为研究不同浓度(25、50、100 μg/mL)超顺磁性氧化铁粒子(SPIO)标记对大鼠骨髓间充质干细胞(rMSCs)生物学活性、体外MRI成像效应的影响,采用多聚赖氨酸(PLL)包被的SPIO (PLL-SPIO)标记原代分离培养的rMSCs,24 h后分别进行阳性标记率、MRI成像效应、细胞增殖凋亡以及干细胞细胞分化能力的综合评价。PLL-SPIO标记阳性率、铁含量测定结果显示:铁标记率可达75%~100%。透射电镜观察,可见100 μg/mL组rMSCs细胞质内浓聚细小铁颗粒的囊泡样包涵体。采用T1WI、T2WI和T2*WI序列MRI成像扫描显示:25 μg/mL组即可引起信号的明显降低。与未标记的对照组细胞相比,25 μg/mL和50 μg/mL组细胞增殖活力、凋亡、干细胞分化能力检测结果差异皆无统计学意义(P＞0.05),而100 μg/mL组的差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论:25、50 μg/mL SPIO可有效标记rMSCs,100 μg/mL的SPIO对rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用,这为SPIO进一步的体内及临床MRI分子影像应用提供了基础。
引用本文： 吕鑫, 聂永梅, 赵志伟, 何学令, 刘艳, 甫拉提·吐尔逊, 吴江. SPIO标记大鼠骨髓间充质干细胞:生物学活性及体外MRI成像效应评价. 生物医学工程学杂志, 2014, 31(2): 365-372. doi: 10.7507/1001-5515.20140069 复制
引言
近年来，随着科学技术的发展，分子生物学与现代医学影像技术相互结合，形成一门新兴的边缘学科--分子影像学(molecular imaging)[1]。目前,分子影像学主要包括核素成像、光学成像和磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)三大类。在这三类成像技术中，MRI以其三维采集成像、高分辨力、高对比等优势而备受关注。其中，对比剂的更新对MRI贡献颇大。对比剂的主要作用是改变靶组织的弛豫时间，增强与周围正常组织的对比，从而实现对疾病特性和种类的早期诊断。超顺磁性氧化铁(superparamagnetic oxide iron,SPIO) 是目前研究比较热门的一类MRI对比剂，它的有效成分是Fe3O4 晶体核心,被包以组织相溶物，包覆后的SPIO具有一定的超顺磁性、生物活性，能明显缩短周围组织的T2值，因而SPIO有望用于临床早期的分子影像诊断。但是，近期国内外的学者研究发现，SPIO在标记细胞的同时，也会对细胞增殖、分化能力等生物学活性产生一定的影响，且随标记浓度的不同而不同[2]。本实验以不同浓度的SPIO标记原代分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)，综合评价SPIO对rMSCs生物学活性及体外MRI成像效应的影响，为临床影像对比剂的进一步更新发展提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年SPF级SD大鼠，10只。雌雄不限，体质量(150±20)g，购自新疆医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂和仪器
SPIO(四川大学化学工程学院赵强教授合成提供)[3]。DMEM-L、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、双抗(Hyclone)；异丁基甲基黄嘌、CCK-8、吲哚美辛、胰岛素、茜素红、β-磷酸甘油、荧光标记抗大鼠单抗PE-CD45、FITC-CD90、PEcy5-CD29、TGF-β1、bFGF(Sigma)；AKP染色试剂盒、Ⅰ型胶原免疫组化试剂盒、Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒(南京建成)；NSE型胶原免疫组化试剂盒、凋亡试剂盒(武汉博士德)。
倒置相差显微镜(Olympus)，CO2培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(上海设备总厂)，超声清洗仪(Branson公司)，原子吸收分光光度计(北京第二光学仪器厂)，EPTCSXL-31240型流式细胞仪(Coulter公司)，离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)，3.0T核磁共振系统(GE公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 Brookhaven Zeta粒度分析仪检测SPIO粒径
用PBS进一步稀释SPIO、PLL-SPIO溶液，调整其浓度为25 μg/mL，将2 mL SPIO、PLL-SPIO 溶液加入Brookhaven Zeta粒度分析仪中的比色杯中进行有效粒径的检测。
1.3.2 rMSCs分离、培养及鉴定
按照文献及本课题组的方法获取原代rMSCs[4]，采用透射电镜、流式细胞术表面分子标记物CD45、CD90、CD29、分化诱导法等进行干细胞鉴定[3]。采用传代至第4代的rMSCs进行以下实验。
1.3.3 不同浓度SPIO标记rMSCs效果检测
(1) 不同浓度SPIO标记rMSCs：参考文献[5]方法，将SPIO(50、100、200 μg/mL)和1.5 μg/mL多聚赖氨酸(PLL)等体积混合，室温振荡60 min，最后铁、多聚赖氨酸终浓度分别为25、50、100 μg/mL和0.75 μg/mL。将上述溶液加入第4代rMSCs中,37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育24 h。实验分组：设置不同浓度(25、50、100 μg/mL)PLL-SPIO标记的rMSCs为实验组，同时设未标记rMSCs为对照组。
(2) 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察SPIO标记效果：选取各组细胞，吸掉细胞培养基，用PBS充分冲洗，去除细胞外铁，胰酶消化。离心后，戊二醛固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，修块、切片，枸橼酸铅染色，于透射电镜下观察SPIO粒子的大小和形态。
(3) 普鲁氏蓝染色：选取各组细胞，吸掉培养液，PBS漂洗3次，滴加4%多聚甲醛固定15 min。滴加酸性亚铁氢化钾溶液(2%亚铁氢化钾和2%HCl的体积比为1∶1)孵育30 min，水洗。显微镜下观察并拍照，统计铁染色阳性率。
