles Watson，Compact sixth edition 2009)，确定V1区的中心位置(前囟Bregma向后7.08 mm，中心旁开2.5 mm)，用颅钻开颅，利用体视显微镜(SZX7，Olympus)剥除硬脑膜，最后采用微型操作器(MX7600，Siskiyou)植入铂铱合金材质的16通道Microprobe微电极阵列(MEA)，植入深度为350~600 μm。
2.2 LFP数据采集和视觉刺激
LFP信号采集采用美国Blackrock Microsystems公司生产的128通道Cerebus多通道神经信号采集系统，各通道电极阻抗为0.50~1.0 MΩ，放大器的频率通带为0.3~250 Hz，采样频率为2 kHz。为了去除工频噪声的干扰，采用了50 Hz工频陷波滤波。
按照文献[10]对麻醉过程的分段，结合尾部热刺激甩尾时间(间隔5 min检测一次，最长刺激时间10 s以防止大鼠组织受伤)和心率(间隔10 s)辅助标准[19-20]，将麻醉过程分成实验前阶段、诱导阶段、麻醉持续阶段和恢复阶段。实验前阶段是指从完成电极植入手术后，大鼠甩尾延迟时间Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min时的大鼠接近清醒状态的时间段；诱导阶段为从加入微量泵注射麻醉药(0.4 mL/kg/h)开始持续约持续10 min；麻醉持续阶段为大鼠甩尾延迟时间Ts＞5 s和心率HR＜360 beats/min时的平稳麻醉阶段；恢复阶段为从停止微量泵注射麻药到接近清醒的记录时间段。LFP记录和分析只包含诱导、持续和恢复三个阶段，为了便于分析不同麻醉深度对视觉实验的影响，本文将诱导和恢复阶段合并记为浅麻阶段；将麻醉持续阶段定义为深麻阶段。
为了研究不同麻醉深度对于视觉刺激响应的影响，LFP信号的采集包括自发EEG信号和视觉刺激诱发EEG信号。视觉刺激为单眼刺激，即暴露测试眼，遮盖另一只眼进行视觉刺激实验。视觉刺激图像在LED显示器(HM903DT，Eizo，亮度50 cd/m2，分辨率1 024×768，刷新率60 Hz)进行显示。该显示器置于大鼠测试眼正前方15 cm处，刺激范围为60°×60°视角，视觉刺激的平均亮度为20 cd/m2，对比度为100 %。视觉刺激图像采用运动的正弦光栅，时间频率为4 Hz，包含12个方向(间隔30°，空间频率为0.1 cpd)随机出现，刺激1 s，灰屏间隔1 s，每组重复实验20次。
2.3 统计分析
由于LFP信号不服从正态分布，本文用Kruskal-Wallis非参数检验方法分析不同麻醉阶段组间复杂度LZC差异是否具有统计学差异。在显著性水平条件下，如果不同麻醉阶段组间复杂度LZC差异具有统计学差异，利用Mann-Whitney秩和检验进行多重比较，检验不同麻醉阶段视觉刺激响应和自发响应组间复杂度LZC差异性，即P＜0.05为差异有统计学意义 。
3 实验结果和讨论
3.1 不同麻醉深度各通道LFP的相关性
为了实现麻醉状态的有效实时监测必须选取合理的通道采集和分析LFP数据，首先进行各通道LFP预处理，挑选LFP基线在30 μV以内，波形正常的通道，再研究各通道LFP信号之间相关性，为优选分析通道提供依据。以第7通道为例，图 1(a)和(b)分别为微量泵注射麻醉药物后120~130 s(浅麻状态)和1 600~1 610 s(深麻状态)的自发LFP数据，当大鼠处于深麻状态，大脑活动受到严重抑制，LFP呈现出低频高幅的慢波；反之大鼠处在接近清醒或浅麻状态时，大脑活跃性增强，低频波被阻断，呈现出高频低幅的快波。图 1(c)为两种不同的麻醉状态下各通道LFP的相关性，结果表明随着麻醉深度的加深，各通道LFP之间的相关性增加，表明麻醉会抑制大脑的活动状态，使得各神经元的活动趋于一致。在浅麻状态下各通道LFP之间的相关性降低，表明大脑神经元活跃程度高。
图1
V1区LFP数据的特性
(a)补充注射麻醉药物后记录的120~130 s原始LFP数据(浅麻状态)；(b)记录的1 600~1 610 s原始LFP数据(深麻状态)；(c)在不同的麻醉状态记录的16个通道LFP之间的互相关性，灰度图中只显示不重复的两通道之间的互相关特性
