对316L不锈钢、聚甲醛(POM)以及低温各向同性热解碳(LTIC)材料的血液相容性进行了研究,初步探讨作为心脏瓣膜瓣叶材料的可行性。通过样品表面水接触角的测量判断亲疏水性,利用血小板黏附实验、凝血酶时间测定以及溶血率实验评估其血液相容性。结果表明:POM具有疏水性、较低的溶血率,样品表面血小板的黏附数量和被激活程度均低于316L不锈钢并与LTIC相近。本研究指出了POM作为双叶心脏瓣膜瓣叶材料的潜在应用价值。
引用本文： 武亮亮, 宋强, 刘涛, 刘丽, 黄楠. 可用于双叶心脏瓣膜的聚甲醛的血液相容性评价. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 347-351. doi: 10.7507/1001-5515.20140065 复制
引言
在心脏瓣膜疾病的治疗过程中，人工心脏瓣膜发挥着重要的作用，在人工心脏瓣膜发展的40年间已先后约有50余种人造瓣膜[1]应用于临床，但人工心脏瓣膜仍未达到理想的水平。心脏瓣膜材料与结构对性能影响很大[2]，现在市场上大部分瓣膜瓣叶材料为低温各向同性热解碳(low temperature isotropic carbon,LTIC)，其具有与血液相近的密度、良好的自润滑性能和生物相容性，但它生产成本高，污染大，难加工，材料本身比较脆，容易产生脆断，直接影响心脏瓣膜的功能。
医用聚甲醛(polyoxymethylene,POM)是随着现代生物医用高分子发展而出现的新材料[3]，具有较好的力学性能，用POM代替LTIC作为心脏瓣膜瓣叶材料不仅可以降低成本，而且还具有加工精度高和性能优异的特点。POM是一种综合性能优良的工程塑料，具有高的力学性能，如强度、耐磨性、韧性、耐疲劳性、抗蠕变性和可加工性[4]。当医用级别的POM与机体接触，除要求具有相应的医用功能外，还必须具备良好的血液相容性，避免凝血、血栓形成及溶血等不良反应，因此研究瓣叶材料血液相容性极为必要。POM作为医用高分子材料较早应用于骨锚钉[5]、人工关节[6]等，其体内耐蠕变性能和血液相容性都得到了验证，可以作为体内植入材料，也曾直接应用人工心脏瓣膜，比如Bjork-Shilcy(聚甲醛单叶瓣)[7]，当时由于材料性能及加工问题，瓣膜植入后产生疲劳磨损以致失效[8]，但其作为植入体的生物相容性得到了确认。最近几年，POM的性能得到很大的改进，Chen等[9]通过掺杂低密度聚乙烯和乙烯丙烯酸，耐磨性能得到明显提高，Zhao等[10]则通过添加多壁碳纳米管，使POM结晶温度和结晶速率增加，机械性能得到明显提高。但目前关于POM的研究均未涉及其血液相容性，因此，利用POM作为双叶心脏瓣膜瓣叶材料，需要对其血液相容性进一步探讨。本文通过水接触角测量、溶血实验、凝血酶时间测定、血小板黏附实验等对医用POM材料进行了血液相容性评价，以促进对其应用于心脏瓣膜瓣叶可能性的认识。
1 材料与方法
1.1 样品制备
实验所需POM为广东江门市新会区会城江峰棒材厂生产的聚甲醛板材，医用级别。将板材加工成9 mm×9 mm的方形样品，厚1.5 mm，在沸水中煮2 h，消除切削应力，然后经过砂纸打磨及抛光机抛光表面，最后依次用丙酮、无水乙醇超声清洗3 min，再用双蒸水超声清洗两次，每次5 min，干燥后贮存于干燥箱中备用。对比样品取用316L不锈钢(316L)和热解碳(LTIC)(兰州兰飞医疗器械有限公司生产)。
1.2 材料及表征
1.2.1 水接触角测量
利用液滴法测量材料表面的水接触角，采用JY-82型接触角测量仪，测试环境：温度20 ℃，湿度45%，万级超净实验室。
1.2.2 溶血实验
溶血实验即为检测实验材料对血液红细胞的溶血作用。实验过程严格按照ISO 10993-4标准规定的溶血实验的具体操作步骤进行，实验重复三次(n=4)，首先采用酶标仪测定540 nm波长处溶液的吸光度，然后根据吸光度计算样品的溶血率。
1.2.3 凝血酶时间检测
凝血酶时间检测需要血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和血浆凝血酶时间(thrombin time,TT)测定。主要步骤： 将新鲜抗凝全血，在3 000 r/min转速下离心10 min，取上层黄色液体得贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，用其浸泡样品，然后在37 ℃水浴箱孵育30 min，所得血浆用APTT、PT、TT测定试剂盒进行检测，用意大利Hospitex公司凝血仪记录时间。