(4) 细胞铁含量检测：选取各组细胞，吸掉细胞培养基，PBS冲洗细胞2次，胰酶消化细胞，收集实验组及对照组细胞(1×106)。将细胞放于干燥箱(80 ℃)2 h。后滴加150 μL浓HCl，常温过夜，接着将细胞放于干燥箱(60 ℃)2 h ，使SPIO颗粒表面葡聚糖近一步消化。滴加PBS稀释浓HCl 10倍，原子分光光度计测量铁含量。
(5) 不同浓度SPIO标记rMSCs体外MRI扫描：将各组SPIO标记细胞快速均匀溶于盛有1%琼脂糖的冷冻管中(A:1×106,B: 0.5×106,C:0.25×106,D:1.25×105,E:6.25×104)，待琼脂冷却凝固后，进行MRI扫描。采用3.0TMR，实验专用线圈。成像序列：① SE序列：T1WI，TR 400.00 ms，TE 15.0 ms，Bandwidth 20.83，NEX 2.0；② 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI，TR 4 500 ms，TE 100 ms，Bandwidth 21，NEX 2.0；③ 梯度回波序列(GRE)：T2*WI，TR 400 ms，TE 23.0 ms，Bandwidth 20.83，Fip Angle:15，NEX 2.0。采用3.0 TMRI自动测量系统，测量每种扫描序列图像上信号强度(signal intensity,SI)，计算每种序列信号强度衰减率(△SI)。△SI=(SPIO标记-SPIO未标记)/SPIO未标记×100%。
1.3.4
不同浓度SPIO对rMSCs生物活性影响
(1) rMSCs核形态学观察：选取各组细胞，吸弃培养液，PBS清洗3次； 4%多聚甲醛固定15 min，加入荧光染料DAPI/PI，37 ℃避光孵育1 h,激光共聚焦显微镜405nm/488nm观察。
(2) 细胞增殖能力检测：选取各组细胞，按细胞密度1×103/孔接种于96孔培养板中，置入于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验孔和对照孔每3天换液1次。此后每天固定时间，连续8天测定光吸收值(OD)。以SPIO浓度为横坐标，以各组8天测定光吸收值(OD)均数为纵坐标,绘制柱状图。
(3) 细胞周期测定：取各组细胞，胰酶消化制成单细胞悬液1×106/mL，缓慢加入1.5 mL 75%乙醇(预冷)4 ℃固定过夜，避光加入500 μl RNAse、碘化丙啶并染色30 min，流式细胞仪488 nm检测G0/G1期细胞占总细胞的百分率。
(4) TUNEL法检测细胞凋亡: 取各组细胞，用4%多聚甲醛室温固定15 min，3% H2O2室温处理10 min。滴加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20 μL，含TdT和DIG-d-UTP 各1 μL，37 ℃标记2 h。封闭液常温作用30 min，滴加生物素化抗地高辛抗体20 μL，37 ℃反应30 min。滴加SABC 20 μL，37 ℃反应30 min。DAB 显色，水洗。细胞核染为棕色为阳性细胞。在倒置显微镜下,应用Image Pro Plus 5.0专业图像分析软件，随机选取不同视野，计数阳性细胞，并得出细胞凋亡率。
(5) 透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态：取各组细胞，吸掉细胞培养基，用PBS充分冲洗，去除细胞外铁，胰酶消化。离心后，戊二醛固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，修块、切片，枸橼酸铅染色，电镜观察rMSCs形态。
1.3.5 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
选择第4代细胞，接种于3.5 cm培养皿，待细胞汇合率达到80%时，用25、50、 100 μg/mL SPIO孵育rMSCs 24 h后，分别进行细胞诱导分化实验：
(1) 内皮细胞分化诱导剂(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF) 14 d后进行vWF免疫组化染色。应用专业图像分析软件，随机选取不同视野，计数阳性细胞，并得出阳性细胞率。
(2) 成脂诱导(1×10-6mol/L地塞米松、5 mg/L胰岛素、1×10-4mol/L IBMX、6×10-7mol/L吲哚美辛)7 d后，进行油红O染色。
(3) 成骨诱导(1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/L β-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C)5、7、10、14 d后，按照碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒说明进行操作，于酶标仪520 nm波长处进行检测。AKP含量(金氏U/100mL)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×酚标准品浓度×100 mL。诱导21 d后进行茜素红染色，进行钙结个数和面积测量。
(4) 成软骨诱导(10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、1% ITS-A)14 d后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色；同时选取细胞样本进行EDTA、Ⅱ型胶原酶、木瓜蛋白酶消化，采用DMB比色法测定软骨细胞外糖胺聚糖(GAG)含量：按照试剂盒说明书制作硫酸软骨素标准曲线，根据曲线求得GAG浓度。GAG含量=GAG浓度×液体总量。
1.4 数据统计和结果分析
所有实验均重复3～4次。所有参数均采用SPSS 16.0统计软件包进行多个样本均数单因素方差分析(ANOVA)，并用q检验进行比较，P＜0.05代表有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度SPIO标记rMSCs效果检测
(1) 粒子形态和粒径分析: 透射电镜下，SPIO、PLL-SPIO呈单个分散，偶有聚集现象。核心Fe3O4呈晶体状，外部可见有机物质包裹，SPIO、PLL-SPIO之间均有相互连接现象(见图 1)。Brookhaven Zeta粒度分析仪检测SPIO粒径：SPIO、PLL-SPIO有效粒径分别为48、51 nm，分散度分别为0.3、0.4。
图1
透射电镜观测粒子形态
Figure1.