Figure1. Signal characteristics of neocortical local field potentials in V1 area(a) original LFP signals recorded 120-130 s data after injection chloral hydrate (in slight DOA)； (b) original LFP recorded 1 600-1 610 s data after injection chloral hydrate (in deepen DOA)； (c) Cross correlation of LFP recorded from 16 channels,each colorscale-coded matrix contains values obtained from non-redundant pairwise combinations of recording sites
进一步研究各通道随时间演化的LFP复杂度变化曲线(见图 2)之间的相关性，结果表明各通道随时间演化的LFP复杂度变化趋势的相关性明显高于LFP自身的相关性，说明各通道LFP复杂度的变化趋势相似，只要选取经过预处理LFP波形正常的一个通道进行麻醉状态监控即可，各通道效果相似。
图2
大鼠麻醉过程16个通道自发LFP的复杂度LZC变化曲线
Figure2.
The curve of complexity measure LZC of spontaneous LFPs for 16 channels during the process of anesthesia
3.2 麻醉全程自发LFP的复杂度随时间演化过程
从完成电极植入手术后再次补充麻药开始到大鼠接近清醒(甩尾延迟时间Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min)的麻醉全程，记录16通道自发LFP信号，分析LZC随时间的变化趋势对于确定麻醉的状态具有重要意义。图 2为麻醉全程16通道LZC的时间演化过程，中间黑色粗线为16个通道的复杂度平均值，灰色区域为均方差。由图可知当大鼠清醒或者处在浅麻状态下，大脑神经元活跃，其复杂度LZC较大；反之大鼠处在深麻状态，大脑神经元活动受到严重抑制，各通道神经元活动趋于一致，其复杂度LZC相应减小，这与文献中利用EEG信号的复杂度监测麻醉状态变化相似[10-11]。
实验选取18只大鼠麻醉全程三种不同麻醉阶段下共4 950个片段进行组间自发LFP的LZC的差异性统计分析，麻醉诱导、维持和恢复阶段自发LFP的LZC平均值分别为0.52、0.24和0.64，Kruskal-Wallis方差检验P=0.021＜0.05，说明不同的麻醉阶段对复杂度LZC具有显著影响。进一步利用Mann-Whitney秩和检验不同麻醉阶段组间复杂度LZC是否具有统计意义的差异，统计结果表明诱导和维持阶段、恢复和维持阶段组间复杂度LZC检验P＜0.05，而诱导和恢复阶段组间复杂度LZC检验P＞0.05，说明深麻和浅麻状态组间自发LFP的复杂度LZC具有显著性差异，而浅麻状态的不同阶段组间自发LFP的复杂度LZC不具有显著性差异。
3.3 麻醉深度对于视觉刺激实验的影响
为了验证复杂度分析在不同麻醉状态下的检测效果，我们设计视觉刺激实验模式，分别在大鼠处于深麻(自发LFP的LZC的均值为0.24)和浅麻(自发LFP的LZC的均值为0.61)两种状态下进行视觉刺激实验，实验条件在2.2节详述。针对18只大鼠分别在相同麻醉状态下记录自发和视觉刺激诱发的LFP信号，分别选取浅麻自发、浅麻刺激、深麻自发和深麻刺激4种条件下的LFP片段各180个，进行多重方差比较检验，如图 3所示。大鼠在深麻状态下，自发和视觉刺激响应的复杂度LZC没有显著性差异，且组均值差很小，为0.056；大鼠在浅麻状态下自发和视觉刺激诱发的LFP信号复杂度没有显著性差异，组均值差达到0.23；但是深麻与浅麻状态之间具有显著性差异。上述分析说明深麻抑制视觉信息响应，阻碍皮层之间的信息交流，与神经生理学研究得到的麻醉损伤大脑大规模的信息集成的功能，破坏意识知觉的观点一致[21-22]。虽然大鼠在浅麻状态下自发和视觉刺激诱发LFP信号之间的复杂度没有显著性差异，但是组均差较大，说明在浅麻状态下大鼠V1区神经元对视觉刺激的响应比较活跃，有利于提取视觉刺激的神经元特征，为视觉刺激实验的数据采集和分析提供了可靠的依据。
图3
不同麻醉深度下自发和刺激实验LFP的复杂度LZC的方差统计
Figure3.