1.2.4 血小板黏附实验
将新鲜抗凝全血在1 500 r/min转速下离心15 min，取上层黄色液体得富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，在样品表面滴加50 μL PRP，然后在37 ℃水浴箱孵育0.5 h和2 h，用PBS溶液清洗三次，再用2.5%戊二醛溶液固定6 h以上，然后用50%、75%、90%和100%的无水乙醇(水为溶剂)分别脱水15 min，接着用50%、75%、90%和100%的乙酸异戊酯(无水乙醇为溶剂)溶液分别脱醇15 min，最后用CO2临界点干燥样品，干燥后用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察血小板的形态并拍照。另外，对上述用戊二醛固定的样品，对血小板的膜骨架进行免疫荧光染色(染料为罗丹明123)，然后用400倍的显微镜对每个试验样品随机拍10个视野，进行人工计数和统计处理[11]。
2 结果与讨论
2.1 水接触角
水接触角是表征材料表面亲疏水性的一种简便方法，水接触角的测定结果如图 1所示。可见，316L不锈钢表面的水接触角约为70°，LTIC表面的水接触角约为85°，POM样品表面的水接触角约为95°，为疏水材料，其趋势是316L＜LTIC＜POM。
图1
样品表面的水接触角
Figure1.
Water contact angle of sample surfaces
2.2 溶血率
316 L不锈钢和LTIC分别作为生产血管支架、心脏瓣膜瓣叶的主要材料，其不溶血的性能早已被证实[12]，本次溶血实验测得POM样品溶血率平均为0.2%，均小于5%，离心后试管中红细胞下沉，上清液变清无红色，吸取少量含红细胞的下层液进行显微镜下观察，未发现红细胞破裂现象，符合ISO10993-4标准的规定，材料溶血实验检测合格，可以作为血液接触类生物材料[13]，表明POM植入体内不会导致红细胞溶解和血红蛋白释放，不会引起急性溶血，具有良好的血液相容性。
2.3 凝血酶时间
PT和APTT测定是外源性和内源性凝血系统的过筛试验，TT则主要检测血浆纤维蛋白原的减少或抗凝物质的增多。结果如表 1所示，三种样品的PT/TT无明显差异，APTT检测结果较正常血浆偏长，与316L和LTIC无明显差异，POM具有和正常血浆一样的凝血时间，不会引起外源性和内源性凝血。
表1
APTT/PT/TT结果
Table1.
Results of APTT/PT/TT
2.4 血小板实验
图 2为样品表面黏附血小板的扫描电镜照片。从血小板的形态看，三种样品表面的血小板受到一定程度的激活，部分血小板明显地伸出伪足；316L表面的血小板被激活程度较高，有明显的伪足伸出，并且大部分血小板严重变形，在材料表面完全铺展开；而LTIC和POM表面的血小板形态相对比较圆整，部分被激活，激活程度低于316L，两者比较中，POM激活程度更低。从血小板的黏附数量看，孵育0.5 h血小板黏附数量相差不大，孵育2 h后POM的黏附数量较316L和LTIC少。
图2
样品表面血小板黏附的扫描电镜图(3 000×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure2. SEM images for the sample surfaces with platelet adhesion (3 000×)荧光染色结果如图 3所示，孵育0.5 h血小板黏附数量相差不大，孵育2 h后POM的黏附数量较316L和LTIC少，与扫描电镜结果一致。通过荧光染色照片对血小板的黏附数量进行统计分析，结果如图 4所示。在0.5 h时，316L、POM和LTIC三种样品表面的血小板黏附数量约为2 000 个/cm2，且无明显差异；经过2 h的孵化后，三种样品表面的血小板黏附数量明显增多，316L表面血小板黏附数量约为10 000 个/cm2，LTCT和POM表面血小板黏附数量则约为7 000 个/cm2，316L表面的血小板黏附数量明显多于LTCT和POM，与扫描电镜结果一致。
图3
不同样品的免疫荧光图片(400×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure3. Immunofluorescence images of different samples (400×)
图4
样品表面血小板的黏附数量
Figure4.