TEM observation of the particle morphology
SPIO标记rMSCs结果，可见各浓度组细胞胞质内囊泡样包涵体增多，包涵体内有浓聚细小的铁颗粒，呈圆形或椭圆形，电子密度较高，相对独立，与胞核和胞质隔离(25 μg/mL组见图 2a)。
图2
SPIO标记rMSCs结果检测
(a): 25
(a) TEM photo of 25
(2) 普鲁氏蓝染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞胞质内均存在蓝色颗粒，且颜色依次加深，标记率分别为75%、97%、100%，与对照组比较以及组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)(25μg/mL组见图 2b)。
(3) 细胞铁含量的检测：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞内铁含量分别为(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/细胞，与对照组(0.4±0.07) pg/细胞比较以及组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
(4) 不同浓度SPIO标记rMSCs体外MRI扫描：MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信号均呈低信号：其中，扫描1×106细胞，T1WI、T2WI和T2*WI序列信号分别降低47.9%±9.1%、67.3%±8.4%、82.5%±5.6%(25 μg/mL组)；51.2%±7.9%、71.2%±9.1%、83.6%±2.5%(50 μg/mL组)；57.5%±3.4%、74.7%±5.6%、86.3%±8.2%(100 μg/mL组)。25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组信号平均降低65.6%±7.9%、70.2%±0.8%、72.7%±10.3%。以上说明25 μg/mL组就可以明显引起信号改变，与50 μg/mL组、100 μg/mL组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(见表 1、图 3)。
表1
T1WI、T2WI及T2*WI序列冠状位图像各管底部SI值(
图3
SPIO标记rMSCs体外MRI扫描图像
Ⅰ：对照组；Ⅱ：100
Ⅰ：Control； Ⅱ：100
2.2 不同浓度SPIO对rMSCs生物活性影响
(1) 激光共聚焦观察rMSCs核形态学变化：25 μg/mL组和50 μg/mL组细胞均没有发生明显凋亡，100 μg/mL组rMSCs发生明显凋亡，细胞核高度浓缩，体积变小，部分发生裂解(见图 4)。
图4
激光共聚焦检测SPIO标记rMSCs核形态学改变
箭头所指为核凋亡现象
Figure4. Nuclear morphological changes of SPIO labeled rMSCs by laser confocal detectionarrows indicate the phenomenon of nuclear apoptosis
(2) 细胞增殖能力检测：25 μg/mL组和50 μg/mL组rMSCs OD平均值分别为0.52±0.25和0.51±0.26，与未标记细胞(0.54±0.16)间差异无统计学意义(P＞0.05)。100 μg/mL组rMSCs OD值为0.44±0.22，与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05) 。
(3) 流式细胞仪检测细胞周期：25 μg/mL组和50 μg/mL组rMSCs分别有61.1%±9.1%、69.8%±4.1%处于G0/G1期，与未标记细胞(66.1%±4.5%)间差异无统计学意义(P＞0.05)。100 μg/mL组rMSCs有80.1%±1.4%处于G0/G1期，与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。
(4) TUNEL法检测细胞凋亡: 25、50 、100 μg/mL组rMSCs细胞凋亡个数分别为6.0±1.0、8.0±1.0、17.3±1.5，仅100 μg/mL组细胞凋亡个数与对照组(5.0±2.0)差异有统计学意义(P＜0.05)。
(5) 透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态:仅100 μg/mL组rMSCs细胞形态较对照组细胞发生明显改变，表现为细胞体积变小，胞膜皱褶消失，胞质浓缩，细胞器密集，散在包涵物，细胞核有不同程度的凋亡现象：胞核异染色质增多，且高度盘绕，部分细胞核染色体有裂解现象(见图 5)。
图5
透射电镜观察SPIO标记rMSCs细胞形态(5 600×)
Figure5.
TEM observation of SPIO labeled rMSCs(5 600 ×)
2.3 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
(1) 分化诱导(SPIO标记)：① 油红O染色：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组阳性细胞数较多，细胞体积较大，胞质内充满大量串珠状脂滴。100 μg/mL组阳性细胞数明显减少，细胞不同程度萎缩，胞质内脂滴也明显减少。② 茜素红染色：对照组、25 μg/mL组 、50 μg/mL组细胞形成大量红色钙结节,结节直径可达496 μm; 100 μg/mL组细胞钙结节形成明显减少，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。③ Ⅱ型胶原免疫组化：诱导14 d后，对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组细胞Ⅱ型胶原表达均为阳性，但对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组为强阳性，经灰度值半定量分析，100 μg/mL组与其它三组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。④ vWF型胶原免疫组化：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL 组阳性细胞率分别为78%、76%、73%，100 μg/mL组阳性细胞率(51%)显著低于前三组(P＜0.05)(见图 6)。
图6
SPIO标记rMSCs分化诱导染色结果(200×)
油红O染色: (a)对照组,(b) 25
Oil red O staining: (a) control,(b) 25
(2) AKP测定：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组AKP值分别为2.9±0.01、2.6±0.017、2.2±0.22、1.9±0.47。100 μg/mL组显著低于对照组(P＜0.05)(见表 2)。
表2
各组rMSCs AKP测定OD值(±s,n=7)
Table2.