Variance analysis results of LZC between spontaneous LFP and evoked responses by visual stimulation under two different anesthesia states
3.4 表征不同麻醉深度的LZC阈值优化
从统计学分析可知，两种麻醉状态之间的复杂度具有显著性差异，说明LZC的大小能较好地反映麻醉状态的变化，虽然视觉刺激对LFP信号的复杂度有一定的影响，但是并不影响麻醉状态的判定，关键的问题是确定表征不同麻醉深度的LZC准确的阈值，为麻醉在线监测提供可靠的判断标准。
除去检测的坏道和超出范围的无效数据，共检测记录到4 950个片段信号。随机选取18只大鼠在水合氯醛麻醉全程中约70%不同麻醉状态下响应(共3 600个片段)作为训练样本，结合心率和热刺激甩尾延时体征指标进行统计分析，图 4为复杂度LZC训练样本在不同麻醉深度的分布统计，统计优化处理方法，选择LZC的优化阈值。利用其余的数据作为测试样本得到的统计结果如表 1所示，当分类LZC阈值时ro=0.32，两种不同麻醉状态分类效果均衡，达到最优麻醉状态分类效果，浅麻和深麻状态的识别正确率分别为92.5%和92.3%。
图4
两种麻醉状态LFP训练样本复杂度的统计结果
Figure4.
Statistical results of LZC in two different anesthesia states
表1
18只大鼠麻醉过程中不同麻醉状态下的性能指标的统计结果
Table1.
The statistical analysis of characteristic criterions in different anesthesia depths for 18 Long Evans rats
4 结论
综合上述分析，复杂度是表征麻醉深度的一种直观有效的方法。通过对18只LE实验大鼠补充麻醉药物后麻醉全程LFP的复杂度特征提取和统计分析，结果表明随着麻醉深度的加深，各通道LFP的相似性增加，并且各通道麻醉状态的转变过程中随时间演化的LZC呈现出相似的变化趋势，表明LFP的复杂度LZC能够有效地表征麻醉状态。进一步通过设计全屏运动的正弦光栅视觉刺激实验分析不同麻醉状态对视觉刺激响应产生的影响，不同麻醉阶段组间复杂度LZC具有统计学差异，但是相同麻醉状态下视觉刺激与否组间复杂度LZC不具有统计学差异，表明视觉刺激并不影响麻醉状态的分类。最后通过统计优化处理方法，找到合适的LZC阈值进行高效的麻醉深度监测，识别的正确率和有效性较好。
另外，V1区大部分神经元在视觉刺激下诱发的LFP的复杂度高于相同麻醉条件下自发LFP的复杂度，并且浅麻状态下引起的LFP复杂度变化的差异性较大。上述分析说明深麻抑制视觉信息响应，阻碍皮层之间的信息交流，在浅麻状态下大鼠V1区神经元对视觉刺激的响应比较活跃，有利于提取视觉刺激的神经元特征，为视觉刺激实验的数据采集和分析时段的选取、麻醉药物的补充时间提供了有效的依据，对保证研究视觉通路工作机理的电生理实验条件的一致性具有重要意义。
本文使用的复杂度分析方法只对微电极阵列植入手术中水合氯醛麻醉药物的应用做了检验，没有比较和分析不同的麻醉药物的状态预测效果。该方法更适合进行腹腔注射全麻方式长期监测，对于临床广泛应用还需要进一步分析和研究。
引言
有创的微电极阵列植入技术是动物神经电生理研究的主要手段，开颅手术过程中必须实施麻醉保证良好的操作条件，但是麻醉能够改变大脑神经元的活动，不同的麻醉药物和深度对手术顺利进行、动物生理功能和信号采集有效性具有很大的影响[1]。为了获得相对稳定的视觉刺激响应，选用高效的脑电(electroencephalogram,EEG)信号分析方法实现麻醉深度在线监测具有非常重要的临床应用价值。