Adhesion amount of platelets on the samples
血小板黏附实验结果表明：由于POM和LTIC表面血小板的黏附数量和被激活的程度均低于316L，因而它们具有优于316L的抗凝血效果并且POM具有和LTIC相似的抗凝血效果，可以用来植入体内。
3 结论
人工心脏瓣膜作为国家第三类医疗器械，对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制，因此，瓣膜材料的选材尤为重要，在满足瓣膜的基本功能要求外，必须首先满足植入体内的血液相容性要求。良好的血液相容性是心脏瓣膜材料的必要特性，通过体外血液实验研究表明：与316L和LTIC相比，POM具有疏水性，溶血率低，不会引起外源性和内源性凝血，具有与LTIC相近的血液相容性，可以作为植入器械植入人体。POM材料密度接近血液，血液流动过程中不会额外增加能量损失[14]。POM材料又具有良好的加工性能，双叶机械瓣膜瓣叶结构复杂，但可以通过模具注塑加工或者数控机床加工用于双叶机械心脏瓣膜的瓣叶，工艺相对简单，成本低，因此POM材料具有应用于双叶机械心脏瓣膜的潜力。
POM能够做为植入医疗器械材料，其本身具有良好的血液相容性，后续还可以采用表面接枝改性、引入生物活性分子、表面涂层等进一步改善POM表面的血液相容性，使其具有更好的生物相容性[15]。实际上应用POM作为瓣叶材料，还要包括了对材料其它性能如物理、机械性能、化学稳定性、毒性、加工成型性等方面的要求。本文仅研究其生物相容性，提出POM作为双叶心脏瓣膜的可能，在后续的实验中更应该考虑其疲劳耐磨以及综合性能，更需必要的动物实验和人体试验进行验证。
引言
在心脏瓣膜疾病的治疗过程中，人工心脏瓣膜发挥着重要的作用，在人工心脏瓣膜发展的40年间已先后约有50余种人造瓣膜[1]应用于临床，但人工心脏瓣膜仍未达到理想的水平。心脏瓣膜材料与结构对性能影响很大[2]，现在市场上大部分瓣膜瓣叶材料为低温各向同性热解碳(low temperature isotropic carbon,LTIC)，其具有与血液相近的密度、良好的自润滑性能和生物相容性，但它生产成本高，污染大，难加工，材料本身比较脆，容易产生脆断，直接影响心脏瓣膜的功能。
医用聚甲醛(polyoxymethylene,POM)是随着现代生物医用高分子发展而出现的新材料[3]，具有较好的力学性能，用POM代替LTIC作为心脏瓣膜瓣叶材料不仅可以降低成本，而且还具有加工精度高和性能优异的特点。POM是一种综合性能优良的工程塑料，具有高的力学性能，如强度、耐磨性、韧性、耐疲劳性、抗蠕变性和可加工性[4]。当医用级别的POM与机体接触，除要求具有相应的医用功能外，还必须具备良好的血液相容性，避免凝血、血栓形成及溶血等不良反应，因此研究瓣叶材料血液相容性极为必要。POM作为医用高分子材料较早应用于骨锚钉[5]、人工关节[6]等，其体内耐蠕变性能和血液相容性都得到了验证，可以作为体内植入材料，也曾直接应用人工心脏瓣膜，比如Bjork-Shilcy(聚甲醛单叶瓣)[7]，当时由于材料性能及加工问题，瓣膜植入后产生疲劳磨损以致失效[8]，但其作为植入体的生物相容性得到了确认。最近几年，POM的性能得到很大的改进，Chen等[9]通过掺杂低密度聚乙烯和乙烯丙烯酸，耐磨性能得到明显提高，Zhao等[10]则通过添加多壁碳纳米管，使POM结晶温度和结晶速率增加，机械性能得到明显提高。但目前关于POM的研究均未涉及其血液相容性，因此，利用POM作为双叶心脏瓣膜瓣叶材料，需要对其血液相容性进一步探讨。本文通过水接触角测量、溶血实验、凝血酶时间测定、血小板黏附实验等对医用POM材料进行了血液相容性评价，以促进对其应用于心脏瓣膜瓣叶可能性的认识。