OD value of AKP in rMSCs (±s,n=7)
3 讨论
3.1 不同浓度SPIO标记rMSCs的效果分析
SPIO有效成分是Fe3O4 晶体核心,被包以葡聚糖右旋糖酐或其他物质，包覆后的SPIO具有一定的超顺磁性、生物活性，能明显缩短周围组织的T2值，因此它是目前研究比较热门的一类MRI对比剂，但是SPIO颗粒带有负电荷，会与细胞膜发生排斥，影响标记率[5]。目前，在临床试验上多采用聚阳离子转染剂、脂质体、受体介导等方法对氧化铁进行修饰来提高标记率[6]。本实验采用0.75 μg/mL PLL包被SPIO，中和SPIO表面负电荷，来提高标记率。结果发现，普鲁氏蓝染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组SPIO标记率分别为75%、97%、100%。细胞铁含量的检测：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞铁含量分别为(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/cell。透射电镜观察SPIO标记rMSCs：胞质内见许多囊泡样包涵体，且随SPIO浓度的增加而增加。这与Barczewska等[7]的研究结果一致。尽管SPIO 颗粒具有很好的细胞相容性和生物可利用度，但是由于其带有负电荷，而rMSCs细胞膜表面也带有负电荷，两者可能互相排斥，所以往往导致SPIO 颗粒标记率较低。我们采用带正电荷的PLL生物化SPIO 颗粒表面，形成复合物PLL-SPIO，更有利于rMSCs的内吞，进而达到干细胞的有效标记。综合本实验结果可见，通过使用PLL包被SPIO来提高标记率，是有效的。
为能进一步检测出MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列对不同浓度SPIO标记细胞具体的成像差异，我们将含SPIO细胞均匀溶解在琼脂糖中行MRI扫描。结果显示，MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信号均呈低信号：其中，扫描相同浓度标记细胞，T2*WI序列信号降低最明显；25 μg/mL组就可以明显引起信号改变，与50 μg/mL组、100 μg/mL组差异无统计学意义。这与谭延斌等[8]对SPIO标记血管内皮细胞MRI效应相关性的研究是一致的。Hu等[9]采用7、14、28、56 μg/mL浓度的SPIO标记MSCs后进行示踪，发现各浓度组可有效标记细胞，且MRI扫描结果显示体内动物脊髓损伤处T2弛豫信号降低。可见，适宜浓度SPIO标记细胞是可行的。
3.2 不同浓度SPIO对rMSCs生物学活性影响
SPIO由于具有典型的晶体结构,被包以组织相容物，所以具有其他对比剂无可比拟的超顺磁性及组织细胞相容性。但是，SPIO在标记细胞的同时，也会对细胞产生一定的生物学影响[10]。本部分实验就以不同负荷浓度的SPIO标记细胞，透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态，仅100 μg/mL组rMSCs细胞形态较对照组细胞发生明显改变，表现为胞核异染色质增多，且高度盘绕，部分细胞核染色体有裂解现象。细胞增殖能力检测：仅100 μg/mL组rMSCs OD值与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL法检测细胞凋亡: 仅100 μg/mL组rMSC细胞凋亡个数与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。刘佳等[11]发现，当SPIO浓度为25 μg/mL,MSCs细胞增殖能力没有明显改变，当SPIO浓度为75 μg/mL时,细胞增殖能力明显减弱。提示高浓度的SPIO标记干细胞时，对细胞生物学活性是有一定影响的。
3.3 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
MSCs主要存在于骨髓基质中,属于成体干细胞，具有多项分化能力，可分化为神经元和神经胶质细胞、成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。MSCs在组织再生、药物生物控释方面处于不可替代的重要地位，然而干细胞进行相关应用时究竟在体内的转归如何，这值得我们深入探讨。目前，分子影像技术可实时、动态地观察细胞或分子在体内的影像变化，在干细胞示踪方面发挥着重要作用。SPIO在标记细胞的同时，是否会影响细胞分化能力，成为干细胞体内转归研究的一个重点。本实验对SPIO标记的rMSCs进行成骨、成脂、成软骨、成内皮多向分化诱导，结果发现，25 μg/mL、50 μg/mL浓度标记时，rMSCs的各向分化能力未受影响，仅100 μg/mL组rMSCs分化能力明显减弱(P＜0.05)。Reddy等[12]采用壳聚糖修饰SPIO (Chitosan-SPIO)标记MSCs，发现浓度增加至200 μg/mL时，Chitosan-SPIO对细胞体外迁移和分化能力都无明显影响。与本研究结果不一致的原因，可能与壳聚糖的修饰有关。
综上，本研究采用不同浓度的SPIO 标记rMSCs，发现25 μg/mL和50 μg/mL浓度的PLL-SPIO可有效标记rMSCs，100 μg/mL浓度的PLL-SPIO对rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用。本实验采用美国FDA已经批准使用的"生物化"物质，制备PLL-SPIO复合物，既能提高rMSCs的标记率，也不影响细胞增殖和分化活性，这为SPIO进一步的临床MRI分子影像应用提供了实验依据。然而，干细胞体内示踪涉及到细胞在体内的再循环，其体内外的运动迁徙能力以及体内细胞转归如何仍需我们进一步深入研究。