目前临床上应用EEG信号进行麻醉深度监测主要采用从颅外头皮表面无创记录的EEG信号[2]，各种麻醉状态监测的方法(如时域、频域、时频域、双谱域、神经网络以及非线性动力学等分析方法[3-4])都具有一定的适用范围和缺陷。得到临床应用的双谱指数(bispectral index scale，BIS)[5]和Narcotrend指数[6]方法明显依赖麻醉药，对于药物联合使用无法起到预测作用，不能反映麻醉深度中的镇痛成分。研究表明EEG活动显示出非常复杂的非线性特性[7]，近年来发展起来的定量评价信号变化复杂性的复杂度(Lempel-ziv complexity，LZC)方法能有效地反映大脑在生理、病理和不同药物作用下的非线性变化特征，且算法简单，计算速度快，具有较好的抗干扰能力，许多研究运用复杂度分析进行临床麻醉监控和大脑疾病诊断[8-11]方面的探索。但是上述文献只定性阐述EEG的复杂度与麻醉深度的关系，没有定量求出表征不同麻醉深度的复杂度阈值，缺乏临床应用的基础。另一方面，基于EEG非线性动力学分析麻醉深度的方法应用在临床监控麻醉状态效果并不令人满意的原因主要由于EEG自身的特点所决定。首先EEG信号只反映大脑皮层不同区域功能活动的综合，不反映皮层下组织的功能状态，而后者才是对伤害性刺激的基本反射中枢，从而导致基于EEG分析的监测方法对某些伤害性刺激反映不敏感[12]；其次，EEG信号是头皮表面综合信息的反映，信号非常微弱，对噪声影响敏感，常受到肌电活动的干扰；最后，EEG信号的频带通常在0~30 Hz，缺少适用于麻醉深度精确分析的高频信息(如γ频带)，制约了基于的EEG的复杂度麻醉分析方法的应用[13]。
通过微电极植入技术记录到的局部场电位(local field potential,LFP)信号是在颅骨下获得的局部神经元突触后电位的综合，反映皮层下的脑功能活动，能有效对伤害性刺激做出反映。现在越来越多的研究表明LFP不易受肌电信号的影响，且具有适用于麻醉深度精确分析的高频信息，能更精确地反映麻醉效果[14-15]。因此，在有创电极植入的电生理实验中，利用LFP提取麻醉状态特征能更有效地实现麻醉状态的实时监控，并且为开颅手术患者的麻醉状态监控提供了新思路，具有非常重要的科学研究和临床实际应用价值。
鉴于上述原因和研究手段，本文提出一种基于LFP信号复杂度定量阈值分析的麻醉深度监测方法。首先，计算得到麻醉过程中大鼠视觉皮层V1区LFP信号的时间演化复杂度曲线，结合大鼠尾部热刺激的甩尾延迟时间和心率辅助麻醉状态判定标准进行麻醉过程状态划分。然后进行不同麻醉深度下各通道的相关性比较，确定合适的麻醉监控通道，并利用统计分析方法优化得出表示麻醉深度的复杂度阈值。结果表明LFP的复杂度很好地表征麻醉状态变化趋势，优化得到的复杂度阈值作为判定麻醉深度的指标可靠性和准确率较高，并且能够满足实时麻醉深度监测的要求，也为视觉刺激最佳时段和麻醉药物补充时间的确定提供了有益的探索。
1 基于LFP的复杂度麻醉状态分析
1.1 通道的选择
为了选取合适的通道进行麻醉状态监测，必须考察不同的麻醉状态对多通道自发LFP信号的独立性影响，采用互相关系数分析不同通道之间的相关性。Pearson互相关系数定义为
| $r=\frac{\sum\limits_{i=1}^{n}{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}}{\sqrt{\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{x}_{i}}-\bar{x} \right)}^{2}}\sum\limits_{i=1}^{n}{{{\left( {{y}_{i}}-\bar{y} \right)}^{2}}}}}}$ |
其中
1.2 LFP的复杂度分析
复杂度是一种非线性动力学分析方法，可以有效反映地EGT变化过程中的特征信息，揭示大脑在不同麻醉状态下的活动变化规律。LZC分析[16]是基于粗粒化的方法，因其计算速度快非常适合麻醉深度评估等临床实际应用。