1 材料与方法
1.1 样品制备
实验所需POM为广东江门市新会区会城江峰棒材厂生产的聚甲醛板材，医用级别。将板材加工成9 mm×9 mm的方形样品，厚1.5 mm，在沸水中煮2 h，消除切削应力，然后经过砂纸打磨及抛光机抛光表面，最后依次用丙酮、无水乙醇超声清洗3 min，再用双蒸水超声清洗两次，每次5 min，干燥后贮存于干燥箱中备用。对比样品取用316L不锈钢(316L)和热解碳(LTIC)(兰州兰飞医疗器械有限公司生产)。
1.2 材料及表征
1.2.1 水接触角测量
利用液滴法测量材料表面的水接触角，采用JY-82型接触角测量仪，测试环境：温度20 ℃，湿度45%，万级超净实验室。
1.2.2 溶血实验
溶血实验即为检测实验材料对血液红细胞的溶血作用。实验过程严格按照ISO 10993-4标准规定的溶血实验的具体操作步骤进行，实验重复三次(n=4)，首先采用酶标仪测定540 nm波长处溶液的吸光度，然后根据吸光度计算样品的溶血率。
1.2.3 凝血酶时间检测
凝血酶时间检测需要血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和血浆凝血酶时间(thrombin time,TT)测定。主要步骤： 将新鲜抗凝全血，在3 000 r/min转速下离心10 min，取上层黄色液体得贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，用其浸泡样品，然后在37 ℃水浴箱孵育30 min，所得血浆用APTT、PT、TT测定试剂盒进行检测，用意大利Hospitex公司凝血仪记录时间。
1.2.4 血小板黏附实验
将新鲜抗凝全血在1 500 r/min转速下离心15 min，取上层黄色液体得富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)，在样品表面滴加50 μL PRP，然后在37 ℃水浴箱孵育0.5 h和2 h，用PBS溶液清洗三次，再用2.5%戊二醛溶液固定6 h以上，然后用50%、75%、90%和100%的无水乙醇(水为溶剂)分别脱水15 min，接着用50%、75%、90%和100%的乙酸异戊酯(无水乙醇为溶剂)溶液分别脱醇15 min，最后用CO2临界点干燥样品，干燥后用扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察血小板的形态并拍照。另外，对上述用戊二醛固定的样品，对血小板的膜骨架进行免疫荧光染色(染料为罗丹明123)，然后用400倍的显微镜对每个试验样品随机拍10个视野，进行人工计数和统计处理[11]。
2 结果与讨论
2.1 水接触角
水接触角是表征材料表面亲疏水性的一种简便方法，水接触角的测定结果如图 1所示。可见，316L不锈钢表面的水接触角约为70°，LTIC表面的水接触角约为85°，POM样品表面的水接触角约为95°，为疏水材料，其趋势是316L＜LTIC＜POM。
图1
样品表面的水接触角
Figure1.