引言
近年来，随着科学技术的发展，分子生物学与现代医学影像技术相互结合，形成一门新兴的边缘学科--分子影像学(molecular imaging)[1]。目前,分子影像学主要包括核素成像、光学成像和磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)三大类。在这三类成像技术中，MRI以其三维采集成像、高分辨力、高对比等优势而备受关注。其中，对比剂的更新对MRI贡献颇大。对比剂的主要作用是改变靶组织的弛豫时间，增强与周围正常组织的对比，从而实现对疾病特性和种类的早期诊断。超顺磁性氧化铁(superparamagnetic oxide iron,SPIO) 是目前研究比较热门的一类MRI对比剂，它的有效成分是Fe3O4 晶体核心,被包以组织相溶物，包覆后的SPIO具有一定的超顺磁性、生物活性，能明显缩短周围组织的T2值，因而SPIO有望用于临床早期的分子影像诊断。但是，近期国内外的学者研究发现，SPIO在标记细胞的同时，也会对细胞增殖、分化能力等生物学活性产生一定的影响，且随标记浓度的不同而不同[2]。本实验以不同浓度的SPIO标记原代分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells,rMSCs)，综合评价SPIO对rMSCs生物学活性及体外MRI成像效应的影响，为临床影像对比剂的进一步更新发展提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
成年SPF级SD大鼠，10只。雌雄不限，体质量(150±20)g，购自新疆医科大学实验动物中心。
1.2 主要试剂和仪器
SPIO(四川大学化学工程学院赵强教授合成提供)[3]。DMEM-L、PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、双抗(Hyclone)；异丁基甲基黄嘌、CCK-8、吲哚美辛、胰岛素、茜素红、β-磷酸甘油、荧光标记抗大鼠单抗PE-CD45、FITC-CD90、PEcy5-CD29、TGF-β1、bFGF(Sigma)；AKP染色试剂盒、Ⅰ型胶原免疫组化试剂盒、Ⅱ型胶原免疫组化试剂盒(南京建成)；NSE型胶原免疫组化试剂盒、凋亡试剂盒(武汉博士德)。
倒置相差显微镜(Olympus)，CO2培养箱(美国Thermo公司)，超净工作台(上海设备总厂)，超声清洗仪(Branson公司)，原子吸收分光光度计(北京第二光学仪器厂)，EPTCSXL-31240型流式细胞仪(Coulter公司)，离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)，3.0T核磁共振系统(GE公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 Brookhaven Zeta粒度分析仪检测SPIO粒径
用PBS进一步稀释SPIO、PLL-SPIO溶液，调整其浓度为25 μg/mL，将2 mL SPIO、PLL-SPIO 溶液加入Brookhaven Zeta粒度分析仪中的比色杯中进行有效粒径的检测。
1.3.2 rMSCs分离、培养及鉴定
按照文献及本课题组的方法获取原代rMSCs[4]，采用透射电镜、流式细胞术表面分子标记物CD45、CD90、CD29、分化诱导法等进行干细胞鉴定[3]。采用传代至第4代的rMSCs进行以下实验。
1.3.3 不同浓度SPIO标记rMSCs效果检测
(1) 不同浓度SPIO标记rMSCs：参考文献[5]方法，将SPIO(50、100、200 μg/mL)和1.5 μg/mL多聚赖氨酸(PLL)等体积混合，室温振荡60 min，最后铁、多聚赖氨酸终浓度分别为25、50、100 μg/mL和0.75 μg/mL。将上述溶液加入第4代rMSCs中,37 ℃、体积分数5% CO2条件下孵育24 h。实验分组：设置不同浓度(25、50、100 μg/mL)PLL-SPIO标记的rMSCs为实验组，同时设未标记rMSCs为对照组。
(2) 透射电镜(transmission electron microscope,TEM)观察SPIO标记效果：选取各组细胞，吸掉细胞培养基，用PBS充分冲洗，去除细胞外铁，胰酶消化。离心后，戊二醛固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，修块、切片，枸橼酸铅染色，于透射电镜下观察SPIO粒子的大小和形态。
(3) 普鲁氏蓝染色：选取各组细胞，吸掉培养液，PBS漂洗3次，滴加4%多聚甲醛固定15 min。滴加酸性亚铁氢化钾溶液(2%亚铁氢化钾和2%HCl的体积比为1∶1)孵育30 min，水洗。显微镜下观察并拍照，统计铁染色阳性率。
(4) 细胞铁含量检测：选取各组细胞，吸掉细胞培养基，PBS冲洗细胞2次，胰酶消化细胞，收集实验组及对照组细胞(1×106)。将细胞放于干燥箱(80 ℃)2 h。后滴加150 μL浓HCl，常温过夜，接着将细胞放于干燥箱(60 ℃)2 h ，使SPIO颗粒表面葡聚糖近一步消化。滴加PBS稀释浓HCl 10倍，原子分光光度计测量铁含量。