首先将LFP信号按照一定的采样率进行粗粒化，得到其二值化的时间序列P={s1，s2，…,sn}。分别定义S和Q为时间序列P的子串，SQ为S和Q的级联，SQπ表示从SQ序列中删掉最后一个字母，v(SQπ)表示SQπ的所有不同子串的集合，C(n)为序列P的复杂度，计算步骤如下：
(1) 数值初始化：C(n)=1，S=(s1)，Q=(s2),则SQπ=(s1)；
(2) 如果Q∈v(SQπ)，表示Q是SQπ的子串，S保持不变，待求序列的下一个字母级联至Q，则Q=(s2,s3)；如果Q∉v(SQπ)，那么Q不是SQπ的子串，表示产生一个新模式，S重新赋予S和Q的级联，即S=SQ=(s1,s2)，将Q清空后赋予待求序列的下一个字母，Q=(s3)。同时，C(n)=C(n)+1；
(3) 重复过程(2)，判断Q是否属于v(SQπ)，直到Q取到待求序列P的最后一个字母；
C(n)表示将序列分成C(n)个不同的子串，对于任意(0,1)随机序列，当n→∞，复杂度C(n)的最大边界量为：
| $\underset{n\to \infty }{\mathop{\lim }}\,C\left( n \right)=b\left( n \right)=\frac{n}{{{\log }_{2}}n}$ |
为了获得与序列长度无关的复杂度，对C(n)进行归一化，得到标准的复杂测度LZC：
| $\text{LZC=}\frac{C\left( n \right)}{b\left( n \right)}$ |
该复杂度作为一种模型独立的非线性测度，反映了任意序列随时间产生新模式的速率。同时，LFP的复杂测度随着信号的长度、采样频率和时间会发生变化[17]，当采样数据达到足够多时，复杂度趋于稳定值，为了提高计算速度，本文选取10 s的LFP信号作为一个片段计算LZC。
1.3 判定麻醉深度的LZC阈值优化
按照上述预处理方法记录并计算麻醉全程LFP的复杂度LZC，为了能够得到量化的判定麻醉深度的LZC阈值，首先随机选取18只大鼠的重复实验过程中的所有不同状态的70%的LZC片段作为训练样本，针对不同麻醉状态LZC分布，本文选取阈值r∈(0,1)，间隔Δr=0.2循环求解不同状态的LZC统计学分布，优化选取最佳阈值ro，当LZC＞ro时，认为该时段动物处于浅麻状态，否则处于深麻状态。其余的30%LZC片段作为测试样本，检验判定结果的准确性。
2 材料和方法
2.1 手术及准备
实验动物选用视力较好的非白化Long Evans(LE)大鼠18只，体重(260±20) g，雌雄不拘，由河南省动物中心提供(许可证号SCXK(豫)2010-0002)，动物的实验符合动物管理和使用委员会的各项规定。手术时首次按照4.0 mL/kg 腹腔注射10%的水合氯醛诱导麻醉[18]，缝制测试眼的眼线圈。将动物固定在立体定位仪上(ST-5ND-C，成都仪器)，用耳杆固定头部，应用小动物监测系统(MouseSTAT-CO2，KENT)将大鼠体温控制在37~38℃，连续监视心率(heart rate，HR)、血氧饱和度(oxyhemoglobin saturation，SpO2)和血流灌注指数(perfusion index，PI)等生理参数。根据LE大鼠脑定位图谱(George Paxinos and Charles Watson，Compact sixth edition 2009)，确定V1区的中心位置(前囟Bregma向后7.08 mm，中心旁开2.5 mm)，用颅钻开颅，利用体视显微镜(SZX7，Olympus)剥除硬脑膜，最后采用微型操作器(MX7600，Siskiyou)植入铂铱合金材质的16通道Microprobe微电极阵列(MEA)，植入深度为350~600 μm。
2.2 LFP数据采集和视觉刺激
LFP信号采集采用美国Blackrock Microsystems公司生产的128通道Cerebus多通道神经信号采集系统，各通道电极阻抗为0.50~1.0 MΩ，放大器的频率通带为0.3~250 Hz，采样频率为2 kHz。为了去除工频噪声的干扰，采用了50 Hz工频陷波滤波。