Water contact angle of sample surfaces
2.2 溶血率
316 L不锈钢和LTIC分别作为生产血管支架、心脏瓣膜瓣叶的主要材料，其不溶血的性能早已被证实[12]，本次溶血实验测得POM样品溶血率平均为0.2%，均小于5%，离心后试管中红细胞下沉，上清液变清无红色，吸取少量含红细胞的下层液进行显微镜下观察，未发现红细胞破裂现象，符合ISO10993-4标准的规定，材料溶血实验检测合格，可以作为血液接触类生物材料[13]，表明POM植入体内不会导致红细胞溶解和血红蛋白释放，不会引起急性溶血，具有良好的血液相容性。
2.3 凝血酶时间
PT和APTT测定是外源性和内源性凝血系统的过筛试验，TT则主要检测血浆纤维蛋白原的减少或抗凝物质的增多。结果如表 1所示，三种样品的PT/TT无明显差异，APTT检测结果较正常血浆偏长，与316L和LTIC无明显差异，POM具有和正常血浆一样的凝血时间，不会引起外源性和内源性凝血。
表1
APTT/PT/TT结果
Table1.
Results of APTT/PT/TT
2.4 血小板实验
图 2为样品表面黏附血小板的扫描电镜照片。从血小板的形态看，三种样品表面的血小板受到一定程度的激活，部分血小板明显地伸出伪足；316L表面的血小板被激活程度较高，有明显的伪足伸出，并且大部分血小板严重变形，在材料表面完全铺展开；而LTIC和POM表面的血小板形态相对比较圆整，部分被激活，激活程度低于316L，两者比较中，POM激活程度更低。从血小板的黏附数量看，孵育0.5 h血小板黏附数量相差不大，孵育2 h后POM的黏附数量较316L和LTIC少。
图2
样品表面血小板黏附的扫描电镜图(3 000×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure2. SEM images for the sample surfaces with platelet adhesion (3 000×)荧光染色结果如图 3所示，孵育0.5 h血小板黏附数量相差不大，孵育2 h后POM的黏附数量较316L和LTIC少，与扫描电镜结果一致。通过荧光染色照片对血小板的黏附数量进行统计分析，结果如图 4所示。在0.5 h时，316L、POM和LTIC三种样品表面的血小板黏附数量约为2 000 个/cm2，且无明显差异；经过2 h的孵化后，三种样品表面的血小板黏附数量明显增多，316L表面血小板黏附数量约为10 000 个/cm2，LTCT和POM表面血小板黏附数量则约为7 000 个/cm2，316L表面的血小板黏附数量明显多于LTCT和POM，与扫描电镜结果一致。
图3
不同样品的免疫荧光图片(400×)
(a)、(d) 316L；(b)、(e) POM；(c)、(f) LTIC
Figure3. Immunofluorescence images of different samples (400×)
图4
样品表面血小板的黏附数量
Figure4.
Adhesion amount of platelets on the samples
血小板黏附实验结果表明：由于POM和LTIC表面血小板的黏附数量和被激活的程度均低于316L，因而它们具有优于316L的抗凝血效果并且POM具有和LTIC相似的抗凝血效果，可以用来植入体内。
3 结论
人工心脏瓣膜作为国家第三类医疗器械，对人体具有潜在危险，对其安全性、有效性必须严格控制，因此，瓣膜材料的选材尤为重要，在满足瓣膜的基本功能要求外，必须首先满足植入体内的血液相容性要求。良好的血液相容性是心脏瓣膜材料的必要特性，通过体外血液实验研究表明：与316L和LTIC相比，POM具有疏水性，溶血率低，不会引起外源性和内源性凝血，具有与LTIC相近的血液相容性，可以作为植入器械植入人体。POM材料密度接近血液，血液流动过程中不会额外增加能量损失[14]。POM材料又具有良好的加工性能，双叶机械瓣膜瓣叶结构复杂，但可以通过模具注塑加工或者数控机床加工用于双叶机械心脏瓣膜的瓣叶，工艺相对简单，成本低，因此POM材料具有应用于双叶机械心脏瓣膜的潜力。
POM能够做为植入医疗器械材料，其本身具有良好的血液相容性，后续还可以采用表面接枝改性、引入生物活性分子、表面涂层等进一步改善POM表面的血液相容性，使其具有更好的生物相容性[15]。实际上应用POM作为瓣叶材料，还要包括了对材料其它性能如物理、机械性能、化学稳定性、毒性、加工成型性等方面的要求。本文仅研究其生物相容性，提出POM作为双叶心脏瓣膜的可能，在后续的实验中更应该考虑其疲劳耐磨以及综合性能，更需必要的动物实验和人体试验进行验证。