(5) 不同浓度SPIO标记rMSCs体外MRI扫描：将各组SPIO标记细胞快速均匀溶于盛有1%琼脂糖的冷冻管中(A:1×106,B: 0.5×106,C:0.25×106,D:1.25×105,E:6.25×104)，待琼脂冷却凝固后，进行MRI扫描。采用3.0TMR，实验专用线圈。成像序列：① SE序列：T1WI，TR 400.00 ms，TE 15.0 ms，Bandwidth 20.83，NEX 2.0；② 快速自旋回波(FSE)序列：T2WI，TR 4 500 ms，TE 100 ms，Bandwidth 21，NEX 2.0；③ 梯度回波序列(GRE)：T2*WI，TR 400 ms，TE 23.0 ms，Bandwidth 20.83，Fip Angle:15，NEX 2.0。采用3.0 TMRI自动测量系统，测量每种扫描序列图像上信号强度(signal intensity,SI)，计算每种序列信号强度衰减率(△SI)。△SI=(SPIO标记-SPIO未标记)/SPIO未标记×100%。
1.3.4
不同浓度SPIO对rMSCs生物活性影响
(1) rMSCs核形态学观察：选取各组细胞，吸弃培养液，PBS清洗3次； 4%多聚甲醛固定15 min，加入荧光染料DAPI/PI，37 ℃避光孵育1 h,激光共聚焦显微镜405nm/488nm观察。
(2) 细胞增殖能力检测：选取各组细胞，按细胞密度1×103/孔接种于96孔培养板中，置入于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验孔和对照孔每3天换液1次。此后每天固定时间，连续8天测定光吸收值(OD)。以SPIO浓度为横坐标，以各组8天测定光吸收值(OD)均数为纵坐标,绘制柱状图。
(3) 细胞周期测定：取各组细胞，胰酶消化制成单细胞悬液1×106/mL，缓慢加入1.5 mL 75%乙醇(预冷)4 ℃固定过夜，避光加入500 μl RNAse、碘化丙啶并染色30 min，流式细胞仪488 nm检测G0/G1期细胞占总细胞的百分率。
(4) TUNEL法检测细胞凋亡: 取各组细胞，用4%多聚甲醛室温固定15 min，3% H2O2室温处理10 min。滴加标记缓冲液(Labeling Buffer) 20 μL，含TdT和DIG-d-UTP 各1 μL，37 ℃标记2 h。封闭液常温作用30 min，滴加生物素化抗地高辛抗体20 μL，37 ℃反应30 min。滴加SABC 20 μL，37 ℃反应30 min。DAB 显色，水洗。细胞核染为棕色为阳性细胞。在倒置显微镜下,应用Image Pro Plus 5.0专业图像分析软件，随机选取不同视野，计数阳性细胞，并得出细胞凋亡率。
(5) 透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态：取各组细胞，吸掉细胞培养基，用PBS充分冲洗，去除细胞外铁，胰酶消化。离心后，戊二醛固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，修块、切片，枸橼酸铅染色，电镜观察rMSCs形态。
1.3.5 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
选择第4代细胞，接种于3.5 cm培养皿，待细胞汇合率达到80%时，用25、50、 100 μg/mL SPIO孵育rMSCs 24 h后，分别进行细胞诱导分化实验：
(1) 内皮细胞分化诱导剂(10 ng/mL VEGF、2 ng/mL bFGF) 14 d后进行vWF免疫组化染色。应用专业图像分析软件，随机选取不同视野，计数阳性细胞，并得出阳性细胞率。
(2) 成脂诱导(1×10-6mol/L地塞米松、5 mg/L胰岛素、1×10-4mol/L IBMX、6×10-7mol/L吲哚美辛)7 d后，进行油红O染色。
(3) 成骨诱导(1×10-7mol/L地塞米松、1×10-2mol/L β-甘油磷酸钠、50mg/L维生素C)5、7、10、14 d后，按照碱性磷酸酶(AKP)检测试剂盒说明进行操作，于酶标仪520 nm波长处进行检测。AKP含量(金氏U/100mL)=(测定管吸光度/标准管吸光度)×酚标准品浓度×100 mL。诱导21 d后进行茜素红染色，进行钙结个数和面积测量。
(4) 成软骨诱导(10 ng/mL TGF-β1、1×10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、1% ITS-A)14 d后进行Ⅱ型胶原免疫组化染色；同时选取细胞样本进行EDTA、Ⅱ型胶原酶、木瓜蛋白酶消化，采用DMB比色法测定软骨细胞外糖胺聚糖(GAG)含量：按照试剂盒说明书制作硫酸软骨素标准曲线，根据曲线求得GAG浓度。GAG含量=GAG浓度×液体总量。
1.4 数据统计和结果分析
所有实验均重复3～4次。所有参数均采用SPSS 16.0统计软件包进行多个样本均数单因素方差分析(ANOVA)，并用q检验进行比较，P＜0.05代表有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度SPIO标记rMSCs效果检测
(1) 粒子形态和粒径分析: 透射电镜下，SPIO、PLL-SPIO呈单个分散，偶有聚集现象。核心Fe3O4呈晶体状，外部可见有机物质包裹，SPIO、PLL-SPIO之间均有相互连接现象(见图 1)。Brookhaven Zeta粒度分析仪检测SPIO粒径：SPIO、PLL-SPIO有效粒径分别为48、51 nm，分散度分别为0.3、0.4。
图1
透射电镜观测粒子形态
Figure1.