按照文献[10]对麻醉过程的分段，结合尾部热刺激甩尾时间(间隔5 min检测一次，最长刺激时间10 s以防止大鼠组织受伤)和心率(间隔10 s)辅助标准[19-20]，将麻醉过程分成实验前阶段、诱导阶段、麻醉持续阶段和恢复阶段。实验前阶段是指从完成电极植入手术后，大鼠甩尾延迟时间Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min时的大鼠接近清醒状态的时间段；诱导阶段为从加入微量泵注射麻醉药(0.4 mL/kg/h)开始持续约持续10 min；麻醉持续阶段为大鼠甩尾延迟时间Ts＞5 s和心率HR＜360 beats/min时的平稳麻醉阶段；恢复阶段为从停止微量泵注射麻药到接近清醒的记录时间段。LFP记录和分析只包含诱导、持续和恢复三个阶段，为了便于分析不同麻醉深度对视觉实验的影响，本文将诱导和恢复阶段合并记为浅麻阶段；将麻醉持续阶段定义为深麻阶段。
为了研究不同麻醉深度对于视觉刺激响应的影响，LFP信号的采集包括自发EEG信号和视觉刺激诱发EEG信号。视觉刺激为单眼刺激，即暴露测试眼，遮盖另一只眼进行视觉刺激实验。视觉刺激图像在LED显示器(HM903DT，Eizo，亮度50 cd/m2，分辨率1 024×768，刷新率60 Hz)进行显示。该显示器置于大鼠测试眼正前方15 cm处，刺激范围为60°×60°视角，视觉刺激的平均亮度为20 cd/m2，对比度为100 %。视觉刺激图像采用运动的正弦光栅，时间频率为4 Hz，包含12个方向(间隔30°，空间频率为0.1 cpd)随机出现，刺激1 s，灰屏间隔1 s，每组重复实验20次。
2.3 统计分析
由于LFP信号不服从正态分布，本文用Kruskal-Wallis非参数检验方法分析不同麻醉阶段组间复杂度LZC差异是否具有统计学差异。在显著性水平条件下，如果不同麻醉阶段组间复杂度LZC差异具有统计学差异，利用Mann-Whitney秩和检验进行多重比较，检验不同麻醉阶段视觉刺激响应和自发响应组间复杂度LZC差异性，即P＜0.05为差异有统计学意义 。
3 实验结果和讨论
3.1 不同麻醉深度各通道LFP的相关性
为了实现麻醉状态的有效实时监测必须选取合理的通道采集和分析LFP数据，首先进行各通道LFP预处理，挑选LFP基线在30 μV以内，波形正常的通道，再研究各通道LFP信号之间相关性，为优选分析通道提供依据。以第7通道为例，图 1(a)和(b)分别为微量泵注射麻醉药物后120~130 s(浅麻状态)和1 600~1 610 s(深麻状态)的自发LFP数据，当大鼠处于深麻状态，大脑活动受到严重抑制，LFP呈现出低频高幅的慢波；反之大鼠处在接近清醒或浅麻状态时，大脑活跃性增强，低频波被阻断，呈现出高频低幅的快波。图 1(c)为两种不同的麻醉状态下各通道LFP的相关性，结果表明随着麻醉深度的加深，各通道LFP之间的相关性增加，表明麻醉会抑制大脑的活动状态，使得各神经元的活动趋于一致。在浅麻状态下各通道LFP之间的相关性降低，表明大脑神经元活跃程度高。
图1
V1区LFP数据的特性
(a)补充注射麻醉药物后记录的120~130 s原始LFP数据(浅麻状态)；(b)记录的1 600~1 610 s原始LFP数据(深麻状态)；(c)在不同的麻醉状态记录的16个通道LFP之间的互相关性，灰度图中只显示不重复的两通道之间的互相关特性
Figure1. Signal characteristics of neocortical local field potentials in V1 area(a) original LFP signals recorded 120-130 s data after injection chloral hydrate (in slight DOA)； (b) original LFP recorded 1 600-1 610 s data after injection chloral hydrate (in deepen DOA)； (c) Cross correlation of LFP recorded from 16 channels,each colorscale-coded matrix contains values obtained from non-redundant pairwise combinations of recording sites