TEM observation of the particle morphology
SPIO标记rMSCs结果，可见各浓度组细胞胞质内囊泡样包涵体增多，包涵体内有浓聚细小的铁颗粒，呈圆形或椭圆形，电子密度较高，相对独立，与胞核和胞质隔离(25 μg/mL组见图 2a)。
图2
SPIO标记rMSCs结果检测
(a): 25
(a) TEM photo of 25
(2) 普鲁氏蓝染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞胞质内均存在蓝色颗粒，且颜色依次加深，标记率分别为75%、97%、100%，与对照组比较以及组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)(25μg/mL组见图 2b)。
(3) 细胞铁含量的检测：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞内铁含量分别为(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/细胞，与对照组(0.4±0.07) pg/细胞比较以及组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。
(4) 不同浓度SPIO标记rMSCs体外MRI扫描：MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信号均呈低信号：其中，扫描1×106细胞，T1WI、T2WI和T2*WI序列信号分别降低47.9%±9.1%、67.3%±8.4%、82.5%±5.6%(25 μg/mL组)；51.2%±7.9%、71.2%±9.1%、83.6%±2.5%(50 μg/mL组)；57.5%±3.4%、74.7%±5.6%、86.3%±8.2%(100 μg/mL组)。25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组信号平均降低65.6%±7.9%、70.2%±0.8%、72.7%±10.3%。以上说明25 μg/mL组就可以明显引起信号改变，与50 μg/mL组、100 μg/mL组比较差异无统计学意义(P＞0.05)(见表 1、图 3)。
表1
T1WI、T2WI及T2*WI序列冠状位图像各管底部SI值(
图3
SPIO标记rMSCs体外MRI扫描图像
Ⅰ：对照组；Ⅱ：100
Ⅰ：Control； Ⅱ：100
2.2 不同浓度SPIO对rMSCs生物活性影响
(1) 激光共聚焦观察rMSCs核形态学变化：25 μg/mL组和50 μg/mL组细胞均没有发生明显凋亡，100 μg/mL组rMSCs发生明显凋亡，细胞核高度浓缩，体积变小，部分发生裂解(见图 4)。
图4
激光共聚焦检测SPIO标记rMSCs核形态学改变
箭头所指为核凋亡现象
Figure4. Nuclear morphological changes of SPIO labeled rMSCs by laser confocal detectionarrows indicate the phenomenon of nuclear apoptosis
(2) 细胞增殖能力检测：25 μg/mL组和50 μg/mL组rMSCs OD平均值分别为0.52±0.25和0.51±0.26，与未标记细胞(0.54±0.16)间差异无统计学意义(P＞0.05)。100 μg/mL组rMSCs OD值为0.44±0.22，与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05) 。
(3) 流式细胞仪检测细胞周期：25 μg/mL组和50 μg/mL组rMSCs分别有61.1%±9.1%、69.8%±4.1%处于G0/G1期，与未标记细胞(66.1%±4.5%)间差异无统计学意义(P＞0.05)。100 μg/mL组rMSCs有80.1%±1.4%处于G0/G1期，与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。
(4) TUNEL法检测细胞凋亡: 25、50 、100 μg/mL组rMSCs细胞凋亡个数分别为6.0±1.0、8.0±1.0、17.3±1.5，仅100 μg/mL组细胞凋亡个数与对照组(5.0±2.0)差异有统计学意义(P＜0.05)。
(5) 透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态:仅100 μg/mL组rMSCs细胞形态较对照组细胞发生明显改变，表现为细胞体积变小，胞膜皱褶消失，胞质浓缩，细胞器密集，散在包涵物，细胞核有不同程度的凋亡现象：胞核异染色质增多，且高度盘绕，部分细胞核染色体有裂解现象(见图 5)。
图5
透射电镜观察SPIO标记rMSCs细胞形态(5 600×)
Figure5.
TEM observation of SPIO labeled rMSCs(5 600 ×)
2.3 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
(1) 分化诱导(SPIO标记)：① 油红O染色：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组阳性细胞数较多，细胞体积较大，胞质内充满大量串珠状脂滴。100 μg/mL组阳性细胞数明显减少，细胞不同程度萎缩，胞质内脂滴也明显减少。② 茜素红染色：对照组、25 μg/mL组 、50 μg/mL组细胞形成大量红色钙结节,结节直径可达496 μm; 100 μg/mL组细胞钙结节形成明显减少，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。③ Ⅱ型胶原免疫组化：诱导14 d后，对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组细胞Ⅱ型胶原表达均为阳性，但对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组为强阳性，经灰度值半定量分析，100 μg/mL组与其它三组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。④ vWF型胶原免疫组化：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL 组阳性细胞率分别为78%、76%、73%，100 μg/mL组阳性细胞率(51%)显著低于前三组(P＜0.05)(见图 6)。
图6
SPIO标记rMSCs分化诱导染色结果(200×)
油红O染色: (a)对照组,(b) 25
Oil red O staining: (a) control,(b) 25
(2) AKP测定：对照组、25 μg/mL组、50 μg/mL组、100 μg/mL组AKP值分别为2.9±0.01、2.6±0.017、2.2±0.22、1.9±0.47。100 μg/mL组显著低于对照组(P＜0.05)(见表 2)。
表2
各组rMSCs AKP测定OD值(±s,n=7)
Table2.
OD value of AKP in rMSCs (±s,n=7)
3 讨论
3.1 不同浓度SPIO标记rMSCs的效果分析
SPIO有效成分是Fe3O4 晶体核心,被包以葡聚糖右旋糖酐或其他物质，包覆后的SPIO具有一定的超顺磁性、生物活性，能明显缩短周围组织的T2值，因此它是目前研究比较热门的一类MRI对比剂，但是SPIO颗粒带有负电荷，会与细胞膜发生排斥，影响标记率[5]。目前，在临床试验上多采用聚阳离子转染剂、脂质体、受体介导等方法对氧化铁进行修饰来提高标记率[6]。本实验采用0.75 μg/mL PLL包被SPIO，中和SPIO表面负电荷，来提高标记率。结果发现，普鲁氏蓝染色：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组SPIO标记率分别为75%、97%、100%。细胞铁含量的检测：25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL组细胞铁含量分别为(14.4±1.05)、(17.7±0.36)、(20.4±0.97) pg/cell。透射电镜观察SPIO标记rMSCs：胞质内见许多囊泡样包涵体，且随SPIO浓度的增加而增加。这与Barczewska等[7]的研究结果一致。尽管SPIO 颗粒具有很好的细胞相容性和生物可利用度，但是由于其带有负电荷，而rMSCs细胞膜表面也带有负电荷，两者可能互相排斥，所以往往导致SPIO 颗粒标记率较低。我们采用带正电荷的PLL生物化SPIO 颗粒表面，形成复合物PLL-SPIO，更有利于rMSCs的内吞，进而达到干细胞的有效标记。综合本实验结果可见，通过使用PLL包被SPIO来提高标记率，是有效的。
为能进一步检测出MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列对不同浓度SPIO标记细胞具体的成像差异，我们将含SPIO细胞均匀溶解在琼脂糖中行MRI扫描。结果显示，MRI(T1WI、T2WI和T2*WI)序列信号均呈低信号：其中，扫描相同浓度标记细胞，T2*WI序列信号降低最明显；25 μg/mL组就可以明显引起信号改变，与50 μg/mL组、100 μg/mL组差异无统计学意义。这与谭延斌等[8]对SPIO标记血管内皮细胞MRI效应相关性的研究是一致的。Hu等[9]采用7、14、28、56 μg/mL浓度的SPIO标记MSCs后进行示踪，发现各浓度组可有效标记细胞，且MRI扫描结果显示体内动物脊髓损伤处T2弛豫信号降低。可见，适宜浓度SPIO标记细胞是可行的。
3.2 不同浓度SPIO对rMSCs生物学活性影响
SPIO由于具有典型的晶体结构,被包以组织相容物，所以具有其他对比剂无可比拟的超顺磁性及组织细胞相容性。但是，SPIO在标记细胞的同时，也会对细胞产生一定的生物学影响[10]。本部分实验就以不同负荷浓度的SPIO标记细胞，透射电镜观察SPIO标记rMSCs形态，仅100 μg/mL组rMSCs细胞形态较对照组细胞发生明显改变，表现为胞核异染色质增多，且高度盘绕，部分细胞核染色体有裂解现象。细胞增殖能力检测：仅100 μg/mL组rMSCs OD值与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。TUNEL法检测细胞凋亡: 仅100 μg/mL组rMSC细胞凋亡个数与未标记细胞间差异有统计学意义(P＜0.05)。刘佳等[11]发现，当SPIO浓度为25 μg/mL,MSCs细胞增殖能力没有明显改变，当SPIO浓度为75 μg/mL时,细胞增殖能力明显减弱。提示高浓度的SPIO标记干细胞时，对细胞生物学活性是有一定影响的。
3.3 不同浓度SPIO对rMSCs分化能力影响
MSCs主要存在于骨髓基质中,属于成体干细胞，具有多项分化能力，可分化为神经元和神经胶质细胞、成骨细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。MSCs在组织再生、药物生物控释方面处于不可替代的重要地位，然而干细胞进行相关应用时究竟在体内的转归如何，这值得我们深入探讨。目前，分子影像技术可实时、动态地观察细胞或分子在体内的影像变化，在干细胞示踪方面发挥着重要作用。SPIO在标记细胞的同时，是否会影响细胞分化能力，成为干细胞体内转归研究的一个重点。本实验对SPIO标记的rMSCs进行成骨、成脂、成软骨、成内皮多向分化诱导，结果发现，25 μg/mL、50 μg/mL浓度标记时，rMSCs的各向分化能力未受影响，仅100 μg/mL组rMSCs分化能力明显减弱(P＜0.05)。Reddy等[12]采用壳聚糖修饰SPIO (Chitosan-SPIO)标记MSCs，发现浓度增加至200 μg/mL时，Chitosan-SPIO对细胞体外迁移和分化能力都无明显影响。与本研究结果不一致的原因，可能与壳聚糖的修饰有关。
综上，本研究采用不同浓度的SPIO 标记rMSCs，发现25 μg/mL和50 μg/mL浓度的PLL-SPIO可有效标记rMSCs，100 μg/mL浓度的PLL-SPIO对rMSCs增殖活性和分化能力有抑制作用。本实验采用美国FDA已经批准使用的"生物化"物质，制备PLL-SPIO复合物，既能提高rMSCs的标记率，也不影响细胞增殖和分化活性，这为SPIO进一步的临床MRI分子影像应用提供了实验依据。然而，干细胞体内示踪涉及到细胞在体内的再循环，其体内外的运动迁徙能力以及体内细胞转归如何仍需我们进一步深入研究。