进一步研究各通道随时间演化的LFP复杂度变化曲线(见图 2)之间的相关性，结果表明各通道随时间演化的LFP复杂度变化趋势的相关性明显高于LFP自身的相关性，说明各通道LFP复杂度的变化趋势相似，只要选取经过预处理LFP波形正常的一个通道进行麻醉状态监控即可，各通道效果相似。
图2
大鼠麻醉过程16个通道自发LFP的复杂度LZC变化曲线
Figure2.
The curve of complexity measure LZC of spontaneous LFPs for 16 channels during the process of anesthesia
3.2 麻醉全程自发LFP的复杂度随时间演化过程
从完成电极植入手术后再次补充麻药开始到大鼠接近清醒(甩尾延迟时间Ts＜5 s和心率HR＞380 beats/min)的麻醉全程，记录16通道自发LFP信号，分析LZC随时间的变化趋势对于确定麻醉的状态具有重要意义。图 2为麻醉全程16通道LZC的时间演化过程，中间黑色粗线为16个通道的复杂度平均值，灰色区域为均方差。由图可知当大鼠清醒或者处在浅麻状态下，大脑神经元活跃，其复杂度LZC较大；反之大鼠处在深麻状态，大脑神经元活动受到严重抑制，各通道神经元活动趋于一致，其复杂度LZC相应减小，这与文献中利用EEG信号的复杂度监测麻醉状态变化相似[10-11]。
实验选取18只大鼠麻醉全程三种不同麻醉阶段下共4 950个片段进行组间自发LFP的LZC的差异性统计分析，麻醉诱导、维持和恢复阶段自发LFP的LZC平均值分别为0.52、0.24和0.64，Kruskal-Wallis方差检验P=0.021＜0.05，说明不同的麻醉阶段对复杂度LZC具有显著影响。进一步利用Mann-Whitney秩和检验不同麻醉阶段组间复杂度LZC是否具有统计意义的差异，统计结果表明诱导和维持阶段、恢复和维持阶段组间复杂度LZC检验P＜0.05，而诱导和恢复阶段组间复杂度LZC检验P＞0.05，说明深麻和浅麻状态组间自发LFP的复杂度LZC具有显著性差异，而浅麻状态的不同阶段组间自发LFP的复杂度LZC不具有显著性差异。
3.3 麻醉深度对于视觉刺激实验的影响
为了验证复杂度分析在不同麻醉状态下的检测效果，我们设计视觉刺激实验模式，分别在大鼠处于深麻(自发LFP的LZC的均值为0.24)和浅麻(自发LFP的LZC的均值为0.61)两种状态下进行视觉刺激实验，实验条件在2.2节详述。针对18只大鼠分别在相同麻醉状态下记录自发和视觉刺激诱发的LFP信号，分别选取浅麻自发、浅麻刺激、深麻自发和深麻刺激4种条件下的LFP片段各180个，进行多重方差比较检验，如图 3所示。大鼠在深麻状态下，自发和视觉刺激响应的复杂度LZC没有显著性差异，且组均值差很小，为0.056；大鼠在浅麻状态下自发和视觉刺激诱发的LFP信号复杂度没有显著性差异，组均值差达到0.23；但是深麻与浅麻状态之间具有显著性差异。上述分析说明深麻抑制视觉信息响应，阻碍皮层之间的信息交流，与神经生理学研究得到的麻醉损伤大脑大规模的信息集成的功能，破坏意识知觉的观点一致[21-22]。虽然大鼠在浅麻状态下自发和视觉刺激诱发LFP信号之间的复杂度没有显著性差异，但是组均差较大，说明在浅麻状态下大鼠V1区神经元对视觉刺激的响应比较活跃，有利于提取视觉刺激的神经元特征，为视觉刺激实验的数据采集和分析提供了可靠的依据。
图3
不同麻醉深度下自发和刺激实验LFP的复杂度LZC的方差统计
Figure3.
Variance analysis results of LZC between spontaneous LFP and evoked responses by visual stimulation under two different anesthesia states
3.4 表征不同麻醉深度的LZC阈值优化
从统计学分析可知，两种麻醉状态之间的复杂度具有显著性差异，说明LZC的大小能较好地反映麻醉状态的变化，虽然视觉刺激对LFP信号的复杂度有一定的影响，但是并不影响麻醉状态的判定，关键的问题是确定表征不同麻醉深度的LZC准确的阈值，为麻醉在线监测提供可靠的判断标准。
除去检测的坏道和超出范围的无效数据，共检测记录到4 950个片段信号。随机选取18只大鼠在水合氯醛麻醉全程中约70%不同麻醉状态下响应(共3 600个片段)作为训练样本，结合心率和热刺激甩尾延时体征指标进行统计分析，图 4为复杂度LZC训练样本在不同麻醉深度的分布统计，统计优化处理方法，选择LZC的优化阈值。利用其余的数据作为测试样本得到的统计结果如表 1所示，当分类LZC阈值时ro=0.32，两种不同麻醉状态分类效果均衡，达到最优麻醉状态分类效果，浅麻和深麻状态的识别正确率分别为92.5%和92.3%。
图4
两种麻醉状态LFP训练样本复杂度的统计结果
Figure4.
Statistical results of LZC in two different anesthesia states
表1
18只大鼠麻醉过程中不同麻醉状态下的性能指标的统计结果
Table1.
The statistical analysis of characteristic criterions in different anesthesia depths for 18 Long Evans rats
4 结论
综合上述分析，复杂度是表征麻醉深度的一种直观有效的方法。通过对18只LE实验大鼠补充麻醉药物后麻醉全程LFP的复杂度特征提取和统计分析，结果表明随着麻醉深度的加深，各通道LFP的相似性增加，并且各通道麻醉状态的转变过程中随时间演化的LZC呈现出相似的变化趋势，表明LFP的复杂度LZC能够有效地表征麻醉状态。进一步通过设计全屏运动的正弦光栅视觉刺激实验分析不同麻醉状态对视觉刺激响应产生的影响，不同麻醉阶段组间复杂度LZC具有统计学差异，但是相同麻醉状态下视觉刺激与否组间复杂度LZC不具有统计学差异，表明视觉刺激并不影响麻醉状态的分类。最后通过统计优化处理方法，找到合适的LZC阈值进行高效的麻醉深度监测，识别的正确率和有效性较好。
另外，V1区大部分神经元在视觉刺激下诱发的LFP的复杂度高于相同麻醉条件下自发LFP的复杂度，并且浅麻状态下引起的LFP复杂度变化的差异性较大。上述分析说明深麻抑制视觉信息响应，阻碍皮层之间的信息交流，在浅麻状态下大鼠V1区神经元对视觉刺激的响应比较活跃，有利于提取视觉刺激的神经元特征，为视觉刺激实验的数据采集和分析时段的选取、麻醉药物的补充时间提供了有效的依据，对保证研究视觉通路工作机理的电生理实验条件的一致性具有重要意义。
本文使用的复杂度分析方法只对微电极阵列植入手术中水合氯醛麻醉药物的应用做了检验，没有比较和分析不同的麻醉药物的状态预测效果。该方法更适合进行腹腔注射全麻方式长期监测，对于临床广泛应用还需要进一步分析和研究。
